專利名稱：基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發酵方法
技術領域：
本發明涉及某些基因修飾酵母物種。
背景技術：
因為全世界石油和天然氣原料的逐漸耗盡，部分石油進口國希望減小對外國石油資源的依賴，并希望建立經濟的更加可持續的基礎，所以大量努力正致力于從替代原料產生燃料和有機化學制劑和塑料。發酵方法提供了從天然存在的糖源產生多種燃料和化學制劑的可能性。例如，通過發酵葡萄糖大量產生乙醇，最通常葡萄糖通過水解玉米淀粉得到。一種酵母物種啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)是將葡萄糖發酵成乙醇的最常用的生物催化劑。這些糖代表相對昂貴的碳源。生物量(biomass)，即植物物質水解產物提供了尤其廉價的碳源的可能性。生物量主要由纖維素和半纖維素組成。纖維素可以分解成己糖，通常是葡萄糖。多數酵母，包括啤酒糖酵母，十分有效地代謝己糖。另一方面，半纖維素富含戊糖，如木糖，因此有效的碳利用需要這些戊糖也被代謝。非常少的酵母將木糖有效代謝成乙醇或者其他希望的發酵產物。因此，為了利用使用生物量碳源提供的全部經濟潛力，必需提供可以有效將木糖轉化成所希望的發酵產物的生物催化劑。多種細菌能夠將木糖代謝成發酵產物，但是這些細菌通常產生產物混合物，而不是通常所希望的一種主要產物。常見副產物有時對于細菌是有毒的。盡管某些細菌已經經代謝工程改造以進行高乙醇(homoethanolic)發酵，但是細菌傾向于在木素纖維素水解產物的苛刻環境下低效進行，其中木素纖維素水解產物是富含木糖的底物的通常來源。公知某些酵母物種如啤酒糖酵母將己糖主要發酵成乙醇，而不是細菌通常產生的產物混合物。某些酵母具有其他特征，其使得它們是多種類型發酵方法的良好候選者，所述特征為諸如對低PH環境的抗性、對某些發酵共同產物如乙酸和糠醛的抗性，和對乙醇自身的抗性。多數酵母物種通過復雜途徑代謝木糖(如果代謝的話)，其中通過木糖還原酶(XR)首先將木糖還原成木糖醇。然后通過木糖醇脫氫酶(XDH)將木糖醇氧化成木酮糖。然后通過XK酶磷酸化木酮糖。該途徑在酵母物種中無效率地運行，因為其在細胞中產生氧化還原不平衡。木糖到木糖醇步驟使用NADH作為輔因子，而木糖醇到木酮糖步驟使用NADPH作為輔因子。必須運行其他過程以恢復細胞內的氧化還原不平衡。這通常意味著生物在木糖或其他戊糖上不能厭氧生長。
然而，已經試圖向酵母物種如啤酒糖酵母中導入外源XR和XDH基因以實現木糖向乙醇的轉化。見，例如，美國專利號5，866，382、W095/13362和W097/42307。該工程改造的酵母不能有效產生乙醇。其他生物可以將木糖異構化成木酮糖然后將木酮糖磷酸化成木酮糖5-磷酸，其然后通過細胞的中心碳途徑進一步代謝。通過催化酶木糖異構酶(XI)促進異構化，并通過木酮糖激酶(HO催化磷酸化。該途徑在細菌中是常見的，但是在真核物種如酵母中相對罕見。它不產生木糖至木糖醇至木酮糖途徑中的氧化還原不平衡，從而原則上是更有效的厭氧機制。公知一種厭氧真菌Piromyces sp. E2 (ATCC76762)具有表達活性XI酶的基因。然而，沒有野生型或者重組酵母物種能夠從木糖或者其他戊糖原料有效產生所希望的發酵產物。將Piromyces sp. E2XI基因導入啤酒糖酵母的嘗試導致在木糖上的非常緩慢的生長并且不導致所報導的乙醇生產。見Kuyper等人，“High-LevelFunctional Expression of a Fungal Xylose Isomerase The Key to Efficient Ethanolic Fermentation of Xylose by Saccharomyces Cerevisiae ”， FEMS YeastResearchl574 (2003) 1-10，和 W003/062430A1。因此非常希望可以將木糖和其他戊糖有效發酵成所希望的發酵產物的酵母物種。

發明內容
一方面，本發明是具有功能性外源木糖異構酶基因的基因修飾酵母細胞，其中外源木糖異構酶基因可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列，且修飾的酵母細胞還具有天然基因的缺失或破壞，所述天然基因編碼催化木糖向木糖醇轉化的酶。第二方面，本發明是基因組中整合了功能性外源木糖異構酶基因的克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)或者假絲酵母屬(Candida)的基因修飾酵母細胞,其中外源木糖異構酶基因可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列。
另一方面，本發明是具有功能性外源木糖異構酶基因的基因修飾酵母細胞，其中外源木糖異構酶基因可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列，并且所述細胞還含有可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列的功能性外源木酮糖激酶基因。再一方面，本發明是基因修飾酵母細胞，其具有功能性天然基因的缺失或破壞，所述天然基因產生催化木糖醇向木酮糖或者木酮糖向木糖醇的反應的酶。另一方面，本發明是基因修飾酵母細胞，其具有天然基因的缺失或破壞，所述天然基因產生催化木糖向木糖醇轉化的酶。再一方面，本發明是發酵方法，其中在發酵條件下在包括戊糖的發酵液體培養基中培養任意前面方面的細胞。


圖I是描繪pNC2質粒的圖。 圖2是描繪pNC4質粒的圖。圖3是描繪pVR22質粒的圖。圖4是描繪pVR29質粒的圖。
圖5是描繪pBH5a和pBH5b質粒的圖。圖6是描繪從質粒PVR73和pVR77裝配的pVR78質粒的圖。圖7是描繪pCM3質粒的圖。圖8是描繪pPSl質粒的圖。圖9是描繪pCM9質粒的圖。圖10是描繪pCM17質粒的圖。圖11是描繪pCM14質粒的圖。圖12是描繪pCM28質粒的圖。
圖13是描繪pVR95質粒的圖。圖14a和14b是描繪pCM18和pCM19質粒的圖。圖15 是描繪 pBSKura3Km 和 pBSDeltaUra3KM 質粒的圖。圖16是描繪pVR52、pVR67和pVR96質粒的圖。圖17是描繪pVR102質粒的圖。圖18是描繪pVR103質粒的圖。圖19是描繪pVR65和pVR104質粒的圖。圖20是描繪pCM21和pCM23質粒的圖。圖21是描繪pCM29質粒的圖。圖22是描繪pVRl 13質粒的圖。圖23是描繪pCM31質粒的圖。圖24是描繪pVR118質粒的圖。圖25是描繪pCM52質粒的圖。圖26是描繪pCM55質粒的圖。圖27是描繪pCM58質粒的圖。圖28是描繪pMI409質粒的圖。圖30是描繪pMI410質粒的圖。圖31是描繪pMI412質粒的圖。圖32是描繪pMI403質粒的圖。圖33是描繪pMI417質粒的圖。圖34是描繪pMI425質粒的圖。圖35是描繪pS091質粒的圖。圖36是描繪pS099質粒的圖。圖37是描繪pS089質粒的圖。圖38是描繪pS096質粒的圖。圖39是描繪pS057質粒的圖。圖40是描繪pCM48質粒的圖。
具體實施例方式通過進行對宿主酵母細胞的某些基因修飾制備得到本發明的基因修飾酵母。適宜的宿主酵母細胞含有至少一種天然基因，其產生能夠催化D-木糖轉化成木糖醇的活性酶。這些酶可以是對木糖一木糖醇還原特異的或者可以是非特異性的(即，對一系列戊糖操作)。通過此類基因產生的酶以不同的名稱稱作EC號I. I. I. 21和正式稱作糖醇=NAD(P) I-氧化還原酶。此類基因編碼的酶通常具有下面的活性D-木糖+NAD (P)H =木糖醇+NAD+(即，它可以用NADPH或者NADH或者兩者作為氧化還原輔因子)。表達木糖還原酶的基因在本文稱作“木糖還原酶基因”，或者“XR基因”。在一些實例中，特定XR基因在本文中稱作“XYL1”基因。文中所用術語“天然的”用于指在酵母物種的未修飾細胞的基因組內發現的遺傳材料(例如，基因、啟動子或者終止子)(除了不影響其功能的個體-個體突變之外)。能夠將D-木糖轉化成木糖醇的宿主酵母細胞通常具有能夠將木糖醇進一步轉化成D-木酮糖的天然能力。這通常通過表達由本文稱作“木糖醇脫氫酶基因”或者“XDH基因”的基因編碼的木糖醇脫氫酶(XDH)來完成。此類基因編碼的酶以不同的名稱稱作EC號I. I. I. 9，通常稱作木糖醇脫氫酶和系統地稱作木糖醇NAD+2-氧化還原酶(D-木酮糖形成)。這些基因通常具有下面的活性木糖醇+NAD(P)+ = D-木酮糖+NAD (P) H(盡管NAD+是目前為止優選的底物，但是一些利用NADP+)。特定XDH基因在本文稱作“XYL2”基因。適宜的宿主細胞具有一種或多種天然基因，其產生功能性醛糖還原酶或者木糖還原酶和功能性XDH酶。如果酶能夠發揮其通常或者計劃的作用，那么在本發明上下文內中稱該酶是“功能性的”。如果基因表達功能性的酶，那么在本發明上下文內中稱該基因是“功能性的”。另一種適宜的宿主酵母細胞能夠跨過其細胞壁或細胞膜運輸木糖。另一種適宜的宿主酵母細胞是天然在木糖上生長的酵母細胞，如具有從木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸的活性天然途徑的酵母細胞。在本發明中，如果野生型細胞通過磷酸己糖途徑代謝至少10%基于葡萄糖的糖，那么認為從木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸的途徑是活性的。優選地，通過該途徑代謝至少20%，更優選至少30%，特別是至少40%的核酮糖-5-磷酸。適宜的宿主細胞包括，例如，來自克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜氏酵母屬(Hansenula)、絲孢酵母屬(Trichosporon)、酒香酵母屬(Brettanomyces)、管囊酵母屬(Pachysolen)和Yamadazyma的酵母細胞。尤其重要的酵母物種包括馬克斯克魯維氏酵母(K. marxianus)、乳克魯維氏酵母(K. lactis)、耐溫克魯維氏酵母(K. thermotolerans)、C. sonorensis、C. methanosorbosa、C. diddensiae、近平滑假絲酵母(C. parapsilosis)、C. naeodendra、C. balnkii、C. entomophila、C. scehatae、嗜鞋管囊酵母(P. tannophilus)和具柄畢赤氏酵母(P. stipitis)。馬克斯克魯維氏酵母、C. sonorensis、C. scehatae、嗜鞋管囊酵母和具柄畢赤氏酵母是在木糖上生長的酵母細胞的實例。它們具有天然的木酮糖-5-磷酸到甘油醛-3-磷酸途徑，天然的功能性醛糖和/或木糖還原酶基因、活性木糖醇脫氫酶基因，和通過細胞壁或細胞膜轉運木糖的天然能力。優選的宿主細胞包括物種馬克斯克魯維氏酵母、乳克魯維氏酵母、耐溫克魯維氏酵母、C. sonorensis 和 C. methanosorbosa 的那些宿主細胞。宿主細胞可以含有不同于本文特別指出的那些基因修飾的基因修飾。例如，可以 基因修飾宿主細胞以通過進一步代謝木酮糖-5-磷酸和/或甘油醛-3-磷酸產生(或不產生)特定類型的發酵產物。此類修飾的特定實例包括缺失或破壞天然丙酮酸脫羧酶(PDC)基因，和插入外源基因，如L-乳酸脫氫酶(L-LDH)或者D-乳酸脫氫酶(D-LDH)基因。產生這些類型修飾的方法描述于例如，W099/14335、W000/71738、W002/4247U W003/10220UW003/102152和W003/049525。在如本文描述的進一步修飾宿主細胞前宿主細胞中可以存在這些修飾，或者這些修飾可以在本文描述的此類進一步修飾同時或者之后進行。本發明某些方面的基因修飾酵母細胞包括功能性外源木糖異構酶(XI)基因，其優選整合到宿主細胞的基因組。在該上下文中，“外源”指(I)XI基因不是宿主細胞天然的，(2)XI基因是宿主細胞天然的，但是宿主細胞的基因組已經受到修飾以提供天然XI基因的額外的功能性拷貝，或者(3) (I)和(2)兩者。適宜的XI基因的實例包括對Piromyces物種E2 (如Genbank (登錄號AJ249909)中Piromyces sp. E2xylA編碼基因序列)和Cyllamyces aberensis天然的XI基因以及從其他厭氧真菌得到的XI基因。Piromyces物種E2和Cyllamyces Aberensis XI基因的核昔酸序列分別標識為SEQ. ID. NOs. 58和151。通過這些XI基因產生的蛋白質的推導的氨基酸序列分別標識為SEQ. ID. No. 59和152。適宜的細菌XI基因是多形擬桿菌(Bacteroides thetaiotaomicro n)天然的。該多形擬桿菌XI基因的核苷酸序列標識為SEQ. ID. NO. 162。該基因產生的酶的推導氨基酸序列標識為 SEQ. ID. NO. 163。適宜的 XI 基因包括與 SEQ. ID. NOs. 58 或 151 至少 60%、80%、90%、95 %、98 %或99 %同源的基因。適宜的XI基因包括編碼與SEQ. ID. NOs. 59或152至少60%、80%、90%、95%、98%或99%同源的酶的基因。一些適宜的木糖異構酶基因與SEQ.ID. NO. 58的同源性不超過95%或者不超過90%，或者編碼的酶與SEQ. ID. NO. 59的同源性不超過95%或者不超過90%。其他適宜的木糖異構酶基因是細菌木糖異構酶基因，其與SEQ. ID. NO. 162 至少 60、80、90、95、98 或 99% 同源和 / 或產生與 SEQ. ID. NO. 163 至少 60、80、90、95、98或99%同源的酶。可以使用BLAST版本2. 2. I軟件用默認參數方便地計算氨基酸序列的百分比同源性。使用BLAST版本2. 2. I軟件用默認參數計算同一性得分和陽性得分為至少XX%的序列被認為至少XX%同源。尤其適宜的木糖異構酶基因包括編碼與SEQ. ID. NO. 163相比具有至少60%的同一性得分、與SEQ. ID. NO. 59相比具有少于95%的同一性得分、與SEQ. ID. NO. 59相比具有少于97%的同一性得分的酶的基因。外源XI基因處于啟動子和終止子的控制下，啟動子和終止子兩者在修飾酵母細胞中都是功能性的。文中所用術語“啟動子”指位于結構基因的翻譯起始密碼子的上游(即5’)(通常在約I-IOOObp內，優選l_500bp，特別是I-IOObp)并且控制結構基因轉錄起始的未轉錄的序列。類似地，術語“終止子”指位于結構基因的翻譯完成密碼子的下游(即3’)(通常在約I-IOOObp內，更通常l_500bp，特別是I-IOObp)并且控制結構基因轉錄結束的未轉錄的序列。如果啟動子或終止子在基因組中的位置相對于結構基因的位置使得啟動子或終止子根據具體情況而定發揮其轉錄控制功能，那么啟動子或終止子“可操作地連接”結構基因。啟動子和終止子序列可以是酵母細胞天然和外源的。在功能部分分別與細胞天然啟動子和終止子序列的功能部分高度同源(即，90%或以上，特別95%或以上，最優選99%或以上同源)的啟動子和終止子序列也是有用的，當外源基因的插入靶向細胞基因組的特定位點時尤其如此。適宜的啟動子與酵母基因天然的啟動子至少90%、95%或99%同源。更適宜的啟動子與宿主細胞天然的基因的啟動子至少90^^95%或99%同源。尤其有用的啟動子包括酵母丙酮酸脫羧酶(roc)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)和轉錄增強子因子-I (TEF-I)基因的啟動子，特別來自宿主細胞天然的這些基因的啟動子。適宜的終止子與酵母基因天然的終止子至少90%、95%或99%同源。終止子可以與宿主細胞天然基因的終止子至少90 %、95 %或99 %同源。