專利名稱：一株干酪乳桿菌及其在發酵產l-乳酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一株干酪乳桿菌及其在發酵產L-乳酸中的應用，屬于微生物發酵技術領域。
背景技術：
乳酸是一種古老且重要的有機酸，乳酸、乳酸鹽及其衍生產物，被廣泛應用于藥品、醫藥、飼料、化工的等領域。在食品工業上廣泛用作酸味劑、防腐劑和還原劑。乳酸，尤其是L-乳酸具有很強的殺菌作用，可直接用作手術室、病房、實驗室等場所的消毒劑。L-乳酸、L-乳酸鈉與葡萄糖、氨基酸等復合配制成輸液，可治療酸中毒及高鉀血癥。乳酸可添加至煙草中，能保持煙草的濕度，提高卷煙的質量。還可以用來處理紡織纖維，可使之易于著色，增加光澤等。L-乳酸經聚合可生成立鏈的或環狀的聚乳酸，在人體內能被分解成L-乳酸為人體代謝，因此可用于生產緩釋膠囊制劑、生物降解纖維、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然條件下緩慢分解，它不像Pvc、PP塑料那樣造成“白色污染”。因此在制造食品包裝材料和農用薄膜等方面有很大的潛力。由此可見，L-乳酸的發展前景十分誘人。乳酸可以通過化學合成法、微生物發酵法(同型乳酸發酵、異型乳酸發酵)及酶法幾種方法合成得到。由于微生物發酵能夠專業得到L-乳酸且無污染，因此發酵法被廣泛應用于L-乳酸的生產。目前國內外多以米根霉、德氏乳桿菌等進行L-乳酸發酵生產。根霉屬于異型乳酸發酵，營養要求簡單，但轉化率相對較低，且發酵產物光學純度不高。乳酸細菌屬于同型乳酸發酵，轉化率高，產物光學純度也較高，屬于化能異養型微生物，必須由外界提供多種營養物質及生長因子，如氨基酸、維生素、核酸堿基等。自然界中產L-乳酸能力強，并可應用于工業生產的菌種只有霉菌中德根霉屬及細菌中的乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬。為了提高發酵產L-乳酸的產量，降低生產制備成本，提高生產質量，國內外對其生產過程進行了大量研究,主要包括生產菌種誘變改良、低價原料的開發利用、發酵工藝的優化等方面。由此可見，提高L-乳酸發酵產物光學純度、提高發酵糖酸轉化率、提高產物耐高糖能力等已經成為發酵產L-乳酸的研究熱點。

發明內容
本發明要解決的技術問題在于提供一株干酪乳桿菌及其在發酵產L-乳酸中的應用，使其發酵產物L-乳酸產量大幅度提高。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下
一株干釀乳桿菌LC-N235,已于2012年5月10日，保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012157。本發明所述的干酪乳桿菌LC-N235的篩選方法是干酪乳桿菌LC_5出發菌株經低能氮離子注入誘變后，利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選得到耐高糖、EMP途徑強化且不分解利用乳酸的菌株。經搖瓶發酵篩選出發酵產L-乳酸含量最高的干酪乳桿菌作為下一輪誘變的出發菌株。重復上述過程，直至篩選到目標菌株，即干酪乳桿菌LC-N235。
本發明菌株的形態學及生理生化學特征如下
菌落顏色米白色；
需氧方式兼性厭氧；
菌落大小；適宜生長溫度35 45°C ；
適宜生長pH :6. 0 7.0 ;
菌落形態圓形；
革蘭氏染色陽性。本發明所提供的干酪乳桿菌LC-N235誘變方法，具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備將干酪乳桿菌LC-5出發菌株孢子制成孢子懸液，調整孢子濃度為IO6個/毫升。(b)、低能氮離子注入誘變取0. ImL的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風吹干，在18KeV、注入劑量為160X1013ionS/Cm2下對其進行氮離子注入。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用ImL無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養基上；在35 45°C下倒置培養2 3d。(C)、琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的能生長良好且透明圈大的菌株挑接至琥拍酸平板培養基上，在35 45°C下倒置培養2 3d,篩選菌株。(d)、純乳酸平板初篩將步驟(C)篩選到比出發菌株延遲出現菌落的單菌落挑接至純乳酸平板培養基上，在35 45°C下倒置培養2 3d，篩選在純乳酸平板上不能生長的菌株。(e)、發酵復篩將步驟(d)篩選出的干酪乳桿菌接入斜面培養基，在35 45°C下培養2 3d，取斜面培養物接入種子培養基在35 45°C下擴培12 20h。取種子液接入發酵培養基，接種量5% 15% (v/v), 250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發酵溫度35 45°C，發酵30 50h后測定發酵液中L-乳酸含量，篩選出L-乳酸含量最高的干酪乳桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，重復上述步驟直至篩選到目標菌株，即干酪乳桿菌ilactobacilluscasef)LC-N235。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的高糖平板培養基包含如下質量百分數的組分碳源25% 35%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%,其余為水，pH 6. (T7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質碳酸鈣。步驟(c)所采用的琥珀酸平板培養基以259^35%的琥珀酸代替高糖培養基中碳源，其他成分不變。步驟(d)所采用的純乳酸平板培養基以
