專利名稱：一種生物轉化反應中快速計算γ-氨基丁酸生成量的檢測裝置的制作方法
技術領域：
一種生物轉化反應中快速計算Y-氨基丁酸生成量的檢測裝置，屬于化學儀器技術領域。
背景技術：
Y -氨基丁酸(GABA, Gamma-aminobutyric acid)是一種天然存在的非蛋白組成氨基酸，在哺乳動物體內GABA是一種抑制性神經遞質，介導40%以上的抑制性神經信號。GABA具有提高腦活力、降低血壓、安定精神、改善肝腎機能等功能，因而它在功能食品中具有廣泛的應用前景。谷氨酸脫羧酶(GAD, Glutamate decarboxylase)是一種憐酸卩比卩多醒(PLP)類酶，它是GABA生物合成過程中的重要生物酶。GAD廣泛存在于微生物、植物組織到高級哺乳動物體內，但是它在細胞中的存在量甚微。在GABA生物合成過程中，對GABA的測定目前有多種方法和儀器，而不同測定方法優缺點不同，因而有必要來根據實際情況，通過實驗研究建立一種有針對性的快速、可靠、方便的測定方法，已有的檢測方法報道有以下幾種
雙酶法運用雙酶試劑盒Gabase (雙酶試劑盒，S卩[a -酮戊二酸GABA，氨基轉移酶(E. C. 2. 6. 19)]及[NAD(P):琥珀酸半縮醛，氧化還原酶(E. C. 1.2. I. 16)])，反應原理為a -酮戊二酸+GABA —琥珀酸半縮醛+L-谷氨酸；NADP + +琥珀酸半縮醛一NADPH+H + +琥珀酸。該方法對GABA進行定量分析，通過熒光檢測NADH或NAD的變化量，所需時間短，靈敏度高，達lX10_n mol/L，在醫學研究中常用于對神經組織中所含GABA的微量分析。但是該檢測方法的測定成本比較昂貴，不適于工業應用。氨基酸分析儀測定法或高效液相測定法采用分析儀器定量測定GABA。此類方法目前應用廣泛并且準確度很高，但是分析成本較高，有時需要對樣品進行比較繁瑣的預處理或衍生化準備，由于準確度高通常作為一種參照比較的標準方法。紙層析或薄層掃描法此類方法主要利用氨基酸與茚三酮反應生成有色物質，進行分離檢測。此類方法比較經濟快速，但是靈敏度較低，常常用作GABA的定性檢測。比色法基本原理為，利用生物反應前后Berthelot比色法的顯色差值來測定酶活。Berthelot反應利用苯酚、次氯酸鈉與游離氨反應，顯色靈敏度高，常用來測定體系中的氨及其鹽類的含量，氨基酸具有游離氨基，在Berthelot反應中有一定響應，一個規律是，
氨基酸的反應靈敏度很高，而a-氨基酸響應低。對于體系中的L-谷氨酸和GABA來講，它們在Berthelot反應中響應差別懸殊，即酶反應產物GABA的響應很高而底物L-谷氨酸響應低，因此酶反應發生時，可以根據體系顯色強度變化進行酶活測定。Johnson和Tsushida等報道了利用比色法分別測定豇豆和茶葉中谷氨酸脫羧酶的酶活。此類方法所需樣品量少，快速，但是準確度不高，反應體系小，不適于工業化應用。另外，根據谷氨酸脫羧酶反應的特點GAD屬于裂解酶類，反應為作用于L-谷氨酸而產生CO2和GABA，反應過程中CO2不斷逸出，因此GAD脫羧反應是一個不可逆過程，反應中不斷消耗質子。通過計算反應中釋放的CO2量來計算酶活也有報道采用電化學裝置，原理為檢測脫羧反應中定量釋放的C02。凌達仁和吳國琪利用微機化離子分析儀和CO2氣敏電極來測定谷氨酸脫羧酶活力，據此還可以推算GABA的生成量，此元素方法數據應用計算機記錄，非常方便，易于操作。但是設備投資大，對反應體系要求嚴格。二氧化碳定量法。采用放射定量法來測定GAD的酶活，原理是以帶有放射性元素14C的L-谷氨酸為底物，GAD脫羧反應中會定量釋放14CO2,檢測14CO2,然后根據反應中單位時間內釋放的14CO2來確定GAD酶活，據此還可以推算GABA的生成量。此方法準確度極高，但是測定成本較高，操作繁瑣，對設備要求嚴格。