尤其有用的終止子包括酵母丙酮酸脫羧酶(H)C)、木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)或異-2-細胞色素c (CYC)基因的終止子，或者來自酵母中半乳糖基因家族的終止子，尤其所稱作的GALlO終止子。已經表明啤酒糖酵母GALlO終止子和啤酒糖酵母CYCl終止子是酵母中外源XI基因的有效終止子。(宿主細胞)天然啟動子和終止子以及各自上游和下游側翼區的使用可以允許XI基因靶向整合到宿主細胞基因組的特定基因座，和同時整合XI基因和缺失另一天然基因，如XR、XDH或PDC基因。 聚組氨酸尾可以存在于XI基因的3’末端。在下面的實施例3中描述了其實現方法。然而，聚組氨酸尾的存在可以降低XI基因的性能。聚組氨酸尾對于本發明不是關鍵的并且如果希望可以省略。外源XI基因可以隨機插入宿主細胞的基因組或者插入一個或多個靶定位置。靶定位置的實例包括希望缺失或破壞的基因的基因座，如XR、XDH或PDC基因的基因座。在一些實施方案中，與天然PDC基因位點相鄰的XI基因的整合似乎與發酵產物生產中修飾酵母細胞的提高的性能有關。可以用或不用天然PDC基因的缺失或破壞來完成在PDC基因座上的整合，但是優選保持天然PDC基因完整和功能性，當所希望的發酵產物是乙醇或者為丙酮酸代謝物的其他產物時尤其如此。可以通過設計具有與靶基因的上游(5，-)和下游(3’ -)側翼同源的區域的載體實現定向整合。這兩種區域的任一種可以包括靶基因的編碼區的一部分。XI盒(如果與靶基因的啟動子和終止子不同，那么包括相關的啟動子和終止子)和選擇標記(如需要可以具有相關的啟動子和終止子)將存在于載體上與靶基因的上游和下游側翼同源的區域間。基因修飾酵母細胞可以含有單拷貝或多拷貝的外源XI基因。如果存在多拷貝的外源XI基因，則可以存在2到10個或更多拷貝，如約2-8或約2-5個拷貝。外源XI基因的多個拷貝可以整合在宿主細胞基因組內的一個基因座(從而它們彼此相鄰)或者幾個基因座上。在尤其重要的實施方案中，外源XI基因的多個拷貝整合入或與天然PDC基因的基因座相鄰，存在或不存在天然PDC基因的缺失或破壞。不同外源XI基因可能處于不同類型啟動子和/或終止子的控制下。通過對酵母的基因組進行一個或多個額外的修飾，和/或選擇具有某些特征的宿主細胞改進經修飾的酵母的性能，尤其在厭氧條件下的性能。這些性能包括(I)低XR(或者其他醛糖還原酶)活性，(2)低XDH活性和(3)XR超表達的一種或多種。宿主細胞可以天然地具有或者經過修飾而具有低醛糖還原酶活性。以下面的實施例4E中描述的方式測量的這種低醒糖還原酶活性適宜地小于10mU/mg或者小于5mU/mg。如果宿主細胞含有產生催化木糖向木糖醇轉化的酶的一個或多個醛糖還原酶基因，那么就適宜地破壞或缺失一個或多個這些基因。通常，選擇用于破壞或者缺失的基因是單獨或者共同地(I)占宿主細胞的木糖一木糖醇還原活性的至少40%，優選至少50%，和/或(2)為XR基因，即編碼對木糖一木糖醇還原特異的酶的基因的那些基因。通常優選缺失或破壞至少一個XR基因。缺失或破壞優選實現酶活性的至少50%減小，更優選將木糖還原酶活性減小到低于10mU/mg或5mU/mg。“缺失或破壞”指除去(缺失)基因的整個編碼區，或者修飾(如通過缺失、插入或突變)基因或者其啟動子和/或終止子區，從而該基因不再產生活性酶，或者產生具有嚴重降低的活性的酶。可以通過基因工程方法、強迫進化或者誘變和/或選擇或篩選可以實現缺失或破壞。對于XR或者非特異醛糖還原酶基因，完成缺失或破壞的適宜的方法是克隆基因的上游和下游側翼區(其包括該基因的一部分編碼區)，產生含有所克隆的上游和下游側翼的載體，和用該載體轉化宿主細胞。載體可以含有其他遺傳材料，如標記基因或其他基因，希望所述基因插入到宿主細胞基因組中天然XR或者非特異醛糖基因(如XI基因、XK基因或者使得細胞能夠產生所希望的發酵產物的基因，如L-或D-LDH基因)的基因座上。缺失XR或者非特異醛糖還原酶基因的一種方法是用含有與靶基因的上游(5，-)和下游(3’ -)側翼同源的區域的載體轉化宿主細胞。例如，使用適當設計的引物和使用基因組DNA作為模板，通過PCR擴增適宜的區域可以得到此類側翼序列。兩種這些區域之一可以包括靶基因的一部分編碼區，盡管載體不應該含有該基因的完整功能部分。此類側翼序列通常是至少50個堿基對，或至少100或至少500個堿基對的序列。盡管對側翼序列長度 在理論上沒有上限，但是其長度優選最多約4000個堿基對，更優選最多約1200個堿基對。每個側翼序列與細胞基因組的相應序列具有至少90%，優選至少95%，更優選至少98%，更優選至少99%的同源性。這些側翼序列可以分別包括靶基因的啟動子和終止子序列。載體可以還含有一個或多個選擇標記盒(如果需要具有相關的啟動子和終止子)，所述選擇標記盒有利地位于與靶基因的上游和下游側翼同源的區域之間。這種載體可以在同源重組中缺失靶基因，在所缺失的靶基因的基因座上插入選擇標記基因。載體可以代替選擇標記盒或除了選擇標記盒之外包括另一表達盒，如XI表達盒，和L-或D-LDH盒或者木酮糖激酶表達盒，所有這些表達盒都可以包括相關啟動子和終止子。還可以設計載體以利用自發環出事件，如W003/102152中描述的。宿主細胞可以天然地具有或者經修飾而具有低木糖醇脫氫酶活性。以在下面的實施例6B中描述的方式測量的這種低木糖醇脫氫酶活性適宜地小于2mU/mg或者小于ImU/mg。如果宿主細胞含有一個和多個木糖醇脫氫酶基因，從而導致較高的木糖醇脫氫酶活性，則可以適宜地破壞和缺失這些基因的一個和多個。可以與關于醛糖還原酶缺失或破壞在前面描述的類似的方法進行XDH基因缺失或破壞。通過向轉化載體中整合入XDH基因的上游和下游側翼，來代替XR或者非特異醛糖還原酶基因的側翼，可以進行缺失。如前，載體可以包括一個和多個選擇標記盒和/或一個或多個其他表達盒。缺失或破壞優選實現酶活性的至少50%減小，更優選將木糖醇脫氫酶活性減小到低于2mU/mg或ImU/mg。經修飾的細胞優選表達木酮糖激酶，如在下面的實施例5E中描述所測量的，所述木酮糖激酶具有至少100mU/mg,如至少300mU/mg或者至少500mU/mg的活性。木酮糖激酶以不同名稱稱作EC2. 7. I. 17和系統地稱作ATP D-木酮糖5-磷酸轉移酶。其活性通常為ATP+D-木酮糖=ADP+D-木酮糖5-磷酸木酮糖激酶(XK)。例如，通過強迫凈化(在適宜選擇超表達該酶的突變體的條件下)、誘變或者通過將一個或多個功能性外源木酮糖激酶基因整合到宿主細胞的基因組中可實現超表達。在該上下文中，“外源的”指(I) XK基因不是宿主細胞天然的，(2)XK基因是宿主細胞天然的，但是宿主細胞的基因組已經經修飾以提供天然基因的額外的功能拷貝，或者(3) (I)和(2)兩者。適宜的木酮糖激酶基因包括酵母木酮糖激酶基因。適宜的XK基因的優選實例是啤酒糖酵母XK基因(ScXKSl)。ScXKSl基因的核苷酸序列標識為SEQ. ID. NO. 83。通過ScXKSl基因產生的酶的推導的氨基酸序列標識為 SEQ. ID. NO. 84。適宜的 XK 基因包括與 SEQ. ID. NO. 83 至少 70%、80%、90%、95%、98%或99%同源的那些基因。適宜的XK基因包括編碼與SEQ. ID. NO. 84至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同源的酶的那些基因。其他適宜的XK基因是馬克斯克魯維氏酵母或者C. sonorensis天然的基因或者與這些基因的每一個至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同源的基因。外源XK基因處于啟動子和終止子的控制下，啟動子和終止子兩者在經修飾的酵母細胞中都是功能性的。適宜的啟動子和終止子序列可以是宿主細胞天然的或者與天然啟動子或終止子具有高同源性(即，90%或更大，特別是95%或更大，最優選99%或更大同源性)。當外源XK基因被靶定在宿主細胞基因組的特定位點時，此類啟動子和終止子是尤其有用的。其他適宜的啟動子和終止子是XK基因從中得到的生物天然的或者顯示出與此類 天然啟動子和/或終止子具有相似的高同源性。例如，上面鑒定的ScXKSl基因的適宜的啟動子和終止子包括啤酒糖酵母基因的啟動子和終止子。啟動子和/或終止子可以是特定XK基因天然的或者顯示出與此類啟動子和/或終止子相似的高同源性。ScXKSl基因的尤其有用的啟動子包括啤酒糖酵母丙酮酸脫羧酶(PDC)、磷酸甘油酸激酶(PGK)、木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)和轉錄增強子因子-I (TEF-I)啟動子。ScXKSl基因的尤其有用的終止子包括啤酒糖酵母丙酮酸脫羧酶(PDC)、木糖還原酶(XR)、木糖醇脫氫酶(XDH)或異-2-細胞色素c (CYC)終止子或者來自酵母中的半乳糖基因家族的終止子，尤其所稱作的GALlO終止子。已經表明啤酒糖酵母GALlO終止子和啤酒糖酵母CYCl終止子是酵母中外源XI基因的有效終止子。外源XK基因可以隨機整合到宿主細胞的基因組，或者使用與上述插入XR基因的方法類似的方法插入到一個或多個靶定位置。靶定位置的實例包括希望缺失或破壞的基因，如XR、XDH或者PDC基因的基因座。如前，通過設計具有與靶基因的上游(5’ -)和下游(3’_)側翼同源的區域的載體可以實現靶向整合。這兩個區域的任一個可以包括靶基因的一部分編碼區。XK盒(如果與靶基因的那些啟動子和終止子不同，則可以包括相關的啟動子和終止子)和選擇標記(如果需要具有相關的啟動子和終止子)將位于載體上與靶基因的上游和下游側翼同源的區域之間。基因修飾酵母細胞可以含有單拷貝或多拷貝(如2到10或更多拷貝，2到8或2到5個拷貝)的外源XK基因。外源XK基因的多個拷貝可以整合在宿主細胞基因組的一個基因座(從而它們彼此相鄰)或者幾個基因座上。不同外源XK基因可能處于不同類型啟動子和/或終止子的控制下。具有低木糖還原酶活性、低木糖醇脫氫酶活性和超表達的木酮糖激酶活性的根據本發明的細胞是篩選宿主細胞中外源木糖異構酶基因活性的極佳的宿主。這些基因修飾產生有助于木糖異構酶表達的細胞環境，因此如果某個基因實際上有活性，那么其活性較少可能受到細胞環境的抑制并因此在細胞中是可測量的。通過設計和構建適宜的載體和用那些載體轉化宿主細胞在一步或多步中實現宿主細胞的基因修飾。可以使用電穿孔和/或化學(如基于氯化鈣或乙酸鋰的)轉化方法。轉化酵母株系的方法在 W099/14335、W000/71738、W002/42471、W003/102201、W003/102152和TO03/049525中描述；這些方法通常可應用于根據本發明轉化宿主細胞。用于轉化的DNA可以用特定限制酶切割或者用作環狀DNA。已經在一般意義上在上面討論了轉化載體設計的一般性方法。下面是某些特定轉化載體設計，其中以閱讀/轉錄的順序列出組分。所有都可以是環狀或線性的。所有都可以含有用于線性化或者片段化的多種類型的限制位點。載體還可以含有主鏈部分(如用于在大腸桿菌(E.coli)中增殖)，其可以從通過商業途徑可得到的酵母或者細菌載體方便地得到。I.宿主細胞XR基因的上游(5’_)區；標記表達盒，宿主XR基因的宿主下游(3’_)區。標記表達盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表達盒，如果需要，所述表達盒可以具 有啟動子和終止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScTOCl啟動子和ScGAIIO終止子。2.與(I)相同，其中XI盒(包括可操作地連接基因的啟動子和終止子)位于宿主細胞XR基因的5’-和3’-區之間。XI盒可以包括宿主細胞天然的啟動子。XI盒可以包括ScCYCl或ScGALIO終止子。3.與⑴或⑵相同，其中XK盒(包括可操作地連接基因的啟動子和終止子)位于宿主細胞XR基因的5’ -和3’ -區之間。XK盒可以包括宿主細胞天然的啟動子，或者ScTEFl啟動子。XI盒可以包括ScCYCl或ScGALIO終止子。4.宿主細胞XDH基因的上游(5’ -)區；標記表達盒、宿主XDH基因的宿主下游(3’_)區。標記表達盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表達盒，如果需要，所述表達盒可以具有啟動子和終止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScTOCl啟動子和ScGAIIO終止子。5.與(4)相同，其中XI盒(包括可操作地連接基因的啟動子和終止子)位于宿主細胞XR基因的5’ -和3’-區之間。XI盒可以包括宿主細胞天然的啟動子。XI盒可以包括ScCYCl或ScGALIO終止子。6.與⑷或(5)相同，其中XK盒(包括可操作地連接基因的啟動子和終止子)位于宿主細胞XR基因的5’ -和3’ -區之間。XK盒可以包括宿主細胞天然的啟動子，或者ScTEFl啟動子。XI盒可以包括ScCYCl或ScGALIO終止子。7. XI盒或者XK盒前面或者后面的HisG-Ura3_HisG盒。8. XI盒,包括馬克斯克魯維氏酵母啟動子或C. sonorensis啟動子,所述XI盒在標記表達盒的前面或后面。馬克斯克魯維氏酵母或C. sonorensis啟動子可以為PDC或者PGK啟動子。XI盒中的終止子可以是馬克斯克魯維氏酵母、C. sonorensis或啤酒糖酵母終止子，并且可以特別為ScCYCl或ScGALIO終止子。標記表達盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表達盒，如果需要，所述表達盒可以具有啟動子和終止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDCl啟動子和ScGAIIO終止子。XI盒還可以包括XK盒(如下面的9中描述的)，其位于XI盒的上游或下游，并且在標記表達盒的上游或下游。9.標記表達盒后面或前面的XK盒。XK盒可以包括馬克斯克魯維氏酵母啟動子、C. sonorensis啟動子或啤酒糖酵母啟動子。XK盒啟動子可以特別為馬克斯克魯維氏酵母或C. sonorensisPDC或PGK或啤酒糖酵母H)C、PGC或TEFl啟動子。XK盒中的終止子可以是馬克斯克魯維氏酵母、c. sonorensis或啤酒糖酵母終止子，并且可以特別為ScCYCl或ScGALIO終止子。標記表達盒可以是潮霉素、Ura3或者G418抗性表達盒，如果需要，所述表達盒可以具有啟動子和終止子。Ura3盒可以是HisG-Ura3-HisG盒。G418盒可以包括ScPDCl啟動子和ScGAIIO終止子。10. XI盒、XK盒或者兩者，前面為宿主細胞XR基因的上游(5’ -)區；后面是宿主XR基因的下游(3’ -)區。該載體可以包括XR基因的上游和下游區之間的其他組分。11. XI盒、XK盒或者兩者，前面為宿主細胞XDH基因的上游(5’_)區；后面是宿主XDH基因的下游(3’_)區。該載體可以包括XDH基因的上游和下游區之間的其他組分。12.前面質粒的任一種，還包括在宿主細胞中有活性的自復制位點。可用于前面載體的特定XI盒包括馬克斯克魯維氏酵母roci (KmPDCl)啟動子、XI基因(上述任一種)和 ScCYCl、ScGALIO 或 KmPDCl 終止子；C. sonorensis PDCl (CsPDCl)啟動子、XI 基因和 ScCYCU ScGALIO 或 CsPDCl 終止子；和 C. sonorensis PGK(CsPGK)啟動子、XI基因和ScCYCl、ScGALIO或CsPDCl終止子。