專利名稱：與小麥千粒重和粒長主效qtl緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及小麥分子生物技術與育種應用領域，具體地說是ー種與增加小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用。
背景技術：
小麥是世界上最重要的糧食作物之一，因此高產小麥品種的選育一直被育種家高度重視。小麥產量性狀是復雜的數量 性狀，受多個數量性狀基因位點(Quantitative traitlocus, QTL)控制，具有遺傳カ低、受環境影響大、選擇難度高的特性，所以在選育高產小麥品種時，傳統的育種方法常存在時間長、耗費大、成本高、成果小的問題。分子標記輔助育種是ー種采用與特定性狀相關聯的分子標記作為輔助手段進行育種的有效方法，具有不受環境條件限制、在植物發育的各個組織和生育時期均可檢測、選擇效率高的優勢。研究證明，主要受籽粒大小性狀影響的千粒重是最穩定的產量直接構成因素(Giura and Saulescu,Euphytica. 89: 77-80，1996) ;Snape等曾報道過籽粒大小與產量高度相關(Euphytica.154: 401-408，2007)。可見，小麥的產量與籽粒大小和千粒重具有顯著相關性。因此，研究千粒重和桿粒大小基因，通過分子標記技術，提聞小麥桿粒大小和千粒重獲得聞廣小麥新品種，在育種工作中具有極其重要的意義。小麥山農品系0431是1994年“國際冬春麥雜交篩選圃”(美國，康奈爾大學)的F3·合“Grtpi85504 // MI76-77-S29 / ALD”選育的的ー個大粒、抗病(條紋病、葉銹病、白粉病、根腐病)和抗干熱風的品系，綜合農藝性狀好，是研究千粒重和籽粒大小基因的優異種質資源。目前，尚未有與其千粒重和粒長主效數量基因位點QTL相連鎖的分子標記報道。

發明內容
本發明的目的就是提供ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用，通過發明獲得的與千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記，來檢測小麥品種或品系中是否具有増加千粒重和粒長的QTL，以加快小麥高產品種的選育進程。本發明的目的是通過以下技術方案實現的
本發明所提供的ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記，該分子標記為wmc386和barc216，其所述分子標記wmc386的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所述；所述分子標記如的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO:3所述、右端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲取方法，它包括以下步驟采用分子標記wmc386的引物
左端核苷酸序列 ATCACTGAAACGAAATGAGCGG (如 SEQ ID NO: I 所述)
右端核苷酸序列 TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA (如 SEQ ID NO:2 所述)和分子標記barc216的引物
左端核苷酸序列 TGACGACCCAATCCATAGACA (如 SEQ ID N0:3 所述)、
右端核苷酸序列 GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG (如 SEQ ID NO:4 所述)
對小麥品系山農0431的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，H2O 5. 75μ 1，10XPCR緩沖液 10.0 yl，Taq酶 0.25 μ 1，左右端引物 2.0 μ I,DNA 2. O μ I ;擴增條件為94°C預變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 s，35個循環；72°C延伸10 min ;10°C保存；擴增產物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產物的分子量分別為190 bp和100 bp，即得到與小麥千粒重和粒長主效QTL連鎖的分子標記。 本發明所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記在選育高產小麥中的應用，即為將與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記用于檢測小麥品種或品系的方法，該方法它包括以下步驟
