專利名稱：一種用海藻酸鈉-殼聚糖固定磷脂酶A₂的方法
技術領域：
本發明涉及一種固定磷脂酶A2的方法。
背景技術：
磷脂酶A2 (PLA2)是一類能夠在磷脂甘油部分的Sn-2位點選擇性斷裂酯鍵的酶，其可將磷脂水解成一系列生物活性介質；由于PLA2酶源來自豬胰腺，相對短缺，未推廣開。最早將酶法脫膠用于工業生產的是德國Lurgi公司，國內也有不少相關報道，現今用于脫膠的酶主要是 Novo 公司推出的 Lecitase IOL (PLA2), Lecitase Novo (PLA1)和 LecitaseUltra(PLA1)0其中，豬胰臟來源的磷脂酶LecitaselOL已不用于油脂脫膠，而被更具優勢的微生物Rohalase MPL(PLA2)所代替。但是，游離的Rohalase MPL (PLA2)價格昂貴，不易回收，而且對條件要求較高，不 能夠適應苛刻的水解條件。而對于固定化磷脂酶A2來講，其有以下優勢(a)易于將固定化酶與底物、產物分開，方便后續的分離和純化；(b)酶的穩定性和最適溫度提高，最適pH值改變，對溫度和pH值適應范圍增大，對抑制劑和蛋白酶敏感性降低；(C)可以增加產物的收率，提高產物質量；(d)可以在較長時間內連續生產；(e)酶反應條件容易控制；(f)較水溶性酶更適合于多酶反應；(g)酶的使用效率高，使用成本低；(h)適于產業化、連續化、自動化生廣等。制備固定化酶的方法主要有吸附、包埋、共價鍵結合和交聯法等，其中包埋法不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點。海藻酸鈉、殼聚糖是最為常見的包埋材料，因此可用其來作為固定化酶的載體。二價金屬離子如Ca2+與可溶性海藻酸鈉反應生成海藻酸鈣微凝膠，而海藻酸鈉、殼聚糖可與戊二醛基形成SchifT氏堿，在膠囊表面形成一層致密的保護膜，可增加微膠囊球的強度。以海藻酸鈉-殼聚糖為包埋材料，戊二醛為交聯劑，固定化PLA2，最終選擇出最優的固定化條件。

發明內容
本發明是為了解決酶法脫膠過程中，游離磷脂酶A2易失活變性且不易回收、但是現今磷脂酶A2的固定化未見報道的問題，而提出的用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法。用海藻酸鈉-殼聚糖復合載體固定化磷脂酶A2的方法通過以下步驟實現一、磷脂酶A2的固定化。二、固定化酶酶活力的測定。三、海藻酸鈉-殼聚糖固定化條件的優化。四、通過固定化酶微球的SEM圖像進一步解釋利用海藻酸鈉-殼聚糖復合載體固定化磷脂酶的優勢。采用海藻酸鈉-殼聚糖作為載體固定化磷脂酶A2,海藻酸鈉-殼聚糖作為載體，不需要化學修飾酶蛋白的氨基酸殘基，具有反應條件溫和、很少改變酶分子結構、酶活力損失小等優點；此外，海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2最終得到的固定化酶微球機械強度好，酶活回收率可以達到74. 8%，對于油脂精煉中的酶法脫膠工藝具有重要指導意義。
具體實施例方式具體實施方式
一用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法通過以下步驟實現一、固定化磷脂酶A2的制備稱取一定量的海藻酸鈉在40°C水浴中保溫溶解，同時稱取一定量的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解，再向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混勻。用移液槍準確移取Iml稀釋10倍的酶液于一定濃度的IOmL海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的IOmL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度的IOmL殼聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以轉速180r/min攪拌，形成光滑的微膠囊球，再加入一定濃度戊二醛，同時快速攪拌，將其置于4°C環境固定化一定時間。將微膠囊以 pH8. ONaHCO3^O. lmol/L NaCl、0. lmol/L pH5. 5NaAc、pH8. 0 Tris-HCl順序洗滌后，然后進行冷凍干燥；二、固定化酶酶活力的測定；三、測定酶活力進而計算酶活回收率；四、固定化條件的優化分別在海藻酸鈉濃度O. 5% 3.0%，殼聚糖濃度為I. 0% 3. 5%，氯化鈣濃度為O. lmol/L O. 35mol/L，戊二醛濃度為O. 2%
0.45%,交聯時間為3. 5h 8. 5h的條件下,通過測定固定化酶活力回收率得到最佳的固定 化條件；五、采用響應面法進行分析討論最終確定最佳固定化條件；六、通過固定化酶微球的SEM圖像進一步解釋利用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的優勢。
具體實施方式
二 本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將將濃度為I. 5% 2. 5%的海藻酸鈉在40°C水浴中保溫溶解的條件下進行磷脂酶A2的固定化。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
三本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中將濃度為