可以用于前面載體的特定XK盒包括馬克斯克魯維氏酵母roci (KmPDCl)啟動子、XK基因(上述任一種，但是特別為ScXKSl基因)、和ScCYCl、ScGAL 10或KmPDCl終止子；C. sonorensisPDCl (CsPDCl)啟動子，XK 基因和 ScCYCl、ScGAL 10 或 CsPDCl 終止子；C. sonorensis PGK(CsPGK)啟動子、XK 基因和 ScCYCl、ScGAL 10 或 CsPDCl 終止子；和啤酒糖酵母TEF-I (ScTEFl)啟動子，XK基因和ScCYCl、ScGAL 10或CsPDCl終止子。除了上述特定選擇標記基因，通常的選擇標記基因編碼如下蛋白質，所述蛋白質(a)賦予宿主細胞對抗生素或其他毒素的抗性，所述抗生素或其他毒素抗性為例如zeocin (印度斯坦鏈異壁菌(Streptoalloteichus hindustanus)ble博來霉素抗性基因)、G418 (Tn903的卡那霉素抗性基因)、潮霉素(大腸桿菌的氨基糖苷類抗生素抗性基因)、氨芐青霉素、四環素或者卡那霉素；(b)補充細胞的營養缺陷型缺陷，如氨基酸亮氨酸缺陷(馬克斯克魯維氏酵母Leu2基因)或者尿嘧啶缺陷(例如，馬克斯克魯維氏酵母或啤酒糖酵母Ura3基因)；(c)提供不能從簡單培養基得到的關鍵營養物，或者(d)賦予細胞在特定碳源上生長的能力。木糖異構酶基因可以以該方式作用，從而使得能夠基于在木糖上生長進行選擇。通過利用標記基因貢獻的特征，或者通過插入基因貢獻的其他特征(如能夠在木糖上生長)可以以已知方式選擇成功的轉化體。通過PCR或者DNA印跡分析證實已經發生所希望的插入和缺失、證實拷貝數和鑒定基因整合到宿主細胞的基因組的位點可以進行篩選。使用公知的測定方法可以證實所插入的基因編碼的酶的活性和/或缺失的基因編碼的酶的活性的缺乏。含有外源XI基因的本發明的基因修飾酵母細胞可用于發酵戊糖成所希望的發酵產物，如乙醇和乳酸。某些額外的基因修飾對于使得酵母細胞能夠以可接受的得率、滴度和/或生產力產生某些產物是必需的。例如，如前文討論的，整合外源LDH基因和缺失天然roc基因對于得到高乳酸得率是必需的。在本發明的發酵方法中，在包括戊糖的發酵培養基中培養本發明的細胞。戊糖優選為木糖、木聚糖或者木糖的其他寡聚體。這些糖適宜地為含有半纖維素的生物量的水解產物。發酵培養基可以還含有其他糖，特別是己糖，如右旋糖(葡萄糖)果糖、葡萄糖的寡、聚體，如麥芽糖、麥芽三糖和異麥芽三糖，和潘糖。對于寡聚糖，必需向發酵液體培養基中加入酶以便將這些寡聚糖消化成相應的單體糖。培養基將通常含有特定細胞所需的營養物，包括氮源(如氨基酸、蛋白質、無機氮源，如氨或者銨鹽，等等)，和多種維生素、礦物質等等。認為其他發酵條件，如溫度、細胞密度、底物的選擇、營養物的選擇等等對于本發明不是關鍵的，并且通常選擇用以提供經濟方法。在每個生長期和生產期期間的溫度可以為高于培養基的冷凍溫度到約50°c，盡管最適溫度在某種程度上取決于特定微生物。優選的溫度，尤其生產期的優選溫度為約30_45°C。當細胞是工程改造的馬克斯克魯維氏酵母時，其可以耐受:相對聞溫(如聞于40°C到最聞達50°C，特別是最聞達45°C )。另一優選的細胞種類C. sonorensis可以耐受最高達約40°C。該溫度范圍提供了在此類較高溫度進行發酵(從而降低冷卻成本)而不顯著損失生產力的可能。良好的高溫耐受提供的另一優點是如果發酵受到不希望的微生物的污染，那么在許多情況中，通過加熱發酵培養基到40°C或者以上，特別是45°C或以上，可以選擇性殺死不希望的微生物而不嚴重傷害本發明的所需細胞。 生產期期間，培養基中的細胞濃度通常為約1-150，優選約3-10，甚至更優選約3_6g干細胞/升發酵培養基。可以在需氧、微需氧或者厭氧下進行發酵。如果希望，如W003/102200中描述的，可以將比氧氣攝入速率用作過程對照。本發明的一個優點是基因修飾細胞由于表達XI基因和其他修飾一般可以厭氧發酵木糖。當發酵產物是酸時，可以在發酵的生產期期間緩沖培養基從而使PH保持在約5. 0到約9. 0，優選約5. 5到約7. O。適宜的緩沖劑是在乳酸形成時將其中和的堿性材料，并且其包括例如，氫氧化鈣、碳酸鈣、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鉀、碳酸鈉、碳酸銨、氨、氫氧化銨等等。通常，用于常規發酵過程的那些緩沖劑在此處也是適宜的。然而，在本發明的范圍內允許發酵培養基的PH從通常為6或更高的起始pH，降低到低于酸性發酵產物的pKa，如約2到約5或者約2. 8到約4. 5。在緩沖發酵中，在形成酸性發酵產物如乳酸時將其中和為相應的乳酸鹽。從而酸的回收包括再生游離酸。這通常通過除去細胞和用強酸如硫酸酸化發酵液體培養基來實現。形成鹽副產物(當鈣鹽是中和劑并且硫酸是酸化劑時形成石膏)，分離所述副產物與酸。然后通過諸如液-液萃取、蒸懼、吸收等的技術回收酸，如ComprehensiveBiotechnology,(編者 M. Moo-Young)，Pergamon, Oxford, 1985 的 T. B. Vickroy,卷 3, 38 章；R. Datta，等人，FEMS Microbiol. Rev.，1995 ；16 :221-231 ;美國專利號 4，275，234,4, 771，001,5, 132，456,5, 420，304,5, 510，526,5, 641，406 和 5，831，122 和 W093/00440 中描述的。本發明的方法可以連續、分批或者以它們的一些組合進行。提供下面的實施例以闡明本發明，但是這些實施例不意在限制本發明的范圍。除非另外指出，所有部分和百分數都是按重量計的。實施例IA :構建含有啤酒糖酵母PGKl啟動子和啤酒糖酵母GallO終止子的質粒(pNC2，圖I);構建含有啤酒糖酵母roci啟動子和啤酒糖酵母GallO終止子的質粒(pNC4，圖2)啤酒糖酵母PGKl啟動子(ScPGKl)的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I所示。該序列以稱作pBFY004的專有質粒的限制片段得到。備選地，可以通過PCR擴增使用啤酒糖酵母染色體DNA作為模板和基于SEQ. ID. NO. I設計的引物得到所述序列。所用的啤酒糖酵母GALlO終止子(ScGALIO)具有標識為SEQ. ID. NO. 2的核苷酸序列。該序列以稱作PBFY004的專有質粒的限制片段得到。備選地，可以通過PCR擴增使用啤酒糖酵母染色體DNA作為模板和基于SEQ. ID. NO. 2設計的引物得到所述序列。使用標識為SEQ ID. NO. 3和SEQ. ID. NO. 4的引物，使用啤酒糖酵母株系GY5098 (ATCC4005098)的染色體DNA作為模板通過PCR擴增啤酒糖酵母I3DCl啟動子(ScPDCl)。使用 PfuTurbo DNA 聚合酶(Stratagene, Madison, WI),以 94°C I 分鐘，56°C I分鐘和72°C I分鐘的30個循環，和72°C 7分鐘的最終溫育進行熱循環。ScTOCI啟動子的核苷酸序列標識為SEQ. ID. NO. 5。通過組合pGEM5Z(+) (Promega, Wisconsin)主鏈載體上的 ScPGKl 和 ScGallO 終 止子產生質粒pNC2(圖I)。通過具有限制位點XbaI、EcoRI和BamHI的多接頭區在所得載體中分離ScPGKl和ScGALIO以將待表達的特定基因插入到酵母啟動子和終止子之間。由具有多克隆位點的ScPGKl啟動子和ScGALIO終止子組成的 I. 2kbpNotI限制片段標識為SEQ. ID. NO. 6。以相同的一般方法構建含有表達盒的表達載體pNC4，只是使用ScroCl基因代替ScPGKl基因。所得載體(pNC4)在圖2中顯示。由ScPGKl啟動子和ScGALIO終止子組成的具有多克隆位點的 I. 3kbp NotI片段標識為SEQ. ID. NO. 7。實施例IB :將G418抗性標記基因插入到pNC2(實施例1A，圖I)中以產生其中G418基因可操作地連接啤酒糖酵母PGKl啟動子和ScGALIO終止子的質粒(pVR22，圖3)。使用Pfu 聚合酶(Stratagene，Madison, WI)與標識為 SEQ. ID. NO. 8 和 SEQ.ID.勵.9的引物，使用質粒？？1091((11^廿(^11，04)作為模板通過PCR擴增G418抗性基因。通過最初在95 °C溫育反應混合物5分鐘，然后為95 °C 30秒、49°C 30秒和72 °C 2分鐘的35個循環，接著為72°C 10分鐘的最后溫育進行熱循環。將PCR產物用BamHI和XbaI消化并分離821bp片段并連接到pNC2 (實施例1A，圖I)的 4303bp BamHI-XbaI片段。所得質粒(PVR22,圖3)具有可操作地連接G418抗性基因的ScPGKl啟動子和ScGALIO終止子。實施例IC :將G418抗性標記基因插入到pNC4(實施例1A，圖2)中以產生其中G418基因可操作地連接啤酒糖酵母roci啟動子和ScGALIO終止子的質粒(pVR29，圖4)使用Pfu 聚合酶(Stratagene, Madison, WI)與標識為 SEQ. ID. NO. 8 和 SEQ.ID. N0.9的引物，使用質粒pVR22(實施例1B，圖3)作為模板通過PCR擴增G418抗性基因。通過最初在95 °C溫育反應混合物5分鐘，然后為95 °C 30秒、49°C 30秒和72 °C 2分鐘的35個循環，接著為72°C 10分鐘的最后溫育進行熱循環。將PCR產物用BamHI和XbaI消化并分離821bp片段并連接到pNC4(實施例1A，圖2)的 4303bp BamHI-XbaI片段。所得質粒pVR29(圖4)含有可操作地連接G418抗性基因的ScTOCI啟動子和ScGALIO終止子。實施例ID :構建含有馬克斯克魯維氏酵母roCl基因的5’ -和3’ -側翼序列和處于ScroCl啟動子和ScGALIO終止子控制下的G418基因的載體(pBH5b，圖5)用標識為SEQ. ID. NO. 10和SEQ. ID. NO. 11的引物，使用質粒pS021 (描述于美國公開的專利申請2004/029256A1)作為模板通過PCR擴增緊靠在馬克斯克魯維氏酵母PDCl (KmPDCl)基因上游的1254bp的DNA片段。通過最初在94°C溫育反應混合物2分鐘，然后為94°C 30秒、55°C 30秒和72V I. 5分鐘的35個循環，接著為72V 7分鐘的最后溫育進行熱循環。在0. 8%瓊脂糖凝膠上分離PCR產物并分離 1254bp產物。PCR產物和PVR29質粒(實施例1C，圖4)用KpnI和SbfI兩者消化并連接產生 6315bp載體，其稱作pBH5a(圖5)。pBH5a質粒含有可操作地連接ScI3DCI啟動子和ScGALIO終止子的G418抗性基因和與緊靠在KmPDCl基因上游的DNA同源的DNA的 1240bp片段。用標識為SEQ. ID. NO. 12和SEQ. ID. NO. 13的引物，使用質粒pS021作為模板通過PCR擴增緊靠在KmPDCl基因下游的DNA的535bp片段。通過最初在94°C溫育反應混合物2分鐘，然后為94°C 30秒、55°C 30秒和72°C 45秒的35個循環，接著為72°C 4分鐘的最后溫育進行熱循環。在0.8%瓊脂糖凝膠上分離PCR產物并分離535bp產物。將PCR產物用SbfI和MluI消化并將所得529bp片段連接pBH5a的SbfI-MluI片段以產生質粒pBH5b (圖
5)。pBH5b質粒含有相應于KmPDCl基因側翼的那些序列，即 I.2kbp上游側翼序列和
0.5kbpDNA下游側翼序列，它們之間具有一個SbfI位點。pBH5b質粒還含有可操作地連接ScPDCl啟動子和ScGALIO終止子的G418抗性標記。 實施例IE :構建含有聚組氨酸標記和啤酒糖酵母CYCl終止子的載體(pVR73，圖
6)，從pBH5b(實施例1D，圖5)除去G418抗性標記基因以形成載體pVR77 (圖6)基于pYES6CT 載體(Invitrogen, CA)設計標識為 SEQ. ID. NO. 14 和 SEQ. ID. NO. 15的引物用來擴增含有多克隆位點、聚組氨酸標記和啤酒糖酵母CYCl終止子(ScCYCl)的堿基。引物將SbfI和BsmBI位點導入產物。PCR條件為94°C I分鐘、55°C I分鐘和68°C I分鐘的30個循環，接著為68°C 10分鐘的最后溫育，其中使用Platinum PfxDNA聚合酶(Invitrogen, CA)。柱純化PCR產物，然后使用Taq DNA聚合酶在72°C溫育10分鐘將腺苷酸加入到TA克隆的5’末端。然后將507bp產物TA克隆到TOPOII TA克隆載體(Invitrogen，CA)并稱作pVR73(圖6)。在該載體中包括聚組氨酸標記將導致基因克隆到唯一 SbfI位點以使組氨酸標記融合到從該基因表達的蛋白質。用聚組氨酸標記對蛋白質加標簽使得能夠使用Ni-NTA(HRP)綴合物(Quiagen，美國)相對快速的對蛋白質進行蛋白質印跡檢測和使用Ni-螯合樹脂和柱(Invitrogen, CA)快速純化所表達的基因。將質粒pBH5b (實施例1D，圖5)用SphI消化，并將保留KmPDCl啟動子和終止子的 4. 7kbp片段自身再連接得到質粒pVR77 (圖6)。然后除去來自pBH5b的G418抗生素選擇標記。實施例IF :構建含有KmPDCl上游側翼區、多克隆位點、聚組氨酸標記和ScCYCl終止子的載體pVR78(圖6)將質粒VR73(實施例1E，圖6)用酶SbfI和BsmBI消化以釋放含有多克隆位點、聚組氨酸標記和ScCYCl終止子的504bp片段。用相同酶消化載體pVR77以產生 4249bp片段，其含有KmPDCl上游和下游側翼和載體主鏈。連接所述兩個片段形成 4752bp質粒(PVR78，圖6)，其含有距離來自聚組氨酸標記184bp的唯一 SbfI限制位點。該過程從質粒PVR78除去了多數KmPDCl下游側翼區。實施例IG :修飾質粒pVR78 (實施例1F，圖6)以形成從SbfI限制位點到聚組氨酸標記距離縮短以更好地進行基因表達的質粒pCM3(圖7)設計標識為SEQ. ID. NO. 16和SEQ. ID. NO. 17的引物以用來擴增從聚組氨酸標記到ScCYCl終止子的質粒pVR78的完整區域。該引物還具有緊靠在聚組氨酸標記上游的5’SbfI位點和3’ SapI位點。使用標準方法進行PCR反應。PCR條件由94°C 2分鐘的最初溫育，然后為94°C 30秒、63°C 30秒和68°C I分鐘的10個循環組成。接著為94°C 30秒、68°C I分鐘的額外的20個循環。最后步驟為68°C 8分鐘的溫育。用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen, CA)進行擴增。將PCR產物用SbfI和SapI限制酶消化。將通過用酶5’SbfI和3’ SapI消化質粒pVR78得到的 3. 9kb片段連接到PCR產物。所得質粒稱作pCM3 (圖7)。實施例IH :構建處于ScroCl啟動子和ScGaLlO終止子轉錄控制下的含有大腸桿菌潮霉素抗性基因的質粒(PPS1，圖8)用標識為SEQ. ID. NO. 18 和 SEQ. ID. No. 19 的引物，使用質粒 pRLMex30 (Mach 等人1994，Curr. Genet. 25，567-570)作為模板通過PCR擴增賦予潮霉素B抗性的大腸桿菌hph基因。使用相同引物，用大腸桿菌染色體DNA作為模板也可得到hpb基因。使用PfuTurboDNA、聚合酶(Stratagene,Madison, WI)，以94°C I分鐘、56°C I分鐘和72°C 3分鐘的30個循環，接著為72°C 7分鐘的最后溫育進行熱循環。在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產物并分離1026bp片段。然后將該1026bp片段用XbaI和BamHI消化并連接到含有ScTOCI啟動子和ScGaLlO終止子的pNC4(實施例1A，圖2)的XbaI-BamHI片段，得到質粒pPSl (圖8)。