專利名稱：一種檢測SKA1基因表達的方法及其siRNA的用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種抑制SKAl基因表達的siRNA，該siRNA的核苷酸序列以及含有該siRNA編碼DNA的重組載體，以及它們的用途。本發明還涉及了可以從組織或者細胞中有效檢測SKAl基因表達的逆轉錄引物，以及該引物在腫瘤診斷中的應用。
背景技術：
RNA干擾是指由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，主要通過阻礙特定基因的翻譯或轉錄來抑制基因表達。研究表明，長度為21 23nt的小干擾RNA分子(small interferingRNA, siRNA)是引起 RNA 干擾的直接原因(Tuschl T, Zamore PD, Sharp PA, BartelDP.RNA1: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to23 nucleotide intervals.Cell 2000,101:25-33.)。RNA 干擾在抑制基因表達方面具有高效性、簡單性和特異性，目前在基因功能研究和疾病治療中發揮了重要作用。近幾年來，RNA干擾已經在腫瘤治療方面也取得了一些成果(Uprichard, Susan L.The therapeuticpotential of RNA interference.FEBS Letters 2005,579:5996-6007)。

SKAl (The spindle and kinetochore associated complex subunit I)基因定位于染色體18q21.1，編碼含有255個氨基酸、分子量約為30kDa的蛋白。目前對SKAl蛋白結構的研究還不深入，只明確了其在N端具有卷曲螺旋結構域(Rual JF, Venkatesan K, HaoT, et al.Towards a proteome—scale map of the human protein-protein interactionnetwork.Nature 2005;437:1173-1178.Sauer G, Korner R, Hanisch A, et al.Proteomeanalysis of the human mitotic spindle.Mol Cell Proteomics 2005;4:35-43.)。最初質譜分析結果表明，SKAl蛋白被確定為紡錘體的組成部分(Cheeseman IM, BrewC, Wolyniak M, et al.1mplication of a novel multiprotein Damlp complex in outerkinetochore function.J Cell Biol.2001; 155:1137-1145.)。后來通過酵母雙雜試驗,發現了紡錘體著絲點復合物(The spindle and kinetochore associated complex, SKA)的另一個亞基SKA2，體外和體內研究結果均表明，SKAl和SKA2相互作用形成穩定的復合體，對于SKA2的穩定以及SKA蛋白在著絲點和微管中的定位是必須的(Hanisch A.，Sillje HHW,Nigg EA.Timely anaphase onset requires a novel spindle and kinetochore complexcomprising Skal and Ska2.EMBO J.2006; 25:5504-5515.)。SKA 復合體對于有絲分裂至關重要，可以使所有染色體的著絲點都排列在赤道板平面上，這對于確保染色體均等分配和維持基因組穩定性十分必要。有絲分裂后期，染色體在紡錘體著絲點微管的作用下移向兩極，并導致紡錘體檢查點沉默，在這個過程中SKAl復合體也是必須的蛋白。然而在當時的研究中，SKAl在染色體分離中的作用并沒有闡述清楚。