專利名稱：一種凝結芽孢桿菌及其在混合發酵產l-乳酸中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種凝結芽孢桿菌及其在混合發酵產L-乳酸中的應用，屬于微生物發酵技術領域。
背景技術：
乳酸是一種古老且重要的有機酸，乳酸、乳酸鹽及其衍生產物，被廣泛應用于藥品、醫藥、飼料、化工的等領域。在食品工業上廣泛用作酸味劑、防腐劑和還原劑。乳酸，尤其是L-乳酸具有很強的殺菌作用，可直接用作手術室、病房、實驗室等場所的消毒劑。L-乳酸、L-乳酸鈉與葡萄糖、氨基酸等復合配制成輸液，可治療酸中毒及高鉀血癥。乳酸可添加至煙草中，能保持煙草的濕度，提高卷煙的質量。還可以用來處理紡織纖維，可使之易于著 色，增加光澤等。L-乳酸經聚合可生成立鏈的或環狀的聚乳酸，在人體內能被分解成L-乳酸為人體代謝，因此可用于生產緩釋膠囊制劑、生物降解纖維、生物降筋塑料、生物植片等。聚L-乳酸在自然條件下緩慢分解，它不像PVC、PP塑料那樣造成“白色污染”。因此在制造食品包裝材料和農用薄膜等方面有很大的潛力。由此可見，L-乳酸的發展前景十分誘人。乳酸可以通過化學合成法、微生物發酵法(同型乳酸發酵、異型乳酸發酵)及酶法幾種方法合成得到。由于微生物發酵能夠專業得到L-乳酸且無污染，因此發酵法被廣泛應用于L-乳酸的生產。目前國內外多以米根霉、德氏乳桿菌等進行L-乳酸發酵生產。根霉屬于異型乳酸發酵，營養要求簡單，但轉化率相對較低，且發酵產物光學純度不高。乳酸細菌屬于同型乳酸發酵，轉化率高，產物光學純度也較高，屬于化能異養型微生物，必須由外界提供多種營養物質及生長因子，如氨基酸、維生素、核酸堿基等。自然界中產L-乳酸能力強，并可應用于工業生產的菌種只有霉菌中德根霉屬及細菌中的乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、鏈球菌屬。為了提高發酵產L-乳酸的產量，降低生產制備成本，提高生產質量，國內外對其生產過程進行了大量研究，主要包括生產菌種誘變改良、低價原料的開發利用、發酵工藝的優化等方面。由此可見，提高L-乳酸發酵產物光學純度、提高發酵糖酸轉化率、提高產物耐高糖能力等已經成為發酵產L-乳酸的研究熱點。

發明內容
本發明要解決的技術問題之一在于提供一種凝結芽孢桿菌及其誘變選育方法，使其發酵產物L-乳酸產量大幅度提高。本發明要解決的技術問題之二在于提供所述凝結芽孢桿菌在混合發酵產L-乳酸中的應用。為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案如下
一種凝結芽抱桿菌(BacillusBC-N6242,已于2012年5月10日保藏于中
國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012156。本發明所述的凝結芽孢桿菌BC-N6242的篩選方法是凝結芽孢桿菌BC-3出發菌株經低能氮離子注入誘變后，利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選得到耐高糖、EMP途徑強化且不分解利用乳酸的菌株。然后將所得的菌株按一定比例與干酪乳桿菌LC-N235混合接入發酵培養基，經搖瓶發酵篩選出發酵產L-乳酸含量最高的凝結芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，重復上述過程，直至篩選到目標菌株，即凝結芽孢桿菌{Bacillus coagulans) BC-N6242。本發明誘變得到的凝結芽孢桿菌BC-N6242菌株的形態學及生理生化學特征如下
菌落顏色米白色；
需氧方式兼性厭氧；
菌落大小2 6mm ；
適宜生長溫度4(T45°C ；
適宜生長pH :7. 0 7.4 ;
菌落形態圓形；
革蘭氏染色陽性；
本發明所提供的凝結芽孢桿菌BC-N6242的誘變方法，具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備將凝結芽孢桿菌BC-3出發菌株孢子制成孢子懸液，調整孢子濃度為IO6個/毫升。(b)、低能氮離子注入誘變取0. ImL的步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，以無菌風吹干，在20KeV、注入劑量為180X1013ionS/Cm2下對其進行氮離子注入，離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用ImL無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養基上；在40 45°C下倒置培養2 3d。(C)、琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的能生長良好且透明圈大的菌株挑接至琥珀酸平板培養基上，在4(T45°C下倒置培養2 3d，篩選菌株。(d)、純乳酸平板初篩將步驟(C)篩選到比出發菌株延遲出現菌落的單菌落挑接至純乳酸平板培養基上，在4(T45°C下倒置培養2 3d，篩選在純乳酸平板上不能生長的菌株。