實施例II :構建含有KmPDCl上游側翼區、多克隆位點、聚組氨酸標記、ScCYCl終止子(都來自pCM3，實施例1G，圖7)和處于ScPDCl啟動子和ScGALIO終止子(來自pPSl，實施例1H，圖8)的轉錄控制下的大腸桿菌潮霉素抗性基因的載體(pCM9，圖9)用SphI消化質粒pPSl并將含有處于Scroci啟動子和ScGALIO終止子控制下的hph基因的 2. 2kbp片段連接到SphI消化的pCM3。所得質粒(pCM9，圖9)含有KmPDCl啟動子區，其后為單一 SbfI位點和用于將來木糖異構酶基因表達的ScCYCl終止子。此外，用于基因表達的該盒剛好位于接近含有處于Scroci啟動子和ScGALIO終止子控制下的hph基因的 2. 2kbp片段，其用于酵母中轉化體的選擇。實施例2A :基于Genbank中可得到的序列重構Piromyces sp. E2木糖異構酶(PXYLA)基因用于重構Piromyces sp. E2木糖異構酶(PXYLA)基因的方法從AlbertoDi Donato 等人，Analytical Biochemistry212, 291-293(1993)的 “A method forsynthesizing genes and cDNA’s by polymerase chain reaction，，改編而來。PAGE 純化的引物從基因的中心開始到出來的重構體進行排列。使引物組保持14-16bp重疊。每個引物長60-70bp。以17步重構該基因。該方法中采用的PCR方案使用Platinum Pfx (Invitrogen, CA)作為DNA聚合酶，且其緩沖液和MgSO4按照生產商的教導。使用標識為SEQ. ID. NO. 20和SEQ. ID. NO. 21的引物進行步驟I。這些引物代表所述基因序列的中心。在步驟I中不需要模板，因為引物的退火及其延伸將形成核心模板，將在其上建立隨后的PCR反應。步驟I的循環為94°C I分鐘、540C I分鐘和68 °C 2分鐘的20個循環(向每個連續循環添加額外的5秒)，然后為4°C保存。在反應步驟2-17中,Platinum Pfx(Invitrogen,CA)用作DNA聚合酶,且其緩沖液和MgSO4按照生產商的教導。來自每步的2. 5 ill混合物用作每個隨后步驟的模板(50 u I反應物)。每次反應的引物組在表I中描述。每種情況的模板為來自前面反應步驟的5 UlDNA。步驟2-17的循環為94°C I分鐘、46°C I分鐘和68°C 2分鐘的20個循環(向每個連續循環添加額外的5秒)，然后為4°C保存。表I

實施例2B :構建含有重構的PXYLA基因的載體pCM17 (圖10);進行定點誘變以改變重構基因上的堿基從而與GenBank數據庫中的序列吻合通過將最后一輪構建中產生的 I. 314kbp片段連接到TOPOII載體(Invitrogen,CA)來構建含有重構的PXYLA基因(實施例2A)的質粒。重構的PXYLA基因與Genbank序列有5個堿基不同。使用多定點誘變試劑盒(Stratagene，CA)，使用該質粒作為模板糾正每一個這些不同。將通過PAGE或HPLC純化的三種5’磷酸化的標識為SEQ. ID. NO. 54、SEQ.ID. NO. 55和SEQ. ID. NO. 56的誘變引物用于糾正四個錯誤。熱循環參數包括I分鐘變性步驟和I分鐘退火步驟，然后是8分鐘延伸。通過在熱循環結束時向混合物加入Iul DpnI酶來消化該PCR步驟中形成的親本鏈。混合物在37°C溫育I小時，然后用于轉化隨試劑盒提供的XLlO-Gold Ultracompetent大腸桿菌細胞。將混合物鋪平板在Luria-Bertani+氨芐青霉素(LBA)板上并在37°C過夜溫育。然后重復多定點誘變方案以修補第五個錯誤。使用兩種PAGE或HPLC純化的標識為SEQ. ID. NO. 57和SEQ. ID. NO. 55的5’磷酸化誘變引物。對兩種轉化體進行測序并且它們顯示出與PXYLA基因的Genbank序列具有100%同源性。一個構建體命名為pCM17(圖10)。重構的PXYLA基因的核苷酸和氨基酸序列標識為SEQ.ID. NO. 58 和 SEQ. IDN0. 59。實施例3A :構建含有處于KmPDCl啟動子和ScCYCl終止子控制下的PXYLA基因，和處于ScroCl啟動子和ScGALIO終止子控制下的大腸桿菌hph潮霉素抗性基因的載體pCM14(圖 11)使用標識為SEQ. ID. NO. 60 和 SEQ. ID. NO. 61 的引物，用 pCM17 (實施例 2B,圖 10)作為模板通過PCR擴增PXYLA基因。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通過94°C 30秒、55°C 30秒、72°C I. 5分鐘的35個循環，接著為72°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。在
I.0%瓊脂糖凝膠上電泳分離SbfI消化的PCR產物。分離1319bp產物并連接到通過用SbfI消化PCM19得到的 6829bp片段，以構建 8148bp質粒。按照與實施例2B中描述的相同方案，將標識為SEQ. ID. NO. 62的誘變引物用于移去終止密碼子，其意外地加入到緊靠在SbfI位點的上游，以產生 8148bp質粒(PCM14，圖11)。質粒pCM14含有處于KmPDCl啟動子和ScCYCl終止子控制下的PXYLA基因，聚組氨酸尾在該基因的3’末端。該質粒還含有處于ScroCl啟動子和ScGALIO終止子控制下的大腸桿菌hph基因。
實施例3B :將Ura3選擇標記整合到pCM14質粒(實施例3A，圖11)，其中缺失hph
表達盒Alani 等人在 “A method for gene disruption that allows repeateduse of Ura3 selection in the construction of multiply disrupted yeaststrains，” (Genetics，1987，116，541-545)中已經描述了基因整合或基因破壞的方法。該方法利用尿嘧啶營養缺陷型酵母株系和HisG-SCUra3-HisG重復盒。該盒可以用作導入基因或者破壞基因的選擇標記，其優點是HisG盒在隨后世代中與自身重組。從而，酵母細胞在重組事件中喪失了 ScUra3基因，并且ScUra3基因的該喪失恢復了酵母株系的尿嘧啶營養缺陷型，使得可以用相同盒隨后進行轉化。從Nancy DaSilva 得到整合入稱為 pNADFll (Nancy DaSilva, UC Irvine,California)的質粒的HisG_ScUra3_HisG盒。通過將質粒用BamHI和EcoRI酶消化并將
3.8kbp片段連接到BamHI和EcoRI消化的質粒pPUC19 (New England Biolabs,美國)，來從pNADFll 分離 HisG-ScUra3-HisG 盒。所得質粒稱作 pVR65 (圖 19)。將質粒pCM14(實施例3A，圖11)用Aatll/SphI消化并在I %凝膠上電泳分離。分離含有PXYLA盒的 5907bp片段。將質粒pVR65用Aatll/SphI消化并在I %凝膠上電泳分離。分離 4293bpHisG-ScUra3-HisG片段并連接到來自質粒pCM14的 5907bp片段，分離插入片段。所得載體標識為PCM28 (圖12)。其含有處于KmPDCl啟動子和ScCYCl終止子控制下的PXYLA基因(具有聚組氨酸標記)，和HisG-Ura3-HisG盒。從pCM28除去存在于質粒pCM14中的大腸桿菌hph基因和側翼部分。實施例4A :克隆馬克斯克魯維氏酵母木糖還原酶(KmXYLl)基因和上游和下游側
翼通過 Genolevures 計劃(Genomic Exploration of the HemiascomycetousYeasts 12.Kluyveromyces marxianus var.marxianus Bertrand Llorente, AlainMalpertuy, Gaelic Blandin, Francois Artiguenave, Patrick Wincker and BernardDujon FEBS Letters 487(1)71-75頁)中相似馬克斯克魯維氏酵母的部分基因組測序確定了推定的馬克斯克魯維氏酵母木糖還原酶(KmXYLl)編碼區的410bp片段和約500bp啟動子。基于該序列和來自其他酵母木糖還原酶共有序列的一些公知序列，設計引物以分離完整KmXYLl基因序列和啟動子。用基因組步移(gemone walking)方法從馬克斯克魯維氏酵母的野生型株系得到KmXYLl基因序列上游和下游的序列。用基因組步移試劑盒(BDBiosciences, Paolo Alto, CA)得到上游和下游側翼的序列。將來自馬克斯克魯維氏酵母的基因組DNA用來自基因組步移試劑盒(InVitix)gen，CA)的限制酶消化。將用片段得到的基因組文庫用作PCR反應的模板。設計標識為SEQ. ID. NO. 63和SEQ. ID. NO. 64的PCR弓I物來步移5，末端和3，末端兩者以得到木糖還原酶和上游/下游側翼序列。這些引物用于與來自基因組步移試劑盒(BD Biosciences, CA)的引物APl和AP2—起步移。該組引物擴增基因上游的 2. 5kbp片段。對該片段測序以揭示從上游區的最末端到KmXYLl基因的DNA序列。類似地，標識為SEQ. ID. NO. 65和SEQ. ID. NO. 66的引物與來自基因組步移試劑盒的引物APl和AP2 一起步移。這擴增了 KmXYLl基因下游的 I. Skbp片段。對該片段測序以揭示從下游區的最末端離開木糖還原酶的DNA序列。從基因組步移得到的序列信息使得能夠設計標識為SEQ. ID. NO. 67和SEQ.ID. NO. 68的引物。這些引物用于用500ng馬克斯克魯維氏酵母的基因組DNA進行熱循環反應。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen, CA)，通過94°C I分鐘、56°C I分鐘、72°C 3分鐘的30個循環，然后為72°C 7分鐘的最后溫育進行熱循環。PCR產物在0. 8%瓊脂糖凝膠上電泳分離。分離 3. 5kbp產物并連接到pCRII topo-克隆載體中以得到質粒pVR95 (圖13)。實施例4B :構建含有KmXYLl上游和下游側翼，和處于ScTOCI啟動子和ScGALIO終止子控制下的G418抗性標記基因的質粒pCM19(圖14b)設計標識為SEQ. ID. NO. 69和SEQ. ID. NO. 70的引物以從質粒pVR95 (實施例4A, 圖13)擴增 1.3kbp片段。該片段包括KmXYLl基因的啟動子區以及該基因的編碼區的 300bp。這些引物用于用來自pVR95 (實施例4A，圖13)的50ng質粒DNA進行熱循環反應。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通過94°C I分鐘、53°C I分鐘、68°C I分鐘的30個循環，然后為68°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。PCR產物經電泳分離，PstI消化并連接至IJ也用PstI消化的pVR29質粒(實施例1C，圖4)。驗證通過該方法得到的質粒中KmXYLl基因的正確方向和插入到PVR29載體中的啟動子區。該質粒稱作pCM18(圖14a)。設計標識為SEQ. ID. NO. 71和SEQ. ID. NO. 72的引物以從pVR95擴增 I. Ikbp片段。該片段包括KmXYLl基因遠離其終止子的下游的區域。這些引物用于用來自PVR95的50ng質粒DNA進行熱循環反應。使用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen, CA),通過94°C I分鐘、590C I分鐘、68°C I分鐘的30個循環，然后為68°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。標識為SEQ. ID. NO. 73和SEQ. ID. NO. 74的引物用于用50ng上述第一種PCR產物進行熱循環反應以將其擴增。使用PfxDNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通過94°C I分鐘、45°C I分鐘、68°C I分鐘的30個循環，然后為68 °C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。第二次熱循環后的PCR產物經電泳分離，用ApaI消化并連接到也用ApaI消化的質粒pCM18,以形成載體pCM19(圖14b)。質粒pCM19含有KmXYLl的下游側翼和KmXYLl基因的上游側翼(以及該基因的 300bp的編碼區)，所述上游側翼和下游側翼通過含有處于ScroCl啟動子和ScGALIO終止子控制下的G418基因的盒隔開。驗證KmXYLl下游區關于G418抗性基因的正確方向。實施例4C :通過用非功能性基因替換功能性Ura3基因構建馬克斯克魯維氏酵母尿嘧啶營養缺陷型(CD683)使用基因組DNA作為模板和基于Genbank序列(登錄號AF528508)設計的引物分離馬克斯克魯維氏酵母Ura3(KmUra3)基因。將804bp片段克隆到pBluecript載體(Stratagene, Wisconsin)并標記為 pBSKura3Myra(圖 15)。將該質粒用EcoRV消化并分離缺失EcoRV片段的KmUra3基因的 4kbp片段，并再連接以形成質粒pBSDeltaUra3Km(圖15)。該質粒具有非功能性基因(DeltaUra3)。用KpnI和NotI消化質粒并將其用于轉化馬克斯克魯維氏酵母的野生型株系。在5-F0A板上選擇轉化體。用在DeltaUra3基因的缺失區域設計的引物篩選生長在這些板上的菌落。還設計引物以分離整個基因并對那些片段進行測序以表明該新的較短的無功能Delta Ura3基因已經替換了轉化體中的KmUra3基因。將成功轉化的株系稱為⑶683。株系⑶683不生長Sc-Ura板，表明其是尿嘧啶營養缺陷型。實施例4D :通過用質粒pCM19 (實施例4B，圖14b)轉化株系⑶683 (實施例4C)產生具有缺失的木糖還原酶(KmXYLl)基因的馬克斯克魯維氏酵母突變體(CD804)通過用 PvuII消化pCM19得到含有KmXYLl基因上游和下游區以及位于它們之間的G418抗性表達盒的 5. 2kbp片段。該片段用于用標準電穿孔方法轉化馬克斯克魯維氏酵母株系CD683。回收轉化的細胞并鋪平板在10g/L酵母提取物、20g/L酵母蛋白胨、50g/L葡萄糖(YPD)+50 ii g/ml G418 板上并在 37°C溫育 48-96 小時。生長在 YPD+50 y g/ml G418板上的96個轉化體在YPX(10g/L酵母提取物，20g/L酵母蛋白胨+木糖50g/L)+50 y g/mlG418板上復制。96個轉化體的73個不能在YPX+50 u g/ml G418板上生長，證明它們不能利用木糖作為碳源。該無能力表明功能性KmXYLl基因已經在同源重組中被缺失并且用G418盒代替。不能用木糖作為碳源的那些轉化體稱作CD804。使用標識為SEQ. ID. NO. 75和SEQ. ID. NO. 76的PCR引物證實功能性KmXYLl基因的缺乏，設計所述引物以PCR擴增KmXYLl基因的中心。使用標識為SEQ. ID. NO. 77和SEQ.ID. NO. 78的引物通過PCR證實G418基因的存在。結果表明G418抗性基因片段整合在KmXYLl基因的基因座上。使用標識為SEQ. ID. NO. 79和SEQ. ID. NO. 80的一組引物進行進一步的PCR還證實G418抗性基因片段代替了天然KmXYLl基因。