2009年在Dev Cell和EMBO J雜志上的報道闡述了 SKAl復合體在著絲點和微管界面上發揮功能，并與微管直接作用，在微管上形成低聚裝配體，沿著微管以一種解聚-偶聯的方式運動，參與有絲分裂期間染色體的運動(Welburn JPI, Grishchuk EL, Backer CB, et al.The human kinetochore Skalcomplex facilitates microtubule depolymerization-coupled motility.Dev Cell2009;16:374-385.)D基因組研究表明，SKAl基因所處的18q21.1與慢性淋巴細胞白血病的發生有關(Crowther-Swanepoel D, Broderick P, Di Bernardo MC, et al.Common variants at2q37.3, 8q24.21, 15q21.3 and 16q24.1 influence chronic lymphocytic leukemiarisk.Nature genetics 2010;42:132-136.)。這意味著SKAl可能通過調節有絲分裂過程、細胞周期進展的方式參與腫瘤細胞的惡性增殖。另外，在最初解析SKAl功能的研究中，以微管解聚藥物噻氨酯咕唑(nocodazole)和秋水仙堿(colchicine)處理細胞，發現SKAl在著絲點中的積聚水平降低；對阻滯于有絲分裂期間的細胞，加nocodazole處理，可導致SKAl和微管先后從著絲點上脫離；相反地，當細胞免除了 nocodazole的處理時，SKAl蛋白在著絲點上的定位得以恢復，相應的，紡錘體重新形成。而微管穩定劑紫杉醇(taxol)，并沒有影響 SKAl 在著絲點上的定位(Sauer G,Korner R, Hanisch A, et al.Proteome analysisof the human mitotic spindle.Mol Cell Proteomics 2005; 4:35-43.)。這些研究都提不了 SKAl可能影響某些抗腫瘤藥物敏感性。但是目前并沒有關于SKAl與化療耐藥的報道，了解SKAl蛋白在骨肉瘤中的功能以及對原發耐藥的影響，具有很強的臨床實用價值。逆轉錄PCR,或者稱反轉錄 PCR (reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的一種廣泛應用方式。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。該技術在疾病診斷領域具有廣闊的應用前景。

發明內容
因此，本發明要解決的技術問題就是針對目前在腫瘤原發耐藥臨床診斷和治療中缺乏有效的預測腫瘤原發耐藥的分子診斷標記物和治療腫瘤原發耐藥的分子靶點，提供一種有效的解決方法，即一組能夠有效抑制SKAl基因表達的siRNA，所述siRNA作用的標靶序列以及能夠從組織及細胞中檢測SKAl基因表達的逆轉錄PCR引物和它們在制備或篩選抗腫瘤藥物中的應用。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之一是:一種分離的SKAl基因小分子干擾核糖核酸(siRNA)標靶DNA，其中所述標靶DNA是:(I)SKAl編碼基因上的連續15 27個核苷酸組成的DNA ；(2) SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:4 中任意一條 DNA ;或(3)與(I)或(2)所述的DNA在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸組成的DNA，或者與其互補的DNA。本發明所述分尚的SKAl基因小分子干擾核糖核酸(siRNA)標祀DNA分子,較佳地由SKAl編碼區基因上的連續10 30個核苷酸構成，更佳地為15 27個核苷酸組成的DNA ;最佳地，本發明所述SKAl小分子干擾核糖核酸的標靶基因是SEQ ID NO:1 SEQ IDNO:4中任意一條DNA分子。