發明內容
本發明要解決的技術問題為針對目前GABA測定方法的費時長，成本高，操作復雜，規模小等缺陷，發明了一種專門用于生物轉化中測定生成GABA含量的檢測裝置。
本發明的技術方案工業化生物轉化生產GABA過程中，為了充分利用酶活，一般應分批添加底物，GAD脫羧不可逆消耗質子，需要在線調節pH，通過實驗得出消耗質子數和Y-氨基丁酸生成量的比例關系，據此發明了一種生物轉化過程中可快速檢測GABA的新型裝置。該檢測裝置主體包括1) pH感應儀；2)數字轉化儀；3)滴液瓶；4)控制儀；5)反應器。反應器(5 )內放置反應液，pH感應儀(I)插入反應器(5 )內反應液中，pH感應儀(I)始終在線檢測著反應液的pH值，pH感應儀(I)和控制儀(4)相接，控制儀(4)根據設定pH值控制滴液瓶(3)對反應液加酸；pH感應儀(I)又和數字轉化儀(2)相接，數字轉化儀(2)記錄添加酸的體積，數字轉化儀(2)將加酸量的體積轉化為電信號傳給控制儀(4)，然后控制儀(4)會根據計算程序直接顯示出Y-氨基丁酸生成量。檢測操作步驟為
A、設定反應pH(4.6-4.8)值、添加鹽酸的濃度n(0. 1-0. 5M)兩個參數，加谷氨酸溶液，和加谷氨酸脫羧酶溶液或產谷氨酸脫羧酶的濕細胞到反應器內，用水補足反應體積在100-500mL之間；添加的谷氨酸總量在5-100mmol之間，添加的谷氨酸脫羧酶溶液或產谷氨酸脫羧酶的濕細胞量(使總酶活為100-2000U)；
B、反應體系反應前應調至設定值；
C、pH感應儀始終在線監測反應液的pH，并用濃度為n的HCl調至最適設定值，記錄累計添加鹽酸的體積V ;
D、運用公式W= (nXVXkX103. I)計算出Y -氨基丁酸生成量W ; n的單位為mol/L, V的單位為mL, W的單位為mg ；
k定義為:谷氨酸脫羧酶脫羧反應中，Y-氨基丁酸生成量與質子消耗數之比，是谷氨酸脫羧酶的一個特征值。主要是應用本裝置和高效液相法測定GABA對比得到，數值為0. 5。本發明的有益效果本裝置測定生物轉化過程中Y-氨基丁酸生成量無需對樣品進行處理操作，操作簡單易行，耗時短，成本低。


圖I本發明結構示意圖。
具體實施例方式實施例I :按如下步驟操作a.設定控制儀的參數pH4. 6，添加0. IM鹽酸溶液；b.添加20mmol的谷氨酸到反應器,加入去離子水至反應體積IOOmL ;c.調至pH4. 6;d.添加IOmL谷氨酸脫羧酶溶液(酶活100U)到反應器內開始反應。IOmin后，記錄累計添加鹽酸的體積為79. 5mL，運用公式W = (nXVXAX 103. I)計算出生成GABA量為409. 8mg,高效液相的方法檢測GABA結果為417mg，誤差率為I. 8%。實施例2 :按如下步驟操作a.設定控制儀的參數pH4. 8，添加0. 5M鹽酸溶液；b.添加5mmol的谷氨酸到反應器 ,加入去離子水至200mL ；c.調至pH4. 8 ；d.添加20g濕細胞(酶活500U)到反應器內開始反應。IOmin后，記錄累計添加鹽酸的體積為57. 