DNA印跡分析還證實木糖還原酶基因從株系⑶804缺失。實施例4E :株系⑶683 (實施例4C)和⑶804 (實施例4D)的木糖還原酶活性測定將單獨的帶擋板的搖瓶(250ml容量)接種株系⑶683 (實施例4C)和⑶804 (實施例4D)。搖瓶在以250rpm振蕩下在35°C溫育并過夜生長。培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成。18小時后，以4000G離心細胞5分鐘，用IOOmM磷酸鈉緩沖液洗滌并重懸浮在0. 5ml破裂緩沖液中。破裂緩沖液由溶于200ml體積的IOOmM磷酸鈉緩沖液(PH7. 0)、lmM 二硫蘇糖醇(DTT)、40mg苯甲基磺酰氟(PMSF)(溶于500 u I DMS0)和4片蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche, CA)組成。用玻璃珠(Invitrogen, CA)機械裂解細胞并以14，000G離心15分鐘。移取上清液并根據試劑盒方案(Amersham Bioscience)通過PD-10脫鹽柱運行。XR酶測定試驗溶液由溶于總體積Iml的IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)、0. 2mM NADPH、0. 5mM D-木糖組成，向所述溶液加入各種量的酶容易并在監視340nm的吸收。NADPH使用表明還原酶酶活性。沒有木糖的空白溶液用于確定背景NADPH使用。使用Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton#ADV01),以 BSA 作為標準確定總蛋白質。通過NADPH消化指出的株系⑶683的木糖還原酶活性為13. 7mU/mg蛋白質。株系⑶804的NADPH消耗與4. 4mU/mg蛋白質的木糖還原酶活性一致,而不是預期的0活性。CD804的該NADPH使用歸因于非特異醛糖還原酶，其進行木糖向木酮糖的一些轉化。株系⑶683和⑶804相互鋪平板在YPX板上。株系⑶804在第4天結束時未表現出在那些板上的任何生長，而株系⑶683在那些板上生長良好。實施例5A :構建含有克隆的啤酒糖酵母木酮糖激酶(Sc)(KSl)基因的質粒PVR67 (圖 16)從美國典型培養物保藏中心(ATCC登錄號38626)得到啤酒糖酵母細胞并在標準條件下生長所述細胞。用常規方法從啤酒糖酵母提取基因組DNA。用Pfx聚合酶(Invitrogen, CA)進行PCR擴增反應。每個反應物含有濃度為500ng的啤酒糖酵母基因組DNA、濃度為0. 2mM的4種dNTP的每一種(即，dATP、dGTP、dCTP和dTTP的每一種)和I y M的標識為SEQ. ID. NO. 81和SEQ. ID. NO. 82的擴增引物的每一種。通過94°C 10分鐘的初始溫育，然后為94°C 15秒、55°C 15秒和68°C 90秒的35個循環進行循環。用常規方法凝膠純化 I. 8kbp片段并將其克隆到TA克隆載體中(Invitrogen，CA)。對所得質粒(pVR67，圖16)進行測序以驗證ScXKSl基因序列。該基因顯示出與Genbank中的公知序列(登錄號X61377)的極好的同源性。ScXKSl基因的核苷酸序列標識為SEQ. ID. NO. 83。該基因編碼的酶的氨基酸序列標識為SEQ. ID. NO. 84。實施例5B :構建含有啤酒糖酵母TEFl (ScTEFl)啟動子和ScGALIO終止子的質粒PVR52 (圖 16)從pTEFZeo (Invitrogen，CA)載體克隆啤酒糖酵母TEFl (ScTEFl)啟動子。將標識為SEQ. ID. NO. 85和SEQ. ID. NO. 86的引物用于擴增ScTEFl啟動子和插入XbaI和SstI限 制位點。將PCR產物和質粒pNC2(實施例1A，圖I)用XbaI和SstI酶消化并連接以得到質粒 pVR52 (圖 16)。實施例5C :構建含有處于ScTEFl啟動子和ScGALIO終止子控制下的ScXKSl基因的質粒PVR103 (圖18)將質粒pVR67 (實施例5A，圖16)用XbaI和BamHI消化。凝膠純化含有ScXKSl基因的 I. 8kbp片段。將質粒pVR52(實施例5B，圖16)也用XbaI和BamHI消化并將所得片段連接到來自PVR67的 I. 8kbp片段以形成質粒載體pVR96(圖16)。該質粒含有處于ScTEFl啟動子和ScGallO終止子控制下的ScXKSl基因。在該載體中，ScXKSl基因的ATG起始位點與ScTEFl啟動子的末端離開約130bp。為了將該距離減小到約70-73bp,設計標識為SEQ. ID. NO. 87和SEQ. ID. NO. 88的引物，其將以正確的距離和限制位點從pTEFzeo載體擴增ScTEFl啟動子。將pTEFzeo (Invitrogen, CA)用作模板。使用FailsafePCR系統(Epicentre, Madison, WI)，通過 94°C 30 秒、57°C 30 秒和 72°C 30 秒的 30 個循環，接著為72 0C 4分鐘的最終溫育進行熱循環。在0. 8%瓊脂糖凝膠上分離PCR產物并分離460bp片段。使用標識為SEQ. ID. NO. 89和SEQ. ID. NO. 90的引物進行第二次PCR以擴增該片段。PCR產物經EcoRI消化并連接到EcoRI-消化的質粒pVR96 (圖16)。所得質粒(pVR102，圖17)具有兩個ScTEFl啟動子-第二個為驅動ScXKSl基因的啟動子。該啟動子的末端和基因的ATG之間的距離恰好為73bp。將質粒pVR102用SphI消化并連接到SphI消化的pPUC19 (NewEngland Biolabs，美國)。所得質粒(pVR103，圖18)經測序以證實ScXKSl基因處于ScTEFl啟動子和ScGALIO終止子控制下。實施例:構建含有在HisG-ScUra3_HisG盒(來自pVR65，實施例3B)旁邊的ScXKSl表達盒(來自pVR103，實施例5C)的質粒pVR104(圖19)用SphI消化質粒pVR65 (實施例3B，圖19)，并使用蝦堿性磷酸酶(RocheDiagnostics,美國)按照生產商的方案對線性化載體的5’ -磷酸末端去磷酸化。也用SphI消化質粒pVR103(實施例5C，圖18)，并將具有處于ScTEFl啟動子和ScGALIO終止子控制下的ScXKSl基因的3. 5kbp片段連接到線性化pVR65片段以得到質粒pVR104(圖 19)。實施例5E :通過轉化株系⑶804 (實施例4D)產生具有超表達的ScXKSl基因活性和缺失的木糖還原酶基因的馬克斯克魯維氏酵母突變體(CD805)使用標準電穿孔方法，將來自質粒pVR104(實施例5D，圖19)的 6. 8kbp PvuII片段用于轉化株系CD804 (實施例4D)。在YPD培養基中回收轉化的細胞，4小時后在SC-Ura板(Qbiogene，CA)上鋪平板并在37°C溫育48_72小時。72小時結束時將在SC-Ura板上生長的轉化體在新鮮SC-Ura板上再劃線培養。用菌落PCR篩選再劃線的轉化體。將經轉化株系的單個陽性菌落接種到50ml YH)培養基中并以200rpm振蕩在37°C過夜溫育。將10 ill該培養物鋪平板在5-F0A板上并在37 °C過夜溫育。由于HisG區的重組，生長的菌落抗5-F0A并且預期丟失了 ScUra3基因。用標識為SEQ. ID. NO. 91和SEQ.ID. NO. 92的引物進行PCR以擴增指示完整ScXKSl基因的700bp區域和 Ikb的HisG基因。設計標識為SEQ. ID. NO. 93和SEQ. ID. NO. 94的第二個引物組以用于擴增ScXKSl和所述基因末端之間的 Ikbp產物。這兩個引物組證實ScXKSl基因已經整合到轉化體的染色體中，并且ScUra3基因已經通過HisG區的自發重組除去。該株系標記為⑶805并且用于進一步試驗增加的木酮糖激酶蛋白質活性。
設計標識為SEQ. ID. NO. 91和SEQ. ID. NO. 93的引物以擴增ScTEFl啟動子和ScXKSl基因末端間的 2. 6kbp產物。設計標識為SEQ. ID. NO. 92和SEQ. ID. NO. 95的引物以擴增ScXKSl基因和所述片段開始處之間的 I. 7kbp產物。這兩個引物組證實ScXKSl基因已經整合到株系⑶805的染色體中。木酮糖激酶活性測定:將單獨的帶擋板搖瓶(250ml容量)接種株系CD804(實施例4D)和CD805(實施例5E)。將搖瓶置于35°C，以250rpm振蕩并過夜生長。培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成。16小時后以4000G離心細胞5分鐘，用IOOmM磷酸鈉緩沖液洗滌并重懸浮在0. 5ml破裂緩沖液中。破裂緩沖液由溶于200ml體積的IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)、lmM DTT、40mgPMSF(溶于500 y I DMS0)和4片蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche)組成。用玻璃珠(Invitrogen, CA)機械裂解細胞并以14，000G離心15分鐘。移取上清液并根據試劑盒方案(Amersham Bioscience)通過F1D-IO脫鹽柱運行。將10 u I提取物加入30°C平衡的80 u I XuK混合物中(含有6Img Na2ATP 3H20,10. OmlO. IMHEPES/K0H(pH7. 5), I. 2ml0. IM MgCl2 (稀釋至Ij 16. 0ml)，和 IOu 120mM 木酮糖，總體積為100ml。用水代替木酮糖作為空白。通過煮沸2分鐘并轉移到冰上結束反應。加入900 illHek2 (40mM HEPES/K0H(pH7. 5)，IOmM MgCl2, 2. 5mM PEP 和 0. 2mM NADH)并以 14，000G 離心10分鐘。將上清液轉移到分光光度計比色杯，并確定最初340nm基線吸收。加入10 yl肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶的I : I : I混合物并測量最終吸收。用Advanced ProteinAssay Reagent (Cysoskeleton#ADV01)以BSA作為標準測定總蛋白質。株系CD804的木麗糖激酶活性測量為69. 7+/-8. 0mU/mg，而株系CD805的為400. 8+/-102. 7mU/mg，表明CD805具有超表達的ScXKSl活性。實施例6A :構建含有馬克斯克魯維氏酵母木糖醇脫氫酶(KmXYL2)基因的上游和下游側翼和處于ScroCl啟動子和ScGALIO終止子控制下的大腸桿菌hph基因的質粒PCM23 (圖 20)用SEQ. ID. NO. 96和SEQ. ID. NO. 97所示的引物從基因組PCR擴增含有馬克斯克魯維氏酵母木糖醇脫氫酶(KmXYL2)基因的啟動子區的988bp片段。用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen, CA)，通過 94°C 30 秒、52°C 30 秒、68°C I 分鐘的 35 個循環，接著為 68°C 8 分鐘的最后溫育進行熱循環。將產物克隆到TOPOII載體(Invitrogen，CA)。質粒pUC19(NewEngland Biolabs,美國)用EcoRI消化并在I. 0%凝膠上分離。從pUC19質粒分離2. 686kbp帶并連接到通過用EcoRI消化從TOPOII質粒釋放的片段，從而產生 3. 674kbp質粒，將其稱作pCM20。用三組引物從基因組PCR擴增含有KmXYL2的終止子序列和下游區的片段。第一組引物標識為SEQ. ID. NO. 98和SEQ. ID. NO. 99，其擴增目的下游區。用Pfx DNA聚合酶(Invitrogen，CA)，通過94°C 30秒、55°C 30秒和68°C I分鐘的35個循環，接著為68°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。第二組引物標識為SEQ. ID. NO. 100和SEQ. ID. NO. 101。用2. 5yl第一次PCR產物作為DNA模板，將第二組引物用于在兩個末端導入SphI位點。用Pfx DNA聚合酶，通過94°C 30秒、60°C 30秒和68°C I分鐘的35個循環，接著為68°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。第三組引物標識為SEQ. ID. NO. 102和SEQ. ID. NO. 103。其用2. 5 U I第二次PCR產物擴增前面的產物。用Pfx DNA聚合酶，通過94°C 30秒、47°C 30秒和68°C I分鐘的35個循環，接著為68°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。將最終產物克隆到TOPOII載體(Invitrogen, CA)中，并用SphI消化并且在I. 0%凝膠上分離。分離 I. 008kbp片段并將其連接到SphI消化的質粒pCM20(來自上面)，以形成 4. 682kbp質粒，其稱作pCM21 (圖
20)。用Sacl/Xbal消化質粒pCM21并在I. 0%凝膠上分離。分離 4. 665kbp帶并連接到通過用Sacl/Spel消化質粒pPSl(實施例1H,圖8)分離的 2. 366kbp帶。所得 7. 031kbp質粒稱作pCM23(圖20)。其含有KmXYL2基因的上游和下游側翼，它們由處于ScPDCl啟動子和ScGALIO終止子的轉錄控制下的大腸桿菌hph基因隔開。實施例6B :用來自質粒pCM23 (實施例6A，圖20)的片段從株系CD805 (實施例5E)產生馬克斯克魯維氏酵母突變體(CD806)以缺失木糖醇脫氫酶基因使用標準電穿孔方法用來自質粒pCM23的片段轉化株系CD805的單個菌落。在YPD培養基中回收經轉化的細胞并在4小時后鋪平板在YPD+150U g/ml潮霉素板上，并在37°C溫育48小時。48小時后生長在YPD+150 u g/ml潮霉素板上的86個轉化體在新鮮YPD+150 u g/ml潮霉素板上再次劃線培養。通過PCR用SEQ. ID. NO. 104和SEQ. ID. NO. 105標識的引物對轉化體篩選天然木糖醇脫氫酶的存在。用Failsafe酶(Epicentre,Wisconsin)，通過94°C 10分鐘的最初循環，94°C 30秒、50°C 30秒、72°C I分鐘的35個循環，接著為72°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。1064bp的PCR產物表明完整的木糖醇脫氫酶基因。15個轉化體不產生所預計的產物，表明木糖醇脫氫酶基因已經成功地從所述15個轉化體缺失。用標識為SEQ. ID. NO. 106和SEQ. ID. NO. 107的引物對那15個轉化體進行PCR篩選。設計該引物組以PCR擴增5’末端。陽性結果( I. 5kbp片段)表明重組體的染色體中潮霉素抗性基因片段以5’交換代替了 KmXYL2基因。設計標識為SEQ. ID. NO. 108和109的第三個引物組以PCR擴增3’末端。 Ikbp的產物表明重組體的染色體中潮霉素抗性基因片段以3’交換代替了 KmXYL2基因。在15個轉化體中，兩個顯示相應于兩種PCR產物的帶。一種標記為株系⑶806。株系⑶806具有超表達的ScXKSl基因活性并且缺失木糖脫氫 酶(KmXYL2)和木糖還原酶(KmXYLl)基因。木糖醇脫氡酶活件測定:用株系CD805 (實施例5E)和CD806 (實施例6B)接種單獨的帶擋板的搖瓶(250ml容量)。將搖瓶置于33°C，以250rpm振蕩并過夜生長。培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成。16小時后以4000G離心細胞5分鐘，用IOOmM磷酸鈉緩沖液洗滌并重懸浮在0. 5ml破裂緩沖液中。破裂緩沖液由溶于200ml體積的IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0) UmM DTT、40mg PMSF (溶于500 u I DMS0)和4片蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche)組成。用玻璃珠(Invitrogen，CA)機械裂解細胞并以14，000G離心15分鐘。移取上清液并根據試劑盒方案(Amersham Bioscience)通過F1D-IO脫鹽柱運行。將樣品加入由IOOmM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)、0. 2mM NADH和20mM木酮糖組成的測試溶液中。監視 340nm 吸收。用 Advanced Protein Assay Reagent (Cysoskeleton#ADV01)以BSA作為標準測定總蛋白質。株系⑶805 (實施例5E)的酶分析得到14. 5+/-1. 6mU/mg的酶活性，而株系⑶806的活性為0. 0+/-0. ImU/mgo這些結果表明在株系⑶806中已經缺失木糖醇脫氫酶活性。實施例7A :通過用質粒pCM28 (實施例3B，圖12)轉化株系⑶806 (實施例6B)產生具有外源PXYLA基因、超表達的ScXKSl基因活性和缺失KmXYLl和KmXYL2基因的馬克斯克魯維氏酵母突變體(CD882)