(e)、發酵復篩將步驟(d)篩選出的凝結芽孢桿菌接入斜面培養基，在4(T45°C下培養f 2d，取斜面培養物接入種子培養基在4(T45°C下擴培12 20h。取種子液與干酪乳桿菌LC-N235種子液按比例接入發酵培養基，接種量59Tl5% (v/v)，250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發酵溫度4(T45°C，發酵3(T50h后測定L-乳酸含量，篩選出發酵產L-乳酸含量最高的凝結芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，重復上述步驟直至篩選到目標菌株，即凝結芽孢桿菌BC-N6242。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的高糖平板培養基包含如下質量百分數的組分碳源25% 35%、氮源I. 0% 2. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%,其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質碳酸鈣。步驟(c)所采用的琥珀酸平板培養基以259^35%的琥珀酸代替高糖培養基中碳源，其他成分不變。步驟(d)所采用的純乳酸平板培養基以
0.49TO. 6%的乳酸代替高糖培養基中碳源，其他成分不變。在上述篩選方法中步驟(b)所采用的斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0. 4% 0. 6%、氮源I. 0% 2. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑0. 2% 0. 4%，瓊脂
I.09T1. 5%，其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；中和劑為重質碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源4% 8%、氮源I. 0% 5. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ；其中所述碳源為葡萄糖、淀粉中的一種或幾種；氮源為蛋白胨、牛肉膏和酵母膏中的一種或多種；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種混合；中和劑為重質碳酸鈣。在上述篩選方法中步驟(e)所采用的發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5% 10%，其余為水，pH
7.(T7. 4 ;其中所訴碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或幾種；氮源為蛋白胨、酵母膏、牛肉膏中的一種或幾種混合；無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽磷酸鹽中的一種 或多種；中和劑為重質碳酸鈣。本發明混合發酵所用的干酪乳桿菌{LactobaciIluscase已于2012年5月10日，保藏于中國典型培養物保藏中心CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012157。所述的凝結芽孢桿菌BC-N6242與干酪乳桿菌LC-N235在混合發酵產L-乳酸中的應用。包含如下步驟
1)、平板培養將凝結芽孢桿菌BC-N6242和干酪乳桿菌LC-N235分別接種至平板基本培養基上培養，培養溫度為35 45°C，培養時間為2 3 d ；
2)、斜面培養將步驟I)平板培養的兩種菌分別接種至斜面培養基培養，培養溫度為35 45°C，培養時間I 2 d ；
3)、種子培養將步驟2)中的兩種菌的斜面培養物分別接種至種子培養基中培養，培養溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養時間12 20h ；
4)、混合發酵將步驟3)中的兩種菌的種子培養液按凝結芽孢菌BC-N6242:干酪乳桿LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接種至發酵培養基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發酵溫度40 45 V，發酵培養30 50h。所述步驟I)平板基本培養基包含如下質量百分數的組分碳源4%飛％、氮源