其中所述雜交條件根據測量雜交時所用條件的嚴緊性程度來分類。嚴緊性程度可以核酸結合復合物或探針的解鏈溫度Tm為依據，或者以雜交液的鹽或離子強度條件為依據。所述雜交較佳地在標準條件下進行，可根據“分子克隆”中描述的方式進行=ColdSpring Harbor Laboratory Press,分子生物學中的通用方案(Current Protocols inMolecular Biology)。更佳地,多聚核苷酸雜交可以按照如下步驟進行,將一個載有被轉錄的待測DNA或RNA分子的膜與一個標記探針在雜交緩沖液中進行雜交。雜交緩沖液的組成為0.lwt%SDS、5 wt°/4t酸右旋糖苷、加入1/20的稀釋抑制劑以及2 8XSSC。20XSSC為3M氯化鈉和0.3M的檸檬酸組成的溶液。雜交溫度為5(T70°C。在培養幾個小時或過夜后，用清洗緩沖液清洗膜。清洗溫度較佳地為室溫，優選為雜交溫度。清洗緩沖液的組成較佳地為6XSSC+0.1%SDS (wt)溶液，優選為5XSSC+0.1%SDS (wt)。當用這種清洗緩沖液清洗完膜后，就可以通過在DNA或RNA分子內被雜交的探針上的標記來識別DNA或RNA分子。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之二是:本發明所述標靶DNA在篩選抗腫瘤藥物中的應用。本發明所述標靶DNA在篩選抗腫瘤藥物中的應用較佳地為作為藥物靶點。所述藥物靶點是指藥物在體內的作用結合位點，選擇確定新穎的有效藥物點靶是新藥開發的首要任務。合理化藥物設計(rational drug design)可以依據生命科學研究中所揭示的包括酶、受體、離子通道、核酸等潛在的藥物作用靶位，或其內源性配體以及天然底物的化學結構特征來設計藥物分子，以發現選擇性作用于靶點的新藥。通過藥物靶點的選擇和利用，可以大大提高篩選抗腫瘤藥物的效率，縮短抗腫瘤藥物研究的周期。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之三是:一種重組載體，其中所述重組載體包含本發明所述的標 靶DNA或包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任意一條序列。其中所述的標靶DNA包括人工合成的DNA分子或通過PCR等技術從基因組中擴增分離到的DNA分子。本發明所述的重組載體優選地包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任
意一條序列。其中所述的重組載體選自本領域常規的由逆轉錄病毒衍生的載體。所述的病毒衍生的載體包括慢病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關載體、皰疫病毒載體或痘苗病毒載體等，本發明優選慢病毒載體。慢病毒載體的優點是它們能使編碼siRNA的DNA整合到宿主細胞的基因組中，得以產生特定基因被特異性阻抑的細胞系，某些病毒載體可用于體內轉化細胞，從而可直接操縱體內和整個生物的基因表達。慢病毒載體主要是以人類免疫缺陷型病毒(HIV)為基礎，通過去除enV、Vif、Vpr、vpu等毒性基因改造而來，用水泡口炎病毒G糖蛋白來代替HIV-1的包膜進行包裝，宿主范圍廣，能增加病毒的滴度。慢病毒載體的毒性基因已被刪除并被外源基因取代，屬于假型病毒，并且該病毒感染細胞后不能再感染其它細胞，生物安全性高。慢病毒載體對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，并可以在體內較長期穩定的表達。本發明所用的慢病毒載體選自本領域常規的慢病毒載體，優選為pFHlUGW載體。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之四是:一種抑制SKAl基因表達的小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其中所述的siRNA包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含如上所述標靶DNA編碼的RNA分子，所述正義RNA片段和反義RNA片段能夠互補形成雙鏈RNA分子。本發明所述siRNA是一種寡聚RNA分子(長度一般在2廣25核苷酸)。siRNA的主要功能是激發與之互補的目標mRNA的沉默。本發明所述siRNA包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和反義RNA片段通過彼此間互補堿基的互補配對作用形成雙鏈RNA區域。