0.49TO. 6%的乳酸代替高糖培養基中碳源，其他成分不變。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0. 3% 0. 6%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑0. 2% 0. 4%,瓊脂
1.09T1. 5%，其余為水，pH 6. (T7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源4% 8%、氮源I. 0% 5. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，其余為水，pH6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖、淀粉中的一種或幾種；氮源為胰蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種混合；中和劑為重質碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5% 10%，其余為水，pH
6.(T7. 0 ;其中所訴碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或幾種；氮源為胰蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一種或幾種混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽磷酸鹽中的一種或多種；中和劑為重質碳酸鈣。干酪乳桿菌LC-N235在發酵產L-乳酸中的應用，包括如下步驟
1)、平板培養將干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上培養，培養溫度為 35 45 °C，培養時間為2 3 d ；
2)、斜面培養將步驟I)平板培養的干酪乳桿菌LC-N235接種至斜面培養基培養，培養溫度為35 45°C，培養時間2 3 d ；
3)、種子培養將步驟2)中的干酪乳桿菌LC-N235的斜面培養物接種至種子培養基中培養，培養溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養時間12 20h ；
4)、發酵培養將步驟3)中的種子培養液接種至發酵培養基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發酵溫度35 45°C，發酵培養時間30 50 h。步驟I)中平板基本培養基包含如下質量百分數的組分碳源4%飛％、氮源
I.0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。步驟2)中的斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0.39^0.6%、氮源 I. 09T3. 0%、無機鹽 0. 029T0. 08%、中和劑 0. 2%"0. 4%、瓊脂 I. 0°/Tl. 5%、其余為水，pH
6.(T7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。步驟3)中的種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源49T8%、氮源19T5%、無機鹽0. 029T0. 08%,中和劑2% 4%，其余為水，pH6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。步驟4)中的發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源109^20%、氮源
I.0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH 6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。本發明的有益效果在于
本發明采用低能氮離子注入誘變干酪乳桿菌(Ieictobeicillusceisef)IL-^)出發菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選出能夠耐高糖、EMP途徑強化且不分解利用乳酸的菌株，再通過發酵復篩，篩選出高產菌株作為下一輪誘變的出發菌株，重復上述步驟直至篩選到目標菌株，即干酪乳桿菌ilactobacilluscasef)\JZ-m。該菌株能有效地利用廉價的玉米粉糖化液發酵產L-乳酸，糖酸轉化率高。在5L發酵罐中，L-乳酸產量達到了173g/L，比原始出發菌發酵提高了 46. 6%。具有重大的社會意義和經濟價值。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I
本實施例說明將干酪乳桿菌進行低能氮離子注入誘變篩選的方法。進行第一步低能氮離子注入誘變篩選的具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備取35 45 V恒溫培養2 3d的干酪乳桿菌{Lac tobacilluscasei) LC_5新鮮斜面加無菌水IOmL,刮洗下孢子傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶內震蕩搖勻20min(250rpm)，打散孢子鏈，三層脫脂紗布過濾，濾液用血球計數板計數，調整孢子濃度IO6個/毫升。(b)、低能氮離子注入誘變取0. ImL步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，鏡檢無細胞重疊者進行低能氮離子注入。本實驗低能氮離子注入機為離子束生物工程裝置。在ISKeV的能量下分別對干酪乳桿菌進行離子注入。注入劑量為160X1013ionS/Cm2，靶室真空度為10_3Pa，以20S脈沖式注入，間隔15s，靶室內放置不接受注入的對照樣。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用Iml無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養基上，在35 45°C下倒置培養2 3d。(C)、誘變菌株的篩選
琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的生長良好且透明圈大的單菌株挑接至琥珀酸平板培養基上，在35 45°C下倒置培養2 3d，篩選比出發菌株延遲出現菌落的菌株。純乳酸平板初篩將琥珀酸平板上篩選到生長良好且透明圈大的單菌落挑接至高乳酸平板培養基上，在35 45°C下倒置培養2 3d，篩選在純乳酸平板不生長的菌株。發酵復篩將初篩最終篩選到的單菌落接至斜面培養基，在35 45°C條件下培養2 3d ;將斜面培養物分別接入裝有l(T30mL/250mL搖瓶種子培養基中在35 45 V、5(Tl20rpm搖床轉速下擴培12 20h。取種子液接入發酵培養基，接種量59Tl5%(V/V)，250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發酵溫度35 45°C，發酵培養3(T50h后測定發酵液中L-乳酸的含量，同時篩選出發酵產L-乳酸含量最高的干酪乳桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，直至篩選到目標菌株，即干釀乳桿菌{LactobaciIluscase。其中，所使用的培養基配方(％為質量百分比)
步驟(b)中所用的高糖平板培養基為葡萄糖30%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏1.5%，七水合硫酸鎂0. 05%,碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水(其中葡萄糖0. 05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消40min。)，pH 6. 8。步驟(c)中所用的琥珀酸平板培養基以8%琥珀酸代替高糖培養基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。所用的純乳酸平板培養基以0.5%乳酸代替中高糖培養基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。
步驟(a)和(c)中所用的斜面培養基為葡萄糖0.5%，胰蛋白胨0.5%，酵母膏
I.5%，七水合硫酸鎂0. 05%,碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水，pH 6. 8。步驟(c)中所用的種子培養基為葡萄糖6. 0%，胰蛋白胨I. 0%，酵母膏I. 0%，七水合硫酸鎂0. 05%,碳酸鈣3. 0%，其余為蒸餾水(其中葡萄糖0. 05MPa分消30min，重質碳酸鈣
0.IMPa 分消 40min。)，pH 6. 8。步驟(c)中所用的發酵培養基為葡萄糖12%，胰蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,碳酸鈣7. 5%，其余為蒸餾水(其中葡萄糖0. 05MPa分消30min，重質碳酸鈣
0.IMPa 分消 40min。)，pH 6. 8。發酵結束后檢測各菌株L-乳酸含量如表I所示 表 I ___
菌號_干酪乳桿菌LC-5出發菌株干酪乳桿菌LC-N235
L-乳酸含量(g/L) 11181162
經過篩選獲得的突變株干酪乳桿菌{Lac tobaci lluscasei) LC-N235在發酵過程中L-乳酸產量明顯高于出發菌株。實施例2
本實施例說明干酪乳桿菌{LactobaciIluscase的遺傳穩定性。傳代發酵試驗結果如表2所示
表2干釀乳桿菌{LactobaciIluscase的遺傳穩定性
-傳代次數 L-乳酸產量(g/L)
1—160"
2"161 "
3"157"
4"152—
5|l50"
從遺傳穩定性實驗結果可知，經過5次連續傳代，突變株干酪乳桿菌LC-N235發酵產L-乳酸產量較穩定，具有很好的傳代穩定性，可作為進一步研究和開發的生產菌株。實施例3
本實施例說明突變株干酪乳桿菌LC-N235發酵產L-乳酸。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板基本培養基葡萄糖5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。斜面培養基葡萄糖0. 5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。種子培養基葡萄糖6. 0%，胰蛋白胨I. 0%，酵母膏I. 0%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣3.0%，其余為水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消40mino發酵培養基葡萄糖12%，胰蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣7. 5%，其余為水，pH 6. 8。將篩選到得突變株干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上于38°C條件下倒置培養60h后，將其接種至斜面培養基培養，培養溫度38 °C，培養時間48h。