I.0% 2. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。所述斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0. 390). 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑0. 2% 0. 4%、瓊脂I. 0% 1. 5%、其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。所述種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源49T8%、氮源19T5%、無機鹽0. 029T0. 08%,中和劑29T4%，其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。所述發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源109^20%、氮源I. 09T3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。本發明的有益效果在于本發明采用低能氮離子注入誘變凝結芽胞桿菌BC-3出發菌株，利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選出能夠耐高糖、EMP途徑強化且不分解利用乳酸的菌株，再通過“混合發酵實驗”篩選出高產菌株作為下一輪誘變的出發菌株，直至篩選到目標菌株，即凝結芽胞桿菌BC-N6242。最后將其與干酪乳桿菌LC-N235按2:1的比例混合接入發酵培養基，該混合菌株能高效地利用葡萄糖發酵產L-乳酸，糖酸轉化率高，且能有效的縮短發酵時間。在5L發酵罐中，按凝結芽孢菌BC-N6242 :干酪乳桿LC-N235=2:1的比例，L-乳酸產量達到了 235g/L，比同等培養條件下的干酪乳桿菌LC-N235或凝結芽胞桿菌BC-3原始出發菌株或凝結芽孢桿菌BC-N6242單獨發酵分別提高了 45. 1%、 57. 7%、14. 6%，具有重大的社會意義和經濟價值。
具體實施例方式根據下述實施例，可以更好地理解本發明。然而，本領域的技術人員容易理解，實施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。實施例I
本實施例說明將凝結芽孢桿菌原始菌株進行低能氮離子注入誘變篩選的方法。進行第一步低能氮離子注入誘變篩選的具體步驟如下
(a)、單孢子懸浮液制備取4(T45°C恒溫培養2 3d的凝結芽孢桿菌BC-3原始出發菌株新鮮斜面加無菌水10mL，刮洗下孢子傾于帶有一定玻璃珠的250mL三角瓶內震蕩搖勻20min (250rpm)，打散孢子鏈，三層脫脂紗布過濾，濾液用血球計數板計數，調整孢子濃度IO6個/暈升。(b)、低能氮離子注入誘變取0. ImL步驟(a)中孢子懸液均勻涂布于無菌平皿上，鏡檢無細胞重疊者進行低能氮離子注入。本實驗低能氮離子注入機為離子束生物工程裝置。在20KeV的能量下對干酪乳桿菌進行離子注入。注入劑量為180X1013ions/cm2，靶室真空度為10_3Pa，以20S脈沖式注入，間隔15s，靶室內放置不接受注入的對照樣。離子注入完畢后，取出平皿，在無菌環境下用Iml無菌水洗脫，涂布到高糖平板培養基上，在4(T45°C下倒置培養2 3d。(C)、誘變菌株的篩選
琥珀酸平板初篩將步驟(b)篩選到的生長良好且透明圈大的單菌株挑接至琥珀酸平板培養基上，在4(T45°C下倒置培養2 3d，篩選比出發菌株延遲出現菌落的菌株。純乳酸平板初篩將琥珀酸平板上篩選到生長良好且透明圈大的單菌落挑接至高乳酸平板培養基上，在4(T45°C下倒置培養2 3d，篩選在純乳酸平板不生長的菌株。發酵復篩將初篩最終篩選到的菌株的單菌落和干酪乳桿菌LC-N235分別接至斜面培養基，在35 45°C條件下培養f2d ;將斜面培養物分別接入種子培養基在35 45°C、5(Tl20rmp搖床轉速下擴培12 20h。取篩選到的菌株的種子液與干酪乳桿菌LC-N235混合發酵復篩，即初篩得到的所有凝結芽孢桿菌與干酪乳桿菌LC-N235按比例混合接入發酵培養基，接種量5% 15% (v/v)，250mL搖瓶裝液量2(T50mL，發酵溫度35 45°C，發酵發酵時間3(T50h ;測定混合發酵產L-乳酸的含量，篩選出混合發酵產L-乳酸含量最高的凝結芽孢桿菌作為下一輪誘變篩選的出發菌株，直至篩選到目標菌株，即凝結芽孢桿菌BC-N6242。其中，所使用的培養基配方(％為質量百分比)
步驟(b)中所用的高糖平板培養基為葡萄糖30%，蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，酵母膏0.3%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水，pH 7.0。步驟(c)中所用的琥珀酸平板培養基以8%琥珀酸代替高糖培養基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。所用的純乳酸平板培養基以5%乳酸代替中高糖培養基中“葡萄糖30%”，其他成分不變。 步驟(a)和(C)中所用的斜面培養基為葡萄糖0. 5%，蛋白胨1%，牛肉膏0. 3%，酵母膏0. 3%，硫酸鎂0. 05%，碳酸鈣0. 3%，瓊脂I. 2%，其余為蒸餾水，pH 7. O。步驟(c)中所用的種子培養基為葡萄糖6%，蛋白胨1%，酵母膏1.0%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣3%，其余為蒸餾水，pH 7.0。步驟(c)中所用的發酵培養基為葡萄糖15%，蛋白胨0. 05%，酵母膏I. 5%，硫酸鎂0.05%，碳酸鈣7.5%，其余為蒸餾水，pH 7.0。發酵結束后檢測各菌株L-乳酸含量如表I所示