使用標準電穿孔方法用NaeI消化的質粒pCM28轉化株系CD806的單個菌落。轉化體在37°C過夜生長，并在5個相同的Sc-Ura板上劃線培養以進行篩選。使用標識為SEQ.ID. NO. 110和SEQ. ID. NO. 111的引物通過PCR驗證PXYLA基因的存在。所得轉化體(稱作⑶882)含有重構的PXYLA基因、超表達的ScXKSl基因活性并且缺失KmXYLl和KmXYL2基因。實施例7B :株系⑶882 (實施例7A)的酶和蛋白質印跡分析用結合6X 聚組氨酸尾的 Probond Ni2+螯合樹脂(Invitrogen, Carlsbad, CA,美國)柱純化來自CD882的蛋白質。將Ni-NTA-HRP綴合的探針(Qiagen，Valencia, CA，美國)用于直接檢測標記的蛋白質。對純化期間收集的級分的蛋白質印跡分析進一步證實株系 CD882 中存在 XI 蛋白質。根據“The Streptomyces rubiginosus xylose isomerase ismisfolded when expressed in Saccharomyces cerevisiae，，, Gardonyl 等人，2003 中描述的方法進行酶活性測量。該評估證實株系CD882中相同級分中的木糖異構酶活性，其中在所述級分中通過蛋白質印跡分析已經檢測到6X聚組氨酸尾PXYLA基因。實施例8A :用防止聚組氨酸尾編碼的終止密碼子構建含有重構的PXYLA基因的質粒(pCM29，圖 21)用標識為SEQ. ID. NO. 112 和 SEQ. ID. NO. 113 的引物使用 pCM17 (實施例 2B,圖 10)作為模板PCR擴增重構的PXYLA基因(實施例2A)。用Pfx DNA聚合酶，通過94°C 30秒、550C 30秒、72°C I. 5分鐘的35個循環，接著為72°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。用SbfI消化PCR產物并在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。分離1319bp產物并連接到通過用SbfI消化質粒pCM9(實施例II，圖9)得到的6829bp片段，以構建 8148bp的質粒(pCM29，圖
21)。該質粒含有處于KmP⑶I啟動子和ScCYCl終止子控制下的具有非可操作性的聚組氨酸尾的PXYLA基因和大腸桿菌hph表達盒。實施例8B :通過用質粒pCM29 (實施例8A，圖21)轉化株系⑶806 (實施例6B)產生含有非組氨酸標記的PXYLA基因、超表達的ScXKSl基因活性和缺失木糖脫氫酶和木糖還原酶基因的馬克斯克魯維氏酵母突變株系(CD861)
將通過消化pCM29所得3. 192kb PvuII/SphI片段用于使用標準電穿孔方法轉化株系CD806。在YI3D培養基中回收轉化的細胞并在6小時后在YPX+300ii g/ml G418+150u g/ml潮霉素(pH7.0)上鋪平板。30°C 5天后，已經生長了數百小菌落和一個較大的菌落。將大菌落稱作CD861。對株系⑶861進行基因組步移以確定PXYLA基因怎樣整合。發現PXYLA基因以一個以上的拷貝整合于緊靠在天然PDC基因的啟動子區的上游。一個拷貝處于存在于質粒PCM29中的 1236bpKmPDCl啟動子區的控制下，所述拷貝包括約142bp上游基因和ScCYCl終止子。另一拷貝位于緊靠在ScCYCl終止子的下游，并且包括與天然KmPDCl啟動子長度匹配的1026bp啟動子。該啟動子與pCM29和第一個拷貝中的啟動子相比缺失上游基因的142bp區和5’末端的額外的 68bp。第二個拷貝也在ScCYCl終止子的控制下。緊靠在該第二個ScCYCl終止子下游的為天然的1026bp KmPDCl啟動子，接著是天然KmPDCl基因。實施例8C CD861 (實施例8B)的木糖異構酶、木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶分析將單獨的帶擋板搖瓶(250ml容量)接種⑶806 (實施例6B)和⑶861 (實施例8B)。在250rpm振蕩下將搖瓶在30°C溫育，并過夜生長。培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成，補加了 300 u g/ml G418和150 u g/ml潮霉素。用Y-PER溶液(Pierce-Rockford, IL)裂解細胞，然后用 F1D-IO 柱(Amersham Biosciences, Piscataway,NJ)脫鹽。將由 IOOmM TES-Na0H、250mM 木糖、IOmM MgCl2、0. 6mM NADH、1U SDH(sigma)(pH7. 0)組成的受試溶液補充到I. OmL，加入100 U L細胞提取物。使用僅僅沒有木糖的相同受試溶液的空白來確定木糖異構酶活性。株系CD806的木糖異構酶活性為0，而株系CD861的為I. 07+/-0. 21U/mg粗提取物。這證實株系⑶861含有正發揮功能的木糖異構酶基因。還進行木糖還原酶、木糖醇脫氫酶和木酮糖激酶測定以驗證最終株系中的活性/活性損傷。株系CD861 (實施例8B)和株系CD683(實施例4C)單獨于由20g/L酵母提 取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成的培養基中(對于株系⑶861補加300 ii g/ml G418和150iig/ml潮霉素)生長過夜。用Y-PER溶液裂解細胞。使用Advanced ProteinAssay Reagent (Cysoskeleton#ADV01)，以BSA作為標準測定總蛋白質。株系CD861中的木糖還原酶活性為260+/-41. 8mU/mL,作為對比，株系⑶683的為516. 5+/-10. 6mU/mL。活性的 50%減小表明木糖還原酶基因的缺失，所測量的活性歸因于進行木糖向木酮糖的一些轉化的非特異性醛糖還原酶。木糖醇脫氫酶活性為對于株系⑶861為12. 4+/-4. 4mU/mL，作為對比，對于株系⑶683為110. 4+/-7. 2mU/mL。木酮糖激酶活性對于株系⑶861為370. 5+/-147. 6mU/mL，作為對比，對于 CD683 為 44. 8+/-8. 2mU/mL。實施例8D :株系⑶861 (實施例8B)中PXYLA基因的動力學分析將株系CD861的單個菌落接種在由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成的培養基中以過夜生長。通過離心收獲細胞，將其用10mlIOOmM磷酸鈉、ImMPMSF(pH7. 0)洗滌一次并再次離心。向其中加入2ml Y-PER溶液并溫和重懸浮，并將細胞溶液在室溫溫育30分鐘,其中間歇攪拌。離心細胞并用PD-10柱(Amersham Biosciences)將上清液脫鹽。如實施例8C中描述的進行酶測定，唯一不同是底物從0. 05-10mM木糖變動。從米-曼氏圖得到Km和Vmax,該曲線給出的相應的Vmax為 I. 8，相應的Km為2. 2mM木糖。Linweaver-Burk圖給出的相應的Vmax為 I. 0,相應的Km為I. 2mM木糖。
實施例8E :使用木糖醇對株系CD861 (實施例8B)中PXYLA活性的抑制研究株系CD861生長在含有各種濃度木糖醇的木糖培養基中，木糖醇是已知的木糖異構酶抑制劑。當木糖醇水平從0增加到0. 25mM時，木糖異構酶的Km加倍，且當木糖醇水平增加到0. 50mM時，木糖異構酶的Km再次加倍。實施例8F :株系⑶861 (實施例8B)中PXYLA基因的pH耐受性
將株系CD861的單個菌落接種在由10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成的培養基中以過夜生長。通過離心收獲細胞，將其用IOml IOOmM磷酸鈉、ImMPMSF(pH7.0)洗滌一次并再次離心。向其中加入2ml Y-PER溶液并溫和重懸浮，并將細胞溶液在室溫溫育30分鐘，其中間歇攪拌。完全一樣的受試溶液由溶于900L體積的IOOmMTES-NaOHUOmM MgCl2、0. 6mM NADH、250mM 木糖和 IU SDH 組成，使用 5M 乳酸(Sigma，美國)將其分別調節為PH7. 0,6. 6,5. 9,4. 6和3. 8。向受試溶液中加入100 u L酶或者其稀釋液以使終體積達到lmL。如實施例8C中所述測量酶活性。在pH6. 5得到最適活性。在pH5. 9時，蛋白質保留45%的最大活性。 實施例9A :株系CD806 (實施例6B)、CD861 (實施例8B)和CD882 (實施例7A)的
微需氧搖瓶表征將株系⑶806、⑶861和⑶882的單個菌落分別接種在IOOml培養基中以過夜生長，所述培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成，補加了 300 yg/ml G418和300 u g/ml潮霉素。測定細胞干重并離心適宜體積的培養基得到2g細胞干重(gcdw),并重懸浮在由20g/L酵母蛋白胨、10g/L酵母提取物、50g/L木糖和IOmM MgCl2,pH7. 0組成的培養基中。將細胞置于250mL帶擋板的搖瓶中并置于30°C以70rpm振蕩。株系⑶806產生唯一產物0. 7g/L木糖醇。株系⑶882產生3. 8g/L木糖醇和0. 4g/L乙酸作為其僅可測量的產物。株系⑶861產生13. 5g/L乙醇、0. 4g/L木糖醇和少量甘油、乙酸和琥珀酸(共< 2g/L)。實施例9B CD806 (實施例6B)、CD861 (實施例8B)和CD882 (實施例7A)的管式搖瓶表征將株系⑶806、⑶861和⑶882的單個菌落分別接種在IOOml培養基中以過夜生長，所述培養基由20g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和100g/L右旋糖組成，補加了 300 yg/ml G418和300 u g/ml潮霉素。將每個株系的50ml過夜生長物離心,然后重懸浮在25ml生產培養基中，所述生產培養基由20g/L酵母蛋白胨、10g/L酵母提取物、50g/L木糖和IOmMMgCl2,pH7組成。將細胞懸浮物的Iml等分試樣加入到50ml Falcon管中的45ml生產培養基中并測定最初OD(見OD值附錄)。該測定重復數次以確保整個實驗中可以采集足夠樣品。將管置于生產條件33°C和200rpm中。在這些條件下株系⑶861產生21g/L乙醇并顯示出0. 3g/L-小時的體積生產力。株系⑶806不能消耗木糖。株系⑶861和⑶882都能夠厭氧生長。實施例10A :構建含有處于ScPGK啟動子和ScGALIO終止子控制下的瑞士乳桿菌(L. helveticus)L-乳酸脫氫酶基因(LhLDH)和沒有側翼His重復序列的ScUra3基因的質粒 pVRl 13 (圖 22)使用質粒pCM28(實施例3B,圖12)作為模板和標識為SEQ. ID. NO. 114和SEQ.ID. NO. 115的引物進行PCR以導入SphI位點同時除去側翼HisG重復序列。使用Taq DNA聚合酶(Qiagen，美國)，通過94°C 10分鐘的最初循環，然后為94°C 30秒、45°C 30秒、72°C 1.4分鐘的35個循環，接著為72°C 8分鐘的最后溫育進行熱循環。用SphI消化所得質粒以得到 I. 45kbp片段，其含有ScUra3基因而無側翼HisG重復序列。將含有處于ScPGK啟動子和ScGALIO終止子控制下的瑞士乳桿菌乳酸脫氫酶(LhLDH)基因和處于ScPGK啟動子和ScGALIO終止子控制下的G418抗性標記基因的質粒(W003/102152A1的圖6和實施例IE中標識為pVR39)用SphI消化以產生 5. 16kbp片段。將該 5. 16kbp片段連接到上面的 I. 45kbp片段以形成 6. 6Ikbp質粒(pVR113，圖22)。實施例IOB :通過用質粒pVR113 (實施例10A，圖22)轉化株系CD861 (實施例8B) 產生含有外源乳酸脫氫酶基因、無組氨酸標記PXYLA基因、超表達的ScXKSl基因活性和缺失木糖脫氫酶和木糖還原酶基因的馬克斯克魯維氏酵母突變株系(CD896)用標準電穿孔方法用質粒pVR113轉化株系CD861的單個菌落。在YPD中回收轉化的細胞4小時，隨后在Sc-Ura板上鋪平板。通過PCR篩選LhLDH/ScUra3盒選擇一個陽性轉化體(株系CD896)。用木糖異構酶和木酮糖激酶引物，轉化體顯示出陽性PCR結果，對于木糖還原酶和木糖醇脫氫酶引物則顯示出陰性結果。實施例IOC :株系⑶896 (實施例10B)的搖瓶表征將株系CD896(實施例10B)的單個菌落接種到50mL YPD(250ml帶擋板搖瓶中10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和100g/L葡萄糖)并在37°C以250rpm生長16小時。將該培養物的3gcdw接種到搖瓶(微需氧)和250mL玻璃瓶(厭氧)中的YP (10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨)和50g/L木糖和23g/L CaCO3中。搖瓶在42°C溫育并以隨機事件間隔抽取樣品用于進行HPLC。在微需氧條件下株系CD896的發酵得到39g/L的L-乳酸滴度和對于所消耗的木糖的77% -79%的得率。產生的L-乳酸的容量生產力為lg/L/小時，而最初木糖消耗速率為I. 0到I. 4g/L/小時。在厭氧生產條件下，株系⑶896在YP+50g/L木糖+23g/L碳酸鈣上發酵在前24小時產生10g/L L-乳酸，隨后木糖消耗停止。實施例IlA :構建含有有(pCM31，圖23)和沒有(pVR118，圖24)編碼的聚組氨酸尾的重構PXYLA基因以及無側翼His重復序列的ScUra3基因的重復質粒設計該實驗以闡明聚組氨酸標記對重構的PYXLA基因活性的影響。