將斜面培養物接種到種子培養基中，培養溫度38°C，250mL搖瓶瓶裝液量30mL，在80rpm搖床轉速下培養時間16h ;將種子液接種到發酵培養基中，接種量10%(v/v)，發酵溫度38°C，250mL搖瓶裝液量40mL，靜止發酵培養40h后檢測發酵液中L-乳酸含量達到了 165g/L，比同等培養條件下的原始出發菌株發酵提高了 39. 8%。實施例4 本實施例說明突變株干酪乳桿菌LC-N235發酵產L-乳酸。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板基本培養基葡萄糖5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。斜面培養基葡萄糖0. 5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。種子培養基葡萄糖6. 0%，胰蛋白胨I. 0%，酵母膏I. 0%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣3.0%，其余為水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消40mino發酵培養基玉米粉糖化液12%，胰蛋白胨0. 05%,酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂
0.05%，重質碳酸鈣7. 5%，其余為水，pH 6. 8。將篩選到得突變株干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上于38°C條件下倒置培養60h后，將其接種至斜面培養基培養，培養溫度38 °C，培養時間48h。將斜面培養物接種到種子培養基中，培養溫度38°C，250mL搖瓶瓶裝液量30mL，在80rpm搖床轉速下培養時間16h ;將種子液接種到發酵培養基中，接種量10%(v/v)，發酵溫度38°C，250mL搖瓶裝液量40mL，靜止發酵培養40h后檢測發酵液中L-乳酸含量達到了 170g/L，比同等培養條件下的原始出發菌提高了 44. 1%。實施例5
本實施例說明突變株干酪乳桿菌LC-N235發酵產L-乳酸。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板基本培養基葡萄糖5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。斜面培養基葡萄糖0. 5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。種子培養基葡萄糖6. 0%，胰蛋白胨I. 0%，酵母膏I. 0%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣3.0%，其余為水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消40mino發酵培養基大米糖化液12%，胰蛋白胨0. 05%,酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣7. 5%，其余為水，pH 6. 8。將篩選到得突變株干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上于38°C條件下倒置培養60h后，將其接種至斜面培養基培養，培養溫度38°C，培養時間48h。將斜面培養物接種到種子培養基中，培養溫度38°C，250mL搖瓶瓶裝液量30mL，，在80rpm搖床轉速下培養時間16h ;將種子液接種到發酵培養基中，接種量10%(v/v)，發酵溫度38°C，250mL搖瓶裝液量40mL，靜止發酵培養40h后檢測發酵液中L-乳酸含量達到了 156g/L，比同等培養條件下的原始出發菌提高了 32. 2%。
實施例6
本實施例說明突變株干酪乳桿菌LC-N235發酵產L-乳酸。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板基本培養基葡萄糖5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。斜面培養基葡萄糖0. 5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。種子培養基葡萄糖6%，胰蛋白胨I. 0%，酵母膏I. 0%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣3%，其余為水，pH 6. 8。其中葡萄糖0. 05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消 40mino發酵培養基蔗糖12%，胰蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣7. 5%，其余為水，pH 6.8。將篩選到得突變株干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上于38°C條件下倒置培養60h后，將其接種至斜面培養基培養，培養溫度38 °C，培養時間48h。將斜面培養物接種到種子培養基中，培養溫度38°C，250mL搖瓶瓶裝液量30mL，，在80rpm搖床轉速下培養時間16h ;將種子液接種到發酵培養基中，接種量10%(v/v)，發酵溫度38°C，250mL搖瓶裝液量40mL，靜止發酵培養40h后檢測發酵液中L-乳酸含量達到了 140g/L，比同等培養條件下的原始出發菌提高了 18. 6%。實施例7
本實施例說明突變株干酪乳桿菌LC-N235在5L發酵罐中發酵產L-乳酸。本實施例所述的培養基配方(％為質量百分比)