表I
I ~干酪乳桿菌"""凝結芽孢桿菌BC-3 '凝結.嘗孢桿菌I
I萬LC-K235出發菌株BC-K6262
發酵吋間(h)^^ 40^I I I
L-乳酸含量(gL)162149205
經過平板組合篩選及單因素混合發巾選獲得的凝結芽孢桿菌突變株在發酵過程中L-乳酸產量明顯高于出發菌株。實施例2
本實施例說明高產菌株凝結芽孢桿菌BC-N6262以及干酪乳桿菌LC-N235的遺傳穩定性。傳代發酵試驗結果如表2所示
表權利要求
1.一種凝結芽孢桿菌(feci77m coa講7aas)BC-N6242，已保藏于中國典型培養物保藏中心 CCTCC，保藏編號CCTCC M 2012156。
2.權利要求I所述的凝結芽孢桿菌BC-N6242與干酪乳桿菌LC-N235在混合發酵產L-乳酸中的應用。
3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于包含如下步驟 1)、平板培養將凝結芽孢桿菌BC-N6242和干酪乳桿菌LC-N235分別接種至平板基本培養基上培養，培養溫度為4(T45°C，培養時間為2 3 d ； 2)、斜面培養將步驟I)平板培養的兩種菌分別接種至斜面培養基培養，培養溫度為40 45°C，培養時間I 2 d ; 3)、種子培養將步驟2)中的兩種菌的斜面培養物分別接種至種子培養基中培養，培 養溫度為35 45°C，250ml搖瓶裝液量l(T30ml，培養時間12 20h ； 4)、混合發酵將步驟3)中的兩種菌的種子培養液按凝結芽孢菌BC-N6242:干酪乳桿LC-N235=(0. 5 2) :1的比例接種至發酵培養基中，接種量5 15%(v/v)，250ml搖瓶裝液量2(T50ml，發酵溫度35 45 V，發酵培養30 50 h。
4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述步驟(I)平板基本培養基包含如下質量百分數的組分碳源4% 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機鹽0. 029T0. 08%、中和劑2% 4%，瓊脂I.09T1. 5%、其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述斜面培養基包含如下質量百分數的組分碳源0. 39TO. 6%、氮源I. 09T2. 0%、無機鹽0. 029T0. 08%、中和劑0. 2%"0. 4%、瓊脂I.09T1. 5%、其余為水，pH 7. (T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述種子培養基包含如下質量百分數的組分碳源4% 8%、氮源1% 5%、無機鹽0. 02% 0. 08%,中和劑2% 4%，其余為水，pH 7. 0 7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖和淀粉中的一種或兩種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或幾種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于所述發酵培養基包含如下質量百分數的組分碳源10% 20%、氮源I. 0% 3. 0%、無機鹽0. 02% 0. 08%、中和劑5. 0% 10. 0%，其余為水，pH7.(T7. 4 ;其中所述碳源為葡萄糖、玉米粉糖化液、大米糖化液、蔗糖中的一種或多種的混合；所述氮源為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏中的一種或多種的混合；所述無機鹽為鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽和磷酸鹽中的一種或幾種的混合；所述中和劑為重質碳酸鈣。
全文摘要
本發明公開一株凝結芽孢桿菌BC-N6242，保藏號登記號為CCTCCM2012156。本發明采用低能氮離子注入誘變凝結芽孢桿菌，分別利用高糖平板、琥珀酸平板、純乳酸平板篩選，與干酪乳桿菌“混合發酵”篩選，直至最終篩選到目標菌株。將該菌株與干酪乳桿菌LC-N235按比例混合發酵。在5L發酵罐中按2∶1的比例接入種子培養液后發酵培養48h，產物L-乳酸的產量達到235g/L，較干酪乳桿菌LC-N235或凝結芽胞桿菌BC-3或凝結芽孢桿菌BC-N6242單獨發酵分別提高了45.1%、57.7%、14.6%，且有效縮短凝結芽胞桿菌單獨發酵時間24h，具有重大的社會意義和經濟價值。
文檔編號C12R1/07GK102653725SQ201210172600
公開日2012年9月5日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者李玉燕, 虞龍, 錢夢宇, 陳曉雙, 黃思思, 龔文靜 申請人:南京工業大學