a.用wmc386和barc216的標記引物對小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR 擴增體系為 20 μ ，包含 H2O 5. 75 yl，10XPCR 緩沖液 10. O μ ，Taq 酶 0.25 μ I,左右端引物2.0 μ I,DNA 2.0 μ I ;擴增條件為94°C預變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 S，35個循環；72°C延伸10 min ;10°C保存；
b.將上述擴增產物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如wmc386的擴增產物分子量大小為190 bp的分子標記和barc216的擴增產物分子量大小為100 bp的分子標記同時出現，則該小麥品種或品系為具有増大千粒重和粒長的基因的的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有増大千粒重和粒長基因的品種或品系。本發明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟
(i)以小麥品系山農0431為母本、小麥品種魯麥21為父本進行雜交得到FpF1自交產生F2，采用單粒傳法獲得含有177個株系的F7代RIL群體；
(ii)用改良CTAB法(VanderBeek et al.，1992)提取所述RIL群體各株系的DNA，采用多樣性微陣列技術標記(DArTs標記)、簡單重復序列標記(SSR標記)和基于表達序列標簽的簡單重復序列標記(EST-SSR標記)對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
(iii)利用MAPMAKER3. O作圖軟件將獲得的所述RIL群體的基因型資料構建小麥的分子遺傳圖譜，其LOD ^ 3. O ；
(iv)將所述RIL群體進行田間種植，并對RIL群體的各株系分別進行表型調查，獲得各株系的千粒重和粒長的特征數據；
(V)利用MAPMAKER 3. O和Windows QTL Cartographer 2· 5作圖軟件,米用復合區間作圖法，對每個分子標記的群體基因型資料與對應每個株系的千粒重和粒長進行連鎖分析，在LOD彡3. O時，染色體5Β上的妙-#/ -財f區間中千粒重QTL和粒長QTL的峰值均在wmc386-barc216區間；
(vi)其勝 cJ浙和如標記引物在小麥品系山農0431的DNA中獲得的擴增產物的分子量分別為190 bp和100 bp，即為與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記。在上述方法中所采用的MAPMAKER3. O,Windows QTL Cartographer 2.5軟件均為目前進行遺傳作圖和QTL分析的常用軟件，屬于市售商品，可以通過商業渠道購得。本發明所述小麥品系山農0431的DNA是指對小麥品系山農0431植株的葉片分離提取后獲得的DNA。本發明所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7. 8 g丙烯酰胺和O. 2 g的甲叉丙烯酰胺。
本發明公開的小麥千粒重和粒長緊密連鎖的分子標記wmc386和barc216充分體現了小麥品種或品系的千粒重和粒長的主效QTL，通過該分子標記對小麥衍生品種或品系PCR擴增，可以很快捷地對小麥品種或品系是否具有千粒重和粒長的QTL進行判斷，從而可以快速篩選出具有増加千粒重和粒長QTL的小麥品種或品系，加快高產小麥品種的選育進程。將本發明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記方法用于小麥育種，不僅篩選快速精準，不受環境影響，選擇目標明確，而且節約了生產成本，大大提高了聞廣小麥品種或品系的選擇效率和質量。


圖I為小麥品系山農0431的千粒重和粒長主效QTL在染色體5B上的作圖區間。圖I中空心長方形代表染色體，中間的實心黑圈代表著絲粒位置，右側是分子標記的名稱，左側數字是標記之間的遺傳距離，単位是CM ;圖中共有兩種分子標記，“《Pt”和“rPt”為DArTs標記，bare、gwm與wmc均為SSR標記,標有黑色下劃線的標記為wmc386和barc216 ;染色體左下方的斜線填充的長方形表示QTL作圖區間，其中GL代表粒長性狀；TGff代表千粒重性狀。圖2為小麥品系山農0431為親本的F7代RIL群體的18個衍生品系用wmc386標記弓I物進行PCR擴增的電泳條帶圖。圖3為小麥品系山農0431為親本的F7代RIL群體的18個衍生品系用如標記弓I物進行PCR擴增的電泳條帶圖。
具體實施例方式下面實施例用于進一歩詳細說明本發明，但不以任何形式限制本發明。實施例I
ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記，
采用標記引物wmc386,
左端引物序列 ATCACTGAAACGAAATGAGCGG (如 SEQ ID NO: I 所述)
右端引物序列 TGGTTGGCGGTTTTTCTCTACA (如 SEQ ID NO:2 所述)
和標記引物barc216,
左端引物序列 TGACGACCCAATCCATAGACA (如 SEQ ID NO:3 所述)