將5 y gpCM14(實施例3A，圖11)用SphI消化并在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。分離 5889bp產物并將其連接到通過用SphI消化質粒pVR113(實施例10A，圖22)得到的1450bp片段，以形成 7339bp質粒(pCM31，圖23)。質粒pCM31含有處于KmPDCl啟動子和ScCYCl終止子控制下的具有聚組氨酸尾的PXYLA基因與ScUra3表達盒。分別地，將5 y g質粒pCM29 (實施例8A，圖21)用SphI消化并在I. 0%瓊脂糖凝膠上電泳分離。分離 5892bp產物并將其連接到通過用SphI消化質粒pVR113得到的1450bp片段，以形成 7342bp質粒(pVRl 18，圖24)。質粒pVR118類似于質粒PCM31，但是含有防止聚組氨酸尾編碼的終止密碼子。實施例IlB :通過用質粒pCM31 (實施例11A，圖23)和pVRl 18 (實施例11A，圖24)轉化株系⑶806 (實施例6B)產生含有(⑶929)和沒有(⑶931)編碼的聚組氨酸尾的重構的PXYLA基因、以及沒有側翼His重復序列的ScUra3基因的馬克斯克魯維氏酵母突變株系用標準電穿孔方法用質粒pCM31轉化馬克斯克魯維氏酵母株系CD806 (實施例6B)的單個菌落。在Yro培養基中回收轉化的細胞，4小時后在Sc-Ura板上鋪平板。通過PCR證實兩個轉化體含有重構的PXYLA基因(具有編碼的聚組氨酸標記)和超表達的ScXKSl基因，還證實缺失了 KmXYLl和KmXYL2基因。這些轉化體之一命名為株系⑶929。用標準電穿孔方法用質粒pVR118轉化馬克斯克魯維氏酵母株系⑶806。通過PCR證實轉化體含有重構的PXYLA基因(沒有編碼的聚組氨酸標記)和超表達的ScXKSl基因，并且缺失了 KmXYLl和KmXYL2基因，將該轉化體命名為株系⑶931。以對株系CD861(實施例8B)描述的相同的方式，株系CD931的基因組步移表明PXYLA基因已經整合了兩次。實施例IlC :株系CD929和CD931 (實施例11B)的搖瓶表征將⑶929和⑶931 (實施例11B)的單個菌落分別接種在250mL帶擋板的搖瓶中IOOmL 的 10g/L 酵母提取物、20g/L 蛋白胨、70g/L 葡萄糖、300ii g/ml G418+150 y g/ml 潮霉素中。培養物在35°C 250rpm下過夜溫育。將細胞接種到含有45mL生產培養基(10g/L酵母提取物、20g/L 蛋白胨、50g/L 木糖、IOOmM Tes-NaOHUOmM MgCl2, pH7. 0)的 5OmL falcon 管中，達到0D0. 2。將管置于37°C和250rpm下，在隨機時間間隔取樣并通過HPLC分析。株系CD929產生I. 7g/L EtOH并積累I. lg/L木酮糖。株系CD931產生15. 2g/L EtOH而積累
4.5g/L木酮糖。這些株系的相對性能表明當木糖異構酶基因不含有聚組氨酸標記時乙醇形成為約9倍更大。類似地，當不存在聚組氨酸尾時木酮糖形成增加了 4倍。實施例12A :通過用質粒pCM52 (圖25)轉化將KmXYL2基因再插入到株系CD861 (實施例8B);所得轉化體的搖瓶評估使用標識為SEQ. ID. NO. 116和SEQ. ID. NO. 117的引物從野生型馬克斯克魯維氏酵母株系的基因組DNA擴增KmXYL2基因以及982bp5’側翼和200bp3’側翼。這些引物導入SacII限制位點。將所得PCR產物用SacII消化并將其連接到類似消化的、蝦堿性磷酸酶處理的質粒PVR113 (實施例10A，圖22)。所得質粒命名為pCM52 (圖25)。用標識為SEQ.ID. NO. 118和SEQ. ID. NO. 119的引物篩選pCM52。對擴增的KmXYL2基因進行測序并發現其含有兩個錯誤，一個為沉默的，一個導致氨基酸改變85V — I。將質粒pCM52用PvuII消化并使用標準電穿孔方法轉化入株系⑶861 (實施例8B)。將轉化體鋪平板在Sc-Ura板上并在37°C溫育。用標識為SEQ. ID. NO. 104和SEQ.ID. NO. 105的引物擴增KmXYL2基因的編碼區并用標識為SEQ. ID. NO. 120和SEQ. ID. NO. 121的引物擴增通過KmXYL2基因的5’側翼并進入KmXYL2基因的編碼區的含有ScUra3基因的區域。對兩條鏈陽性并且顯示出KmXDH活性(XDH+轉化體)的5個轉化體被用于搖瓶分析。XDH+轉化體的KmXDH活性表明導入所述基因的錯誤沒有破壞其活性。通過將5個XDH+轉化體通過YPX板傳代兩次得到它們每一種的分離物。然后將分離物接種到YPX培養基(pH6. 5)并在35°C過夜溫育。通過離心收獲各2gcdw分離物并將其重懸浮在50ml的10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、IOmM MgCl2和7. 5g/LCaCO3中。將搖瓶在35°C和70rpm振蕩下進行生產。類似培養株系⑶861 (實施例8B)以比較KmXYL2再插入的效果。株系CD861具有0. 46g/L_小時的容量生產力和I. 47g/L_小時的木糖消耗。5個XDH+轉化體平均為70 %較低生產力和65 %較低木糖消耗。 48小時后，株系⑶861產生 14g/L乙醇和 4. 7g/L木糖醇，而5個XDH+轉化體產生 2. 8-6. 3g/L乙醇和I. 2-2. 2g/L木糖醇。約40小時后除一個之外所有XDH+轉化體都停止產生乙醇，盡管40小時后它們都繼續線性地消耗木糖。
生產開始和生產67小時后采集的細胞被裂解并使用advanced protein assayreagent (Cytoskeleton-美國)進行蛋白質定量。通過向5mg0 -NADH(Sigma)加入
2.355ml IM磷酸鈉緩沖液(pH7. 0)來制備IOX溶液，導致最終NADH濃度為I. 5mM。加入水至體積950 U L(小于樣品體積)。然后加入無細胞提取物并監視340nm吸收幾分鐘以確定背景。然后加入50 ii L 0.4M木酮糖并監視340nm吸收以確定XDH活性。生產開始時獲取的5種XDH+轉化體的XDH活性為287-374mU/mg。67小時生產后，XDH活性為62_86mU/mg。株系CD861的XDH活性在生產開始時為16mU/mg，生產67小時后為3mU/mg。實施例12B :通過用質粒pCM28 (實施例3B，圖12)轉化從株系⑶861 (實施例8B)缺失ScffiSl基因；所得轉化體的搖瓶評估將質粒pCM28分別用NaeI和PvuII線性化并使用標準電穿孔方法轉化到株系⑶861中。在YPD中回收細胞3小時，隨后將其鋪平板在Sc-Ura缺失(dropout)培養基上。將32個菌落在重復的平板上再劃線培養。將這些菌落用標識為SEQ. ID. NO. 122和SEQ.ID. NO. 123的引物進行PCR篩選以擴增ScXKSl基因的編碼區。將不能產生帶(從而表明不存在ScXKSl基因)的6個菌落在YPD中過夜溫育以允許ScUra3基因的環出，并將其鋪平板在FOA板上以選擇其中發生環出事件的菌落。將長出的菌落在YPD上再次劃線以選擇單個菌落分離物。用上面的引物篩選來自每次轉化的一個分離物，并且還篩選PXYLA、KmXYLl和KmXYL2基因的存在。進行額外的PCR篩選以篩選雙交換事件，其中將ScXKSl盒用來自質粒pCM28的PXYLA盒代替。所有6個分離物經測試對PXYLA陽性并且對KmXYLl、KmXYL2和ScXKSl基因陰性。其中的一個稱作⑶1065并送出用于進行搖瓶評估。將株系CD1065和CD861分別接種到含有50ml YPD的250ml搖瓶中，并在37°C和250rpm過夜溫育。收獲細胞并將4gcdw接種到50ml YPX中。在35°C和70rpm振蕩下溫育所述瓶。定時取出樣品以監控發酵活性。株系⑶1065顯示出10-20小時時間的滯后，在此期間它非常緩慢地消耗木糖。這歸因于天然木酮糖激酶基因的葡萄糖抑制。該誘導期后，木糖消耗速率增加，并且65小時后株系⑶1065產生約13g/L乙醇。株系⑶861更快地產生乙醇，從而在約20小時后產生約18g/L乙醇。株系⑶1065在約20小時后產生約3. lg/L木酮糖，但是之后木酮糖濃度逐漸降低。木酮糖激酶活性對于株系CD1065為約0，對于株系CD861為約417mU/mg。株系CD861的木糖消耗速率為株系CD1065的約2倍。株系CD1064的木糖異構酶活性為約0. 96U/mg，株系⑶861的木糖異構酶活性為約I. 79U/mg。這些結果表明在這些條件下木酮糖激酶的超表達顯著提高了木糖利用和乙醇產生。生產期后除去來自株系⑶861和⑶1065的細胞，在YPX板上劃線并將其置于厭氧罐中。兩者生長相當。實施例12C :通過用質粒pCM55 (圖26)轉化將KmXYLl基因再插入到株系⑶861中(實施例8B);所得轉化體的搖瓶評估使用標識為SEQ. ID. NO. 124和SEQ. ID. NO. 125的引物，從野生型馬克斯克魯維氏酵母株系的基因組DNA擴增KmXYLl基因以及890bp5’側翼和414bp3’側翼。這些引物導ASacII限制位點。將所得PCR產物用SacII消化并將其連接到類似消化的、蝦堿性磷酸酶處理的質粒PVR113 (實施例10A，圖22)。所得質粒稱作pCM55 (圖26)。用標識為SEQ.ID. NO. 118和SEQ. ID. NO. 126的引物篩選質粒pCM55，并用BstBI和SbfI的限制酶切作圖證實方向。對擴增的KmXYLl基因進行測序并發現含有三處錯誤，一個錯誤是沉默的，其他、導致氨基酸改變71V —A、112Y —H和3021 — V。將質粒pCM55用PvuII消化并使用標準電穿孔方法轉化到株系CD861中(實施例8B)。將轉化體鋪平板在Sc-Ura板上并在37°C溫育。將標識為SEQ. ID. NO. 127和SEQ. ID. NO. 128的引物用于擴增KmXYLl基因的編碼區，并將標識為SEQ. ID. NO. 121和SEQ. ID. NO. 129的引物用于擴增通過KmXYLl基因的3’側翼并進入KmXYLl基因的編碼區的含有 ScUra3基因的區域。將對兩條帶(XR+轉化體)陽性的6個轉化體用于進行搖瓶分析。通過從基本培養基再劃線到YPD上得到5種XR+轉化體每一種的分離物。然后將分離物在ΥΡΧ+300 μ g/ml G418+300 μ g/ml潮霉素上再劃線，隨后接種在YPX培養基中。然后將這些轉化體接種到含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖(pH6. 5)的培養基中，并在35°C溫育48小時。通過離心收獲每種的Igcdw并重懸浮在50ml 10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、IOmM MgCl2和7. 5g/LCaC03中。將瓶在35°C和70rpm振蕩下進行生產。使用2gcdw類似培養株系⑶861 (實施例8B)以比較KmXYLl再插入的效果。株系CD861具有O. 79g/L_小時的容量生產力和2. 02g/L_小時的木糖消耗速率 (基于2gcdw)。XR+轉化體的5種顯示出約20-50小時的滯后，且之后顯示出O. 05-0. 13g/ L-小時的體積生產力和O. 45-0. 67g/L-小時的木糖消耗速率。這5種XR+轉化體的乙醇得率為18-33%，相比而言，株系⑶861的為51%。 在生產開始和生產67小時后取出的細胞被裂解并用advanced protein assay reagent (Cytoskeleton-美國)進行蛋白質定量。將100 μ I細胞提取物稀釋液加入IOOmM 磷酸鈉、0. 5Μ D-木糖和0. 2mMNADPH，平衡到37°C的溶液的900 μ I等分試樣中。監視吸收以測定KmXYLl活性。5種XR+株系具有 34_86mU/mg的XR活性。這5種XR+轉化體的 KmXYLl活性表明導入基因的錯誤沒有破壞其活性。株系CD861的KmXYLl活性為約4mU/mg。第6種XR+轉化體顯示出19. 5mU/mg的KmXYLl活性，其比其他轉化體的活性低許多。同樣的，其比其他轉化體更類似株系CD861。該第6種XR+株系在搖瓶培養(最初的滯后期之后)的表現與⑶861相似并且約51. 5小時后產生約13. 8g/L乙醇。這些結果表明天然XR活性對這些株系在這些條件下將木糖發酵成乙醇的能力具有不利影響。實施例12D :通過用質粒pCM58 (圖27)轉化將KmXYXl和KmXYL2基因再插入株系 CD861 (實施例8B);所得轉化體的搖瓶評估以和對質粒pCM52 (實施例12A，圖25)所描述的相同方式構建質粒，只是KmXYL2 基因側翼以與質粒PCM52相反方向定向。該質粒命名為pCM53。對質粒pCM53中的KmXYL2 基因進行測序并發現含有四處錯誤，其中的3處是沉默的，另一處產生氨基酸2601 — V的突變。使用標識為SEQ. ID. NO. 130和SEQ. ID. NO. 131的引物，從野生型馬克斯克魯維氏酵母株系的基因組DNA擴增KmXYLl基因以及該基因的5’側翼區和3’側翼區。這些引物引入SacI和NotI限制位點。用SacI和NotI消化所得PCR產物并將其連接到類似消化的質粒pCM53。將所得質粒稱作pCM58 (圖27)。用標識為SEQ. ID. NO. 66和SEQ. ID. NO. 119 的引物篩選質粒PCM58，并用ScaI和XmnI的限制酶切作圖證實方向。對擴增的KmXYLl基因進行測序并發現含有兩處錯誤，一個是沉默的并且另一個導致氨基酸改變7IV — A。用標準電穿孔方法，將質粒PCM58用PvuII消化并轉化入株系⑶861 (實施例8B)。將轉化體鋪平板在Sc-Ura板上并在37°C溫育。用標識為SEQ. ID. NO. 132和SEQ. ID. NO. 133 的引物擴增KmXYLl基因的編碼區并用標識為SEQ. ID. NO. 134和SEQ. ID. NO. 105的引物擴增含有KmXYL2基因和側翼的區域。5個轉化體對兩條帶都是陽性并將它們用于進一步分析。將5個所選轉化體接種在含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖 (pH6. 5)的液體培養基中并在35°C溫育48小時。通過離心收獲每一種的4gcdw并將其重懸浮在50mll0g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨、50g/L木糖、IOmM MgCl2和7. 5g/L CaCO3中。 將瓶在35°C和70rpm振蕩下進行生產。類似培養株系⑶861 (實施例8B)以比較KmXYLl和 KmXYL2再插入的效果。株系⑶861在30小時內基本上消耗掉所有木糖，在那時產生16. lg/L乙醇。株系 ⑶861的乙醇得率為67%。5個XR+、XDH+轉化體都更慢地消耗木糖，并產生約16%的平均乙醇得率。株系CD861產生10%的木糖醇得率，但是5種轉化體的平均木糖醇得率為56%。 株系CD861的木糖還原酶活性為約2mU/mg，而培養73. 5小時后在轉化體中的木糖還原酶活性為126-425mU/mg。株系⑶861中的木糖醇脫氫酶活性為0，但是在培養73. 5小時后轉化體中的木糖醇脫氫酶活性為21到98mU/mg。這些酶活性的增加表明再插入的KmXYLl和 KmXYL2基因在5種轉化體中都發揮功能。株系⑶861中的木糖異構酶活性( 131mU/mg) 高于所述5種轉化體中的活性( 26-45mU/mg)。然而，所存在的木糖醇可能抑制了 5種 XR+> XDH+轉化體中的木糖異構酶活性，從而導致人工低值。該數據還表明在這些發酵條件下，醛糖還原酶/木糖醇脫氫酶途徑的缺失或破壞對于具有外源木糖異構酶基因的株系是有益的。實施例13A :構建用于Candida sonorensis轉化的XDH-祀定質粒pMI410 (圖29) 如W003/049525 所述得到 C. sonorensis (ATCC 保藏號 32109)的基因組 DNA。使用具柄畢赤氏酵母XYL2 基因(K^tter等人 1990Curr. Genet, 18 =493-500)作為探針篩選W003/049525中描述的C. sonorensis λ文庫的一部分。使用Random Primed Labeling Kit (Boehringer Mannheim)用 32P_dCTP 標記 XYL2 基因。通過在含有 6xSSC 5xDenhardt’ s0. 5% SDS100g/ml變性鯡精DNA的溶液中55°C下過夜溫育來進行雜交。雜交后將濾器在室溫下在2xSSC溶液中洗滌5分鐘并重復洗滌，然后在55°C在2xSSC-0. ISDS 中洗滌30分鐘。這導致含有C. sonorensis木糖醇脫氫酶基因(CsXDH)的雜交克隆的分離。用標識為SEQ. ID. NO. 135和SEQ. ID. NO. 136的引物和用CsXDH基因作為模板經 PCR擴增CsXDH基因的5’區。將PCR產物用SacI和SalI切割以產生642bp片段，將其凝膠分離。通過用XbaI切割質粒pMI278 (描述于W003/049525的圖14)并環化所得4976bp 片段來制備質粒PMI281。將來自上面的642bp片段連接到通過用SacI和SalI消化質粒 PMI281得到的4965bp片段。所得質粒命名為pMI409(圖28)。使用標識為SEQ. ID. NO. 137和SEQ. ID. NO. 138的引物和用相同入文庫克隆作為模板經PCR擴增CsXDH基因的3’區。用NotI和ApaI切割PCR產物。凝膠分離457bp片段并將其連接到通過用NotI和ApaI消化質粒pMI409得到的5551bp片段。所得質粒命名為 pMI410(圖 29)。實施例13B :構建用于C. sonorensis轉化的XR-靶定質粒pMI412(圖31)