平板基本培養基葡萄糖5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%，重質碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。斜面培養基葡萄糖0. 5%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為水，pH 6. 8。種子培養基葡萄糖6. 0%，胰蛋白胨0. 5%，酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣3.0%，其余為水，pH 6.8。其中葡萄糖0.05MPa分消30min，重質碳酸鈣0. IMPa分消40mino發酵培養基玉米粉糖化液12%，蛋白胨0. 05%,酵母膏I. 5%，七水合硫酸鎂0. 05%,重質碳酸鈣7. 5%，其余為水，pH6. 8。將篩選到得突變株干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上于38°C條件下倒置培養60h后，將其接種至斜面培養基培養，培養溫度38 °C，培養時間48h。將斜面培養物接種到種子培養基中，培養溫度38°C，250mL搖瓶瓶裝液量30mL，在80rpm搖床轉速下培養時間16h ;將種子液接種到裝有3L發酵培養基的5L發酵罐中，接種量為10%(v/v)，發酵溫度為38°C，前期0 12h發酵罐攪拌轉速lOOrpm，12 40h靜止發酵培養。40h后檢測發酵液中L-乳酸含量，達到173g/L，相比同等培養條件下的原始出發菌提高了 46. 6%。
權利要求
1.一種干酪乳桿菌LC-N235,已保藏于中國典型培養物保藏中心 CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012157。
2.權利要求I所述的干酪乳桿菌ilactobaciIluscase在發酵產L-乳酸中的應用。
3.根據權利要求2所述的干酪乳桿菌HactobaciIluscase在發酵產L-乳酸中的應用，其特征在于包括如下步驟 1)、平板培養將干酪乳桿菌LC-N235接種至平板基本培養基上培養，培養溫度為35 45 °C，培養時間為2 3 d ； 2)、斜面培養將步驟I)平板培養的干酪乳桿菌LC-N235凝接種至斜面培養基培養，培養溫度為35 45°C，培養時間2 3 d ； 3)、種子培養將步驟2)中的干酪乳桿菌LC-N235的斜面培養物接種至種子培養基中培養，培養溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養時間12 20h ； 4)、發酵培養將步驟3)中的種子培養液接種至發酵培養基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發酵溫度35 45°C，發酵培養時間30 50 h。
4.根據權利要求3所述的干酪乳桿菌LC-N235在發酵產L-乳酸中的應用，其特征在于所述步驟I)中平板基本培養基包含如下質量百分數的組分碳源4%飛％、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
5.根據權利要求3所述干酪乳桿菌LC-N235在發酵產L-乳酸中的應用，其特征在于所述步驟2)中的斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0.390X6%、氮源 I. 09T3. 0%、無機鹽 0. 029T0. 08%、中和劑 0. 2%"0. 4%、瓊脂 I. 0°/Tl. 5%、其余為水，pH6. (T7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
6.根據權利要求3所述的干酪乳桿菌LC-N235在發酵產L-乳酸中的應用，其特征在于所述步驟3)中的種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源49T8%、氮源19T5%、無機鹽0. 029T0. 08%,中和劑29T4%，其余為水，pH 6. (T7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
7.根據權利要求3所述的干酪乳桿菌LC-N235在發酵產L-乳酸中的應用，其特征在于所述步驟4)中的發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源109^20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH 6. 0 7. 0 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
全文摘要
本發明公開了一株干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LC-N235，保藏編號CCTCC NOM2012157。本發明采用低能氮離子注入誘變干酪乳桿菌LC-5出發菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選出能夠耐高糖、EMP途徑強化且不分解利用乳酸的菌株，再通過發酵復篩，篩選出L-乳酸高產菌株作為下一輪誘變的出發菌株，重復上述步驟直至篩選到目標菌株干酪乳桿菌LC-N235。該菌株能有效利用廉價的玉米粉糖化液發酵產L-乳酸，糖酸轉化率高。在5L發酵罐中，L-乳酸產量達到了173g/L，比原始出發菌發酵產L-乳酸提高了46.6%，具有重大的社會意義和經濟價值。
文檔編號C12R1/245GK102653724SQ20121017256
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者李玉燕, 虞龍, 錢夢宇, 陳曉雙, 黃思思, 龔文靜 申請人:南京工業大學