當正義RNA片段和反義RNA片段位于不同的RNA鏈時，形成雙鏈RNA分子；當正義RNA片段和反義RNA片段位于同一條RNA鏈時，則形成具有頸環結構的單鏈RNA分子。本發明所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)長度為較佳地為8 50個核苷酸，其正義片段和反義片段之間互補區域的堿基對較佳地為15 18個堿基對。本發明所述siRNA優選地為:SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8任意一條序列及其互補序列所編碼的RNA，所述的siRNA包括形成雙鏈的RNA分子或單鏈的RNA分子。本發明中所述的核糖核酸分子(DNA)或者脫氧核糖核酸分子(RNA)通過人工合成的方式或者通過從基因組擴增的方式獲得，其方法均為本領域常規使用的方法。本發明所述siRNA包括人工合成的雙鏈干擾RNA(dsRNA)，轉染細胞后在細胞內通過Dicer酶系統加工獲得的siRNA ;通過人工合成直接獲得的siRNA ;或者通過構建相應的慢病毒載體，在標祀細胞內持續表達獲得的siRNA。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之五是:一種慢病毒顆粒，其中所述慢病毒顆粒包含本發明所述的重組載體。所述慢病毒顆粒(Lentivirus)是以HIV-1 (人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒顆粒制備方法較佳地包括以下步驟:將siRNA干擾的目的片段構建到慢病毒載體中，然后與包裝載體共轉染到真核細胞中，所述真核細胞優選地為293T細胞，經過培養后進行慢病毒的回收純化，即得 包裝好的慢病毒顆粒。本發明通過siRNA技術沉默SKAl基因，一較佳的實例包括如下步驟:首先根據SKAl基因的mRNA設計RNA干擾的序列，然后化學全合成編碼該RNA分子的DNA分子，將該DNA插入質粒中，獲得的重組質粒轉染293T細胞,包裝成重組慢病毒。該重組慢病毒的shRNACshort hairpin RNA, shRNA)表達框中含有本發明所述siRNA編碼序列。然后用于轉染腫瘤細胞。重組慢病毒進入細胞后，可能經過了如下步驟:利用逆轉錄酶轉錄出cDNA，然后將含有本發明的cDNA重組到細胞基因組中，利用宿主細胞的酶系統，轉錄出本發明所述針對SKAl基因的shRNA，本發明的SKAlshRNA與RNaseIII核酶家族的Dicer結合，并將其剪切成本發明的siRNA。隨后siRNA與若干個蛋白組成的RNA誘導沉默復合體(RNA-1nducedsilencing complex, RISC)結合,解旋成單鏈,并由該復合體主導RNAi效應。RISC被活化后，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導，序列特異性地結合在SKAl基因mRNA上并切斷SKAl基因mRNA，引發SKAl基因mRNA的特異性分解。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之六是:一種SKAl基因沉默的細胞模型，所述細胞模型包含本發明所述的慢病毒顆粒。本發明所述細胞模型較佳地為真核細胞，更佳地為腫瘤細胞，優選的為人骨肉瘤細胞或結直腸癌腫瘤細胞。本發明所述的SKAl基因沉默的細胞模型的制備方法較佳地包括將本發明所述的慢病毒顆粒轉染真核細胞。其中所述的轉染方法為本領域常規方法，如DEAE-葡聚糖法，磷酸鈣法，陽離子脂質體法，陽離子聚合物法，病毒介導法，生物顆粒傳法(基因槍粒子轟擊法)，顯微注射法，電穿孔法等，本發明優選磷酸鈣法。將包裝好的慢病毒顆粒轉染到細胞系中，進行篩選，得到穩定遺傳的基因沉默細胞模型。其中所述細胞系較佳地為真核細胞系，本發明優選人骨肉瘤細胞，直結腸腫瘤細胞。本發明所述的SKAl基因沉默的細胞模型的制備方法的一較佳實例包括:將包裝成功的重組慢病毒感染人腫瘤細胞，然后用嘌呤霉素進行篩選，挑取篩選的腫瘤細胞克隆，用western-blot方法檢測不同的腫瘤細胞克隆的SKAl蛋白量的情況。結果表明編碼本發明siRNA的DNA序列成功重組到腫瘤細胞基因組中，而且初步證實本發明的siRNA序列能夠抑制SKAl基因的表達。