1.5% 2. 5%的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解的條件下進行磷脂酶A2的固定化。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
四本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入濃度為O. 2mol/L O. 3mol/L的CaCl2溶液，對磷脂酶A2進行固定化。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
五本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中向形成的光滑微膠囊球的混合溶液中加入濃度為O. 25% O. 35%的戊二醛，對磷脂酶A2進行固定化。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
六本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟四中交聯時間6. 5h 7. 5h，對磷脂酶A2進行固定化。其它步驟與具體實施方式
一相同。
具體實施方式
七本實施方式與具體實施方式
一的不同點在于步驟五中采用響應面分析法進一步分析最佳固定化條件。其它步驟與具體實施方式
一相同。
權利要求
1.ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定磷脂酶A2的方法，其特征在于用海藻酸鈉-殼聚糖復合載體固定磷脂酶A2通過以下步驟實現 步驟ー在40°C水浴中分別保溫溶解濃度為0. 5% 3. 0%的海藻酸鈉，同時稱取一定量的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解，再向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入一定量的CaCl2溶液，充分混勻。用移液槍準確移取Iml稀釋10倍的酶液于一定濃度的IOmL海藻酸鈉溶液中，攪拌均勻。靜止一段時間后，用滅菌后的IOmL注射器吸入上述混合液，以約5滴/s注入一定濃度的IOmL殼聚糖醋酸溶液、CaCl2混合溶液中，以轉速180r/min攪拌，形成光滑的微膠囊球，再加入一定濃度戊ニ醛，同時快速攪拌，將其置于4°C環境固定化一定時間。將微膠囊以 pH8. ONaHCO3>0. lmol/L NaCl、0. lmol/L pH5. 5NaAc、PH8. OTris-HCl順序洗滌后，然后進行冷凍干燥，制得的固定化酶進行酶活力測定分析，確定海藻酸鈉濃度； 步驟ニ 選擇殼聚糖濃度分別為I. 0% 3. 5%，過程同步驟一，確定殼聚糖濃度； 步驟三選擇氯化鈣濃度分別為0. lmol/L 0. 35mol/L,過程同步驟一，確定氯化鈣濃度； 步驟四選擇戊ニ醛濃度分別為0.2% 0. 45%，過程同步驟一，確定戊ニ醛濃度； 步驟五選擇交聯時間分別為3. 5h 8. 5h，過程同步驟一，確定交聯時間。
2.根據權利要求I所述的ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步驟一中將濃度為I. 5% 2. 5%的海藻酸鈉在40°C水浴中保溫溶解。
3.根據權利要求I所述的ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步驟ニ中將濃度為I. 5% 2. 5%的殼聚糖在5%的醋酸溶液于40°C水浴中保溫溶解。
4.根據權利要求I所述的ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步驟三中向完全溶解的殼聚糖醋酸溶液中加入濃度為0. 2mol/L 0. 3mol/L的CaCl2溶液。
5.根據權利要求I所述的ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步驟四中向形成的光滑微膠囊球的混合溶液中加入濃度為0. 25% 0. 35%的戊ニ醛。
6.根據權利要求I所述的ー種用海藻酸鈉-殼聚糖固定化磷脂酶A2的方法，其特征在于步驟五中交聯時間6. 5h 7. 5h。
全文摘要
本發明提供一種以海藻酸鈉-殼聚糖復合載體為材料，采用物理包埋的方法來固定磷脂酶A2。研究了海藻酸鈉濃度、殼聚糖濃度、鈣離子濃度、戊二醛濃度和交聯時間等不同固定化條件對磷脂酶A2固定效率和催化效果的影響，并采用響應面的分析方法對所研究的因素進行優化。通過固定磷脂酶A2的SEM圖像進一步解釋利用海藻酸鈉-殼聚糖作為載體固定磷脂酶A2的優勢。根據本發明中復合載體的包埋特性固定磷脂酶A2，提高了酶在反應體系中的活性和穩定性，調節和控制酶的活性與選擇性，從而有利于酶的回收和產品的生產，最終得到的固定化酶活力回收率為74.8％，對于油脂精煉中的酶法脫膠工藝具有重要指導意義。
文檔編號C12N11/10GK102796721SQ20121016370
公開日2012年11月28日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者于殿宇, 江連洲, 胡立志, 李寶昌, 張佳宇, 鄒小雨, 劉鑫, 李萬振, 宋鵬, 王玥, 宋云花, 張春艷 申請人:東北農業大學