使用標識為SEQ. ID. NO. 139 和 SEQ. ID. NO. 140 的寡核苷酸和用 C. sonorensis 的基因組DNA作為模板通過PCR擴增木糖還原酶的序列同源物。基于在已知的真菌木糖還原酶和醛糖還原酶序列中發現的保守序列設計寡核苷酸。標記700bp PCR產物并將其用作探針從W003/049525中描述的基因組文庫類似地分離基因組CsXR λ克隆。使用標識為SEQ. ID. NO. 141 和 SEQ. ID. NO. 142 的引物經 PCR 擴增 C. sonorensis 木糖還原酶(CsXR)基因的5’區。將含有CsXR基因的在W003/049525中描述的 C. sonorensis λ文庫克隆的一部分用作模板。用SacI和SalI切割PCR產物。凝膠分離 526bp片段并將其連接到通過用SacI和SalI消化質粒pMI281得到的4965bp片段中。將所得質粒命名為PMI411 (圖30)。用標識為SEQ. ID. NO. 143和SEQ. ID. NO. 144的引物和用相同入文庫克隆作為模板經PCR擴增CsXR基因的3’區。用NotI和ApaI切割PCR產物。凝膠分離591bp片段并將其連接到通過用NotI和ApaI消化質粒pMI411得到的5435bp片段中。所得質粒命名為 pMI412(圖 31)。實施例13C :構建PXYLA表達質粒pMI417(圖33)以用于在C. sonorensis中同時插入PXYLA和缺失CsXR用標識為SEQ. ID. NO. 145 和 SEQ. ID. NO. 146 的引物和用 pCM29 (實施例 8A,圖 21) 作為模板經PCR擴增從ATG到單個AgeI位點的PXYLA基因。用AgeI和KpnI切割PCR產物并凝膠分離453bp片段。用AgeI切割質粒pCM29。凝膠分離8151bp片段并用KpnI部 分消化。凝膠分離所得6501bp片段并將其連接到453bp PCR片段。將該質粒命名為pMI400。用BamHI切割質粒pMI278，用克列諾(Klenow)酶進行填補并用XbaI部分消化。 凝膠分離所得6675bp片段。將質粒pMI400用SbfI切割，用T4聚合酶使其平端化，并用 XbaI切割。凝膠分離所得1358bp片段并將其連接到pMI278的6675bp片段以形成質粒 pMI403(圖 32)。用Sall和NotI切割質粒pMI412 (實施例13B,圖31)。分離4037bp片段并將其連接到通過用SalI和NotI消化pM1403所得的5042bp片段。所得質粒命名為pMI417 (圖 33)。質粒pMI417含有PXYLA基因和G418標記基因，其中相關的啟動子和終止子區在CsXR 基因的上游和下游區之間。PXYLA基因處于C. sonorensis PGK啟動子和ScGALIO終止子的控制下。實施例13D :構建ScXKSl表達質粒pMI425 (圖34)以在C. sonorensis轉化中同時插入ScXKSl和缺失CsXDH用標識為SEQ. ID. NO. 147 和 SEQ. ID. NO. 148 的引物和用 pVR103 (實施例 5C,圖 18) 作為模板經PCR擴增從ATG到單一 BglII位點的ScXKS15，區。用NotI和BglII切割PCR 產物并凝膠分離267bp片段。用NotI和BglII切割質粒pVR103 (實施例5C，圖18)。得到 4633bp片段并將其連接到267bp PCR片段。將該質粒命名為pMI406。用EcoNI切割質粒pMI403(實施例13C，圖32)，用克列諾酶進行填補并用SalI切害I]。凝膠分離6505bp片段。用BamHI切割質粒pMI271 (W003/049525的圖7中描述的)，用克列諾酶進行填補并用SalI切割。凝膠分離所得1666bp片段并將其連接到6505bp片段。 所得質粒命名為PMI423。將質粒pMI410 (實施例13A，圖29)和質粒pMI406每種用XbaI消化，用小牛腸堿性磷酸酶去磷酸化并用BamHI切割。凝膠分離5032bp和1814bp片段。用XbaI消化質粒 PMI423并凝膠分離所得2817bp片段。連接三個片段并將所得質粒命名為pMI425(圖34)。 質粒pMI425含有CsXDH基因的啟動子區的一部分，具有相關的啟動子和終止子區的hph基因，處于C. sonorensis PGK啟動子和ScGALIO終止子控制下的ScXKSl基因，接著是CsXDH 基因的終止子區的一部分。實施例13E :產生含有重構的PXYLA基因和ScXKSl基因的C. sonorensis突變株系(Cs/T-1、Cs/T-25、SC/T-34 和 Cs/T-51)使用類似于W003/049525中描述的化學方法用質粒pMI417 (實施例13C，圖33)和 PMI425 (實施例13D，圖34)轉化C. sonorensis菌落。將轉化細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml G418 或 YPD+200 μ g/ml 潮霉素和 200 μ g/ml G418 上。用 PXYLA 和 ScXKSl 探針進行 PCR 分析證實存在如下株系株系Cs/T-1:1 拷貝 PXYLA 和 I 拷貝 ScXKSl株系CS/T-25:1 拷貝 PXYLA 和 2 拷貝 ScXKSl、
株系Cs/T-51:2 拷貝 PXYLA 和 I 拷貝 ScXKSl株系CS/T-34:2 拷貝 PXYLA 和 2 拷貝 ScXKS I實施例13F :通過用質粒pMI417(實施例13C，圖33)轉化產生含有重構的PXYLA基因且有和沒有CsXR基因缺失的C. sonorensis突變株系(Cs/417_201、-206、-208和-214)用SacI和ApaI消化質粒pMI417，并將其用于使用與W003/049525中描述的相似的化學方法轉化C. sonorensis菌落。將轉化的細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml G418上。PCR 分析鑒定了具有PXYLA基因和CsXR缺失的菌落。DNA印跡分析證實，除了 CsXR缺失外，稱作Cs/417-206的株系含有一個拷貝的PXYLA基因，而稱作Cs/417_214的株系含有兩拷貝 PXYLA基因。株系Cs/417-201含有兩拷貝PXYLA基因，但是無CsXR缺失。Cs/417-208含有一拷貝的PXYLA基因并且沒有CsXR缺失。實施例13G:通過用質粒pMI425(實施例13D，圖34)轉化Cs/417-214 (實施例 13F)產生含有重構的PXYLA基因、ScXKSl基因、缺失CsXR和缺失⑷和不缺失(B)CsXDH 基因的 C. sonorensis 突變株系(Cs/417_214/425A 和 Cs/417_214/425B)將質粒pMI425用PmeI和PspOMI消化并將其用于轉化株系Cs/417-214，其中使用與W003/049525中描述的相似的化學方法。將轉化細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml潮霉素或YPD+200 μ g/ml潮霉素+200 μ g/ml G418上。用PCR和DNA印跡分析鑒定含有ScXKSl 基因的菌落并確定是否已經發生了 CsXDH基因的缺失。將具有兩拷貝重構的PXYLA基因、 I拷貝ScXKSl基因、缺失CsXR基因和缺失CsXDH基因的株系命名為Cs/417-214/425A。將具有兩拷貝重構的PXYLA基因、I拷貝ScXKSl基因、缺失CsXR基因但不缺失CsXDH基因的株系命名為 Cs/417-214/425B。實施例13H :通過用質粒pMI403 (實施例13C，圖32)轉化產生含有重構的PXYLA 基因和功能性乳酸脫氫酶(LDH)基因的C. sonorensis突變株系(C29/403-7)使用類似于W003/049525所描述的化學方法，用質粒pMI403轉化相應于 W003/049525中標識為株系246-27的突變C. sonorensis株系。株系246-27含有功能性外源乳酸脫氫酶(LDH)基因。將轉化細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml G418上。將顯示出70mU/ mg XI活性的株系稱作C29/403-7。其明顯含有處于CsPGK啟動子和ScGALIO終止子控制下的PXYLA基因的多個拷貝。此外，株系C29/403-7含有功能性乳酸脫氫酶基因。實施例131 :通過用質粒pMI425 (實施例13D，圖34)轉化株系C29/403-7 (實施例 13H)產生含有重構的PXYLA基因、ScXKSl基因和功能性LDH基因的C. sonorensis突變株系(C29/403-7/425)將質粒pMI425用SalI和NotI消化并用于轉化株系C29/403-7 (實施例13H)，其中使用類似于W003/049525中描述的化學方法。將轉化細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml潮霉素和在YPD+200 μ g/ml潮霉素和200 μ g/ml G418上。用PCR和DNA印跡分析鑒定含有 PXYLA和ScSKSl基因的轉化體，將它們統稱為C29/403-7/425。株系C29/403-7/425含有功能性乳酸脫氫酶基因。
實施例13J:產生含有重構的PXYLA基因和缺失CsXR基因的C. sonorensis突變株系(C29/417-4 和 C29/417-9)將質粒pMI417(圖13C，圖33)用SacI和ApaI消化并用于轉化相應于W003/049525 中標識為株系246-27的突變C. . sonorensis株系，其中使用類似于W003/049525中描述的化學方法。將轉化細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml G418上。PCR分析鑒定了具有PXYLA基因和CsXR缺失的菌落。DNA印跡分析證實，除CsXR缺失外，稱作C29/417-4的突變株系含有一拷貝的PXYLA基因，稱作C29/417-9的突變株系含有2拷貝PXYLA基因。實施例13K :通過用質粒pMI425(實施例13D，圖34)轉化株系C29/417-9 (實施例13J)產生含有重構的PXYLA基因、ScXKSl基因、LDH基因、缺失CsXR基因和缺失 (C29/417-9/425-11)和沒有缺失(C29/417-9/425-9) CsXDH 基因的 C. . sonorensis 突變株系將質粒pMI425用PmeI和ApaI消化并用于轉化株系C29/417-9 (實施例13J)，該轉化使用類似于W003/049525中描述的化學方法。將轉化的細胞鋪平板在YPD+200 μ g/ml 潮霉素上。PCR分析鑒定了具有ScXKSl基因的菌落和還含有CsXDH缺失的菌落。將具有和沒有CsXDH缺失的轉化體分別命名為C29/417-9/425-11和C29/417-9/425-9。實施例14 :來自實施例13E-13K的C. sonorensis株系的搖瓶表征下面的表格概述了選擇用于搖瓶表征的株系并報導了木糖異構酶和木酮糖激酶活性。產生乙醇的株系
權利要求
1.基因修飾酵母細胞，其具有整合到其基因組中的功能性外源木糖異構酶基因，其中所述外源木糖異構酶基因(a)與SEQ. ID. NO. 162至少90%同源，或(b)編碼與SEQ.ID. NO. 163至少90%同源的木糖異構酶，或(c)與SEQ. ID. NO. 151至少80%同源，但與SEQ.ID. NO. 58的同源性不超過95%，或(d)產生與SEQ. ID. NO. 152至少80%同源，但與SEQ.ID. NO. 59的同源性不超過95%的酶，并且所述外源木糖異構酶基因可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列，且所述經修飾的酵母細胞還具有天然基因的缺失或破壞，所述天然基因產生催化木糖向木糖醇轉化的酶。
2.權利要求I的基因修飾酵母細胞，其中所述產生催化木糖向木糖醇轉化的酶的天然基因是功能性木糖還原酶基因。
3.權利要求I或2的基因修飾酵母細胞，其還具有功能性天然木糖醇脫氫酶基因的缺失或破壞。
4.權利要求1-3任一項的基因修飾酵母細胞，其超表達功能性木酮糖激酶。
5.權利要求4的基因修飾酵母細胞，其含有可操作地連接在酵母細胞中有功能的啟動子和終止子序列的功能性外源木酮糖激酶基因。
6.權利要求5的基因修飾酵母細胞，其中所述功能性外源木酮糖激酶基因是啤酒糖酵母木酮糖激酶基因。
7.權利要求1-6任一項的基因修飾酵母細胞，其屬于克魯維氏酵母屬、假絲酵母屬、畢赤氏酵母屬、酒香酵母屬、管囊酵母屬或糖酵母屬。
8.發酵方法，其中在發酵條件下在發酵液體培養基中培養權利要求1-7任一項的細胞，所述發酵液體培養基包含木糖、木聚糖或者木糖的其他寡聚體。
9.權利要求8發酵方法，其中產生作為主要發酵產物的乙醇。
10.權利要求8-9任一項的發酵方法，其中所述發酵液體培養基還包括己糖。
全文摘要
本發明涉及基因修飾酵母物種和使用基因修飾酵母的發酵方法。具體地，用外源木糖異構酶基因轉化酵母細胞。額外的基因修飾增強了所轉化的細胞將木糖發酵成乙醇或者其他希望的產物的能力。那些修飾包括缺失非特異或特異的醛糖還原酶基因、缺失木糖醇脫氫酶基因和/或超表達木酮糖激酶。
文檔編號C12N15/81GK102703336SQ20121016222
公開日2012年10月3日 申請日期2004年5月3日 優先權日2003年5月2日
發明者A·阿里斯蒂多, C·米勒, K·科伊武蘭塔, L·羅霍寧, M·伊爾門, M·彭蒂萊, P·索米寧, S·奧爾森, V·拉加希亞 申請人:卡吉爾公司