右端引物序列 GGTGATTATTCGTGAGTTCCCTGTG (如 SEQ ID N0:4 所述)
對小麥品系山農0431的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為20 μ 1，H2O 5. 75μ 1，10XPCR緩沖液 10.0 yl，Taq酶 0.25 μ 1，左右端引物 2.0 μ I,DNA 2. O μ I ;擴增條件為94 °C預變性4 min; 94 °C變性40 S，55 °C退火45 s，72°C延伸50 S，35個循環；72 °C延伸10 min ;10°C保存；所使用的PCR儀型號為BIO_RAD S1000 THERMAL CYCLER (本發明中所有PCR擴增均采用該型號PCR儀);擴增產物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產物的分子量分別為190 bp和100 bp,即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子
ο本發明提供的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的篩選方法，它包括以下步驟
(i)以大粒小麥品系山農0431為母本、以普通小麥品種魯麥21為父本進行雜交得到雜種F1, F1自交產生F2，采用單粒傳法 獲得含有177個株系的F7代RIL群體；
(ii)用改良的CTAB法，即改良的十六烷基三甲基溴化銨法(VanderBeek et al.，1992)提取上述RIL群體各株系的DNA，采用多祥性微陣列技術標記(DArTs標記)、簡單重復序列標記(SSR標記)和基于表達序列標簽的簡單重復序列標記(EST-SSR標記)對所述株系進行基因型分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；
其中SSR標記和EST-SSR標記分析是將篩選株系的DNA進行PCR擴增，擴增產物在所述8%聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離分析，根據分子標記篩選結果，篩選出親本間有多態的引物，親本間有多態的引物在所選株系中進行分析，獲得所述RIL群體的基因型資料；DArTs標記分析是通過與芯片雜交的技術來辨別不同基因組之間多態性的方法，將各株系基因組DNA經過兩種不同切割頻率的限制性內切酶酶切，再利用切割頻率低的限制性內切酶識別序列的接頭與酶切片斷相連接，繼而通過與該酶切接頭相對應的引物來實現對該特異片斷的PCR擴增。將擴增子用于構建克隆文庫，進而將其經過熒光標記，經變性后點于芯片上作為探針。所要檢測的目標DNA也需經過同樣的內切酶切割和PCR擴增，然后就可與經過熒光標記的靶序列探針來雜交，獲得所述RIL群體的基因型資料；
改良的CTAB法提取葉片中DNA的步驟為取O. 15 O. 2 g新鮮葉片放入2 ml離心管中，迅速放入液氮中至少10 S，快速磨成細粉；加入I ml已預熱至65°C的CTAB提取液，65°C溫育I h，每20 min顛倒混勻離心管或者輕微震蕩溫育；置于4°C冰箱或室溫冷卻至15°C以下；加入I ml溫度4°C的按體積比為1:1的酚和氯仿，上下混勻30 min，然后1000rpm離心20 min ;取700 μ I上清液,加入等體積的體積比為24:1的氯仿-異戍醇,上下混勻30 min,保證樣品與氯仿充分混和；10000 rpm離心20 min ;取上清液500 μ I,加入等體積的冰異丙醇，輕輕上下顛倒管子15次，可以看到核酸沉淀；4°C冰箱靜置30 min左右；10000 rpm離心30 min，棄上清液，I ml 70%的こ醇洗滌沉淀兩次；棄こ醇，吹干DNA，用250μ I I X TE 溶解 DNA ;加入 I. O μ I 2 mg/ml 的 RNase，37°C水浴 30 min 去除 RNA，即得到所需 DNA ；
(iii)利用MAPMAKER3. O作圖軟件，將獲得的RIL群體的基因型資料構建具有740個標記的小麥的分子遺傳圖譜，以LOD彡3. O為標準；其中740個標記是由617個DArTs、118個SSR和5個EST-SSR組成；
(iv)將RIL群體進行了兩年共六個試驗環境的田間種植及表型鑒定，分別考查不同年份和不同環境條件下的各個株系的籽粒性狀和千粒重，其中兩年六個試驗環境即2010年泰安、2011年泰安、2011年菏澤、2011年泰安農科院、2011年煙臺和2011年淄博。其中小麥種植方法RIL群體中每個株系種植5行，行長2 m、行間距25 cm、每行種植70粒種子，正常生長及收獲；千粒重測定方法將收獲后各株系的小麥種子取500粒稱重，重復3次，取平均值計算千粒重；粒長測定方法將收獲后各株系的小麥種子取20粒，首尾相接擺成直線量長度，重復3次，計算籽粒粒長。(V)利用 MAPMAKER 3. O 和 Windows QTL Cartographer 2.5 作圖軟件的前后回歸方法，以LOD ^ 3. O為標準，對每個分子標記的群體基因型資料與對應每個株系的千粒重和粒長進行連鎖分析并作 (vi)由QTL分析可得在染色體5B上分別發現4個環境條件下重復出現千粒重QTL和5個環境條件下重復出現粒長QTL峰值的區間為wmc386-barc216，如職I、表I所示。表I千粒重和粒長的QTL分析結果