3mL，運用公式W = (nX VXAX 103. I)計算出生成GABA量為1477mg，高效液相的方法檢測GABA結果為1489. 4mg，誤差率為0. 9%。實施例3 :按如下步驟操作a.設定控制儀的參數pH4. 7，添加0. 25M鹽酸溶液；b.添加IOOmmol的谷氨酸到反應器,加入去離子水至500mL ；c.調至pH4. 7 ；d.添加80g濕細胞(酶活2000U)到反應器內開始反應。IOmin后，記錄累計添加鹽酸的體積為331. 3mL,運用公式W = (nX VXAX 103. I)計算出生成GABA量為4. 2696g，高效液相的方法檢測GABA結果為4. 32g，誤差率為I. 1%。
權利要求
1.一種生物轉化反應中快速計算Y-氨基丁酸生成量的檢測裝置，其特征在于該檢測裝置主體由PH感應儀(1)，數字轉化儀(2)，滴液瓶(3)，控制儀(4)和反應器(5)構成；控制儀(4)用于設定反應pH值、添加酸的濃度兩個參數，反應器(5)內放置反應液，pH感應儀(I)插入反應器(5)內反應液中，pH感應儀(I)始終在線檢測著反應液的pH值，pH感應儀(I)和控制儀(4)相接，控制儀(4)根據設定pH值控制滴液瓶(3)對反應液加酸；pH感應儀(I)又和數字轉化儀(2)相接，數字轉化儀(2)記錄添加酸的體積，數字轉化儀(2)將加酸量的體積轉化為電信號傳給控制儀(4)，然后控制儀(4)會根據計算程序直接得出Y-氨基丁酸生成量，并直接顯示在控制儀(4)上。
2.用權利要求I所述檢測裝置在生物轉化反應中快速計算Y-氨基丁酸生成量的方法，其特征在于按以下步驟進行 A、設定反應pH4.6-4. 8值、添加鹽酸的濃度n :0. 1-0. 5M兩個參數，加谷氨酸溶液，和加谷氨酸脫羧酶溶液或產谷氨酸脫羧酶的濕細胞到反應器內，用水補足反應體積在100-500mL之間；添加的谷氨酸總量在5-100mmol之間，添加的谷氨酸脫羧酶溶液或產谷氨酸脫羧酶的濕細胞量為總酶活100-2000U ； B、反應體系反應前應調至設定值； C、pH感應儀始終在線監測反應液的pH，并用濃度為n的鹽酸調至最適設定值，記錄累計添加鹽酸的體積V ; D、運用公式W= (nXVXkX103. I)計算出Y _氨基丁酸生成量W ; n的單位為mol/L, V的單位為mL, W的單位為mg ； k定義為谷氨酸脫羧酶脫羧反應中，Y-氨基丁酸生成量與質子消耗數之比，是谷氨酸脫羧酶的一個特征值，它是應用本裝置和高效液相法測定GABA對比得到，數值為0. 5。
全文摘要
一種生物轉化反應中快速計算γ-氨基丁酸(GABA)生成量的檢測裝置，屬于化學儀器技術領域。本裝置主體包括1)pH感應儀；2)數字轉化儀；3)滴液瓶；4)控制儀和5)反應器。其數字轉化儀可記錄添加酸的體積，控制儀可以設定反應pH值、添加酸的濃度兩個參數，由加酸體積經過程序計算可得GABA生成量，并直接顯示在控制儀上。谷氨酸脫羧酶催化反應中不可逆消耗質子，本裝置正是利用了消耗質子數和γ-氨基丁酸的比例關系。它解決了目前在生物轉化過程中測定γ-氨基丁酸費時長，成本高，操作繁瑣的缺陷。本裝置測定生物轉化過程中γ-氨基丁酸無需對樣品進行處理，操作簡單易行，耗時短，成本低。
文檔編號C12M1/34GK102732421SQ20121017282
公開日2012年10月17日 申請日期2012年5月30日 優先權日2012年5月30日
發明者張天萌, 張濤, 江波, 沐萬孟, 繆銘 申請人:江南大學