然后挑取SKAl蛋白量較低的腫瘤細胞克隆，連續傳代2代、4代、6代、8代后，用Trizol提取腫瘤細胞mRNA，半定量RT-PCR方法分析腫瘤細胞中SKAlmRNA的降解情況。表明本發明的SKAlsiRNA能夠有效降解腫瘤細胞SKAl基因的mRNA。提取傳代6次和8次的腫瘤細胞克隆中的蛋白，用western-blot方法檢測細胞內SKAl蛋白的含量，表明本發明的siRNA序列能夠穩定抑制SKAl基因的表達。本發明的SKAl基因的siRNA能夠有效降解SKAl基因的mRNA，從而抑制SKAl基因的表達。本發明已經成功的用RNA干擾技術來抑制SKAl基因的表達，獲得了 SKAl基因沉默的細胞模型。本發明的細胞模型與本領域常規的腫瘤細胞培養方法、保存、活化、傳代一樣，通常用10%血清的DMEM培養基，在37°C、含5%C02的細胞培養箱中進行培養，用含20%血清、10% DMSO的DMEM培養基作為凍存液凍存細胞。用含0.25%胰酶和0.02%EDTA的細胞消化液進行消化。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之七是:本發明所述的SKAl基因沉默的細胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應用。所述SKAl基因沉默的細胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應用較佳地包括以下步驟:( 1)使候選藥物與SKAl基因沉默的腫瘤細胞接觸；(2)測試腫瘤細胞的數目；(3)選擇使腫瘤數目下降的候選藥物。本發明利用未進行SKAl基因沉默的普通腫瘤細胞作為對照組。根據本發明，所述的腫瘤細胞較佳地包括人骨肉瘤細胞或結直腸癌腫瘤細胞。利用本發明建立的細胞模型可進行腫瘤原發耐藥性機制以及腫瘤增殖和擴增方面的研究。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之八是:本發明所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)在制備抗腫瘤藥物中的應用。實驗證實SKAl基因在腫瘤細胞的原發耐藥過程中有重要作用。含有SKAl-siRNA的慢病毒顆粒感染了骨肉瘤原發耐藥細胞株后，通過熒光定量PCR和免疫印跡實驗證實內源性SKAl基因的mRNA和蛋白水平都顯著降低。內源性SKAl表達受到抑制后，骨肉瘤原發耐藥細胞株細胞的增殖能力、致瘤能力都顯著降低，對抗腫瘤藥物的敏感性大大增強。本發明所述小分子干擾核糖核酸(siRNA)應用于抗腫瘤藥物的制備和篩選，較佳地作為一種抗腫瘤藥物的增敏劑。本發明所述應用較佳地包括一種藥物組合物，所述藥物組合物至少包括一種本發明所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)作為活性成分和一種藥學上可接受的載體。其中所述的藥物組合物制備方法較佳地采取本領域常規的方法，將本發明所述siRNA作為活性成分，與藥學上可接受的載體制成各種劑型。其中所述的載體是本領域常規的藥用載體，如填充劑、稀釋劑和賦形劑等。在各種制劑中，活性成分的重量含量較佳地為
0.1% 99.9%，優選的重量含量為0.5 90%。本發明解決上述技術問題采取的技術方案之九是:一種SKAl基因的逆轉錄PCR引物。本發明所述SKAl基因的逆轉錄PCR引物分子包括單鏈DNA，通過體外人工合成或通過本領域其他常規技術例如從基因組中分離擴增等方法制備而得。本發明所述的引物為一段寡聚單鏈DNA或RNA分子，可結合在核酸鏈上與之互補的區域，其功為核苷酸聚合作用的起始點，核酸聚合酶可由其3'端開始合成新的核酸鏈。體外人工設計的引物被廣泛用于聚合酶鏈反應、測序和探針合成等。本發明還提供所述SKAl基因的逆轉錄PCR引物分子在腫瘤診斷中的應用。所述應用一較佳實例是:以樣本組織或細胞中提取的RNA為模板，利用本發明所述SKAl基因的逆轉錄PCR引物分子，逆轉錄合成cDNA，再以cDNA為模板擴增目標片段，檢測組織樣本或細胞中SKAl基因的表達量變化，從而診斷腫瘤或腫瘤細胞的發育狀況。本發明所用的原料或試劑除特別說明之外，均市售可得。