權利要求
1.ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記，其特征在于該分子標記為wmc386和barc216，其所述分子標記wmc386的引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO:2所述；所述分子標記如的引物左端核苷酸序列如SEQID NO:3所述、右端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。
2.ー種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于它包括以下步驟 以wmc386和barc216標記弓I物對小麥品系山農0431的DNA分別進行PCR擴增，其PCR擴增體系為H20 5.75 μ 1，10XPCR緩沖液10. O μ 1，Taq酶O. 25 μ 1，左右端引物2.0μ 1，DNA 2. O μ I ;擴增條件為94°C預變性 4 min ;94°C變性 40 s，55°C退火 45 s，72°C延伸50 S，35個循環；72°C延伸10 min ;10°C保存；擴增產物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得對應的擴增產物的分子量分別為190 bp和100 bp，即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子標記；其中wmC386標記引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: I所述、右端核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所述標記引物左端核苷酸序列如SEQ ID NO: 3所述、右 端核苷酸序列如SEQ ID N0:4所述。
3.—種檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于它包括以下步驟， a.用wmc386和barc216的標記引物對小麥品種或品系的DNA分別進行PCR擴增，其PCR 擴增體系為 20 μ ，包含 H2O 5. 75 yl，10XPCR 緩沖液 10. O μ ，Taq 酶 0.25 μ I,左右端引物2.0 μ I,DNA 2.0 μ I ;擴增條件為94°C預變性4 min;94°C變性40 s，55°C退火45 s，72°C延伸50 S，35個循環；72°C延伸10 min ;10°C保存； b.將上述擴增產物分別在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，如wmc386的擴增產物分子量大小為190 bp的分子標記和barc216的擴增產物分子量大小為100 bp的分子標記同時出現，則該小麥品種或品系為具有増大千粒重和粒長的基因的品種或品系，否則，該小麥品種或品系屬于不具有増大千粒重和粒長基因的品種或品系。
4.根據權利要求2所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于所述小麥品系山農0431的DNA是指對小麥品系山農0431植株的葉片分離提取后獲得的DNA。
5.根據權利要求2所述的與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記的獲取方法，其特征在于所述8%聚丙烯酰胺凝膠是指100 ml聚丙烯酰胺溶液中含有7. 8 g丙烯酰胺和O. 2 g的甲叉丙烯酰胺。
6.根據權利要求3所述檢測小麥品種或品系的方法，其特征在于所述的小麥的品種或品系為以小麥品系山農0431為親本，通過采用常規雜交并繁衍至F2代以上、組織培養或玉米與小麥雜交誘導單倍體，再用秋水仙素加倍獲得雙單倍體或采用遺傳轉化方法獲得的小麥品種或品系。
全文摘要
本發明公開了一種與小麥千粒重和粒長主效QTL緊密連鎖的分子標記及其獲取方法和應用，采用標記引物wmc386和barc216對小麥品系山農0431的DNA進行PCR擴增，擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離后，獲得的擴增產物的分子量分別為190bp和100bp，即為小麥千粒重和粒長主效QTL的分子標記。本發明所提供的小麥千粒重和粒長主效QTL分子標記可用于檢測小麥品種或品系中是否含有增加千粒重和粒長的QTL，以便快速篩選出具有增加千粒重和粒長的QTL的小麥品種或品系用于育種，可大大加快小麥高產品種的選育進程。
文檔編號C12Q1/68GK102690822SQ201210178139
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月1日 優先權日2012年6月1日
發明者李斯深, 蒲艷艷 申請人:山東農業大學