相比于現有技術，本發明的有益效果如下:本發明設計了針對SKAl基因的逆轉錄PCR引物，RNA干擾靶點序列，構建相應的SKAl shRNA表達載體，其中siRNA能夠顯著下調SKAl基因在mRNA水平和蛋白水平的表達。使用慢病毒作為基因操作工具攜帶RNA干擾載體pHllUGW-SKAl-siRNA-l能夠靶向地將針對SKAl基因的RNA干擾序列高效導入人骨肉瘤細胞Saos-2、SF-86和人結直腸癌細胞RK0，顯著降低SKAl基因的表達水平，顯著提高上述腫瘤細胞的化療藥物敏感性，使其原發耐藥細胞株細胞的增殖能力、致瘤能力都顯著降低，是骨肉瘤和結直腸腫瘤的潛在臨床非手術治療方式之一。本發明提供的SKAl基因的逆轉錄PCR引物，該引物能夠通過檢測SKAl基因在細胞或組織內的表達量變化，對腫瘤進行診斷。·


以下結合

本發明的特征和有益效果。圖1是載體圖譜。圖2是siRNA陽性克隆鑒定圖譜。圖3是MTX藥敏試驗結果。圖4是IFO藥敏實驗結果。圖5是熒光定量PCR結果柱狀圖。
具體實施例方式下面用實施例來進一步說明本發明，但本發明并不受其限制。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所述的“室溫”是指進行試驗的操作間的溫度，一般為25°C。實施例1針對SKAl的siRNA設計通過Invitrogen的在線siRNA設計軟件,選取網站評價較高的四條siRNA序列。通過NCBI網站，對siRNA序列進行比對分析(Blast分析)。發現這四條siRNA序列與除SKAl以外的其他基因沒有顯著地同源性。四條針對SKAl的siRNA序列見表I。表ISKAl基因的siRNA作用標靶序列
權利要求
1.一種分離的SKAl基因小分子干擾核糖核酸(SiRNA)標靶DNA，其特征在于，所述標靶DNA是: (1)SKAl編碼基因上的連續15 27個核苷酸組成的DNA； (2)SEQ ID NO:1 SEQ ID NO:4中任意一條序列；或 (3)與(I)或(2)所述的DNA在嚴緊雜交條件下雜交的多核苷酸組成的DNA，或者與其互補的DNA。
2.權利要求1所述的標靶DNA在篩選抗腫瘤藥物中的應用。
3.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體包含如權利要求1所述的標靶DNA或包含SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:8中任意一條序列。
4.一種抑制SKAl基因表達的小分子干擾核糖核酸(siRNA)，其特征在于，所述的siRNA包括正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段包含權利要求1所述標靶DNA編碼的RNA分子，所述正義RNA片段和反義RNA片段能夠互補形成雙鏈RNA分子。
5.一種慢病毒顆粒，其特征在于，其包含如權利要求3所述的重組載體。
6.一種SKAl基因沉默的細胞模型，其特征在于，其包含如權利要求5所述的慢病毒顆粒。
7.如權利要求6所述的SKAl基因沉默的細胞模型在篩選抗腫瘤藥物中的應用。
8.權利要求4所述的小分子干擾核糖核酸(siRNA)在制備抗腫瘤藥物中的應用。
9.一種SKAl基因的逆轉錄PCR引物。
10.如權利要求9所述的SKAl基因的逆轉錄PCR引物在診斷腫瘤中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抑制SKA1基因表達的siRNA，所述的siRNA的長度為15～27bp。本發明還公開了含有該siRNA的重組載體，該重組載體轉染真核細胞，即得到SKA1基因沉默的細胞。本發明的siRNA序列能夠有效降解SKA1基因的mRNA，從而特異性抑制SKA1基因的表達。本發明所述siRNA可用于制備與SKA1基因相關疾病包括腫瘤的治療藥物；同時對于研究SKA1基因在腫瘤耐藥性中的作用，對腫瘤特別是骨肉瘤、結直腸惡性腫瘤的臨床非手術治療具有重要的意義。本項發明還公開了可以從組織或者細胞中有效檢測SKA1的逆轉錄PCR引物，以及該引物在腫瘤診斷中的應用。
文檔編號C12N7/01GK103255137SQ20121017746
公開日2013年8月21日 申請日期2012年5月31日 優先權日2012年5月31日
發明者姚陽, 沈贊, 勞昕元, 余文熙 申請人:上海黃離生物科技有限公司