專利名稱：對FcRn的結合被改變的Fc變體的制作方法
技術領域：
本申請涉及優化的IgG免疫球蛋白變體，產生他們的加工方法以及他們的應用， 特別是用于治療目的。
背景技術：
抗體是結合特異性抗原的免疫蛋白。在包括人和小白鼠的大多數哺乳動物中，可以從配對的重多肽鏈和輕多肽鏈構建抗體。每條鏈都由獨立的免疫球蛋白(Ig)域組成，因此統稱術語免疫球蛋白被用來描述這種蛋白。每條鏈由稱為可變區和恒定區的兩個不同的區組成。輕鏈和重鏈可變區顯示出抗體之間顯著的序列多樣性，他們負責結合靶抗原。恒定區顯示出較低的序列多樣性，而且他們負責結合許多天然蛋白以引起重要的生化事件。人類有五種不同類別的抗體，包括IgA (包括亞類IgAl和IgA2)、IgD、IgE、IgG (包括亞類IgGU IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。雖然這些抗體的V區可以存在細微的差異，但他們之間的區別特征在他們的恒定區。圖I顯示了在這里作為描述免疫球蛋白一般結構特點的實例的IgGl抗體。IgG抗體是由兩條重鏈和兩條輕鏈組成的四聚體蛋白。IgG重鏈由從N-到C-末端依次為VH-CH1-CH2-CH3的四個免疫球蛋白域組成，VH-CH1-CH2-CH3分別被稱為重鏈可變域、重鏈恒定域I、重鏈恒定域2和重鏈恒定域3 (也稱為VH-C y I-C y 2-C y 3，分別指重鏈可變域、恒定Y I域、恒定Y 2域和恒定Y 3域)。IgG輕鏈由從N-到C-末端依次為VL-CL的兩個免疫球蛋白域組成，VL-CL分別被稱為輕鏈可變域和輕鏈恒定域。抗體的可變區包含該分子的抗原結合決定簇，因此它決定了抗體對靶抗原的特異性。可變區的序列與來自同一類別的其他抗體的序列差異最大，可變區也因此得名。序列差異性大部分發生在互補決定區(⑶Rs)。總共有6個⑶Rs，重鏈和輕鏈各三個，被命名為VHCDRUVH CDR2、VH CDR3、VL CDRUVL CDR2 和 VL CDR3。CDRs 外的可變區被稱為骨架(FR)區。雖然FR區的變化不如⑶Rs大，但不同抗體之間的FR區也會出現序列差異。總的說來，抗體的這些特征性結構提供了穩定的支架(FR區)，免疫系統基于該支架能探索實質性的抗原結合多樣性(CDRs)以獲得針對較寬抗原系列的特異性。可以獲取來自不同生物體的多種可變區片段的大量高分辨率結構，其中一些可變區片段是非結合的，一些與抗原形成了復合物。已經能很好地表征抗體可變區的序列和結構特點(Morea et al.，1997, BiophysChem68:9-16 ；Morea et al. , 2000, Methods 20:267-279，全部引入作為參考)、抗體的保守特征已經使大家能開發大量的抗體工程技術(Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng2:339-376，全部引入作為參考)。例如將來自一種抗體，例如鼠抗體的⑶Rs嫁接到另一種抗體，例如人抗體的框架區上是可的。在本領域被稱為"人源化"的這一過程能從非人類抗體產生免疫原性較低的抗體治療劑。當不存在抗體其他區時，包含可變區的片段可以存在，包括，例如包含VH-C y I和VH-CL的抗原結合片段(Fab)、包含VH和VL的可變區片段(Fv)、在同一條鏈中包含連接在一起的VH和VL的單鏈可變區片段(scFv)，以及多種其他可變區片段。抗體的Fe區與大量Fe受體和配體相互作用，賦予抗體一系列重要的被稱為效應器功能的性能。如圖I和2所示，IgG的Fe區包含Ig域C Y 2，C Y 3和引入C Y 2的N-末端鉸鏈。IgG類Fe受體的重要家族是Fe Y受體(Fe YRs)。這些受體介導抗體和免疫系統細胞臂之間的聯系(Raghavan et al. , 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220;Ravetch et al.，2001，Annu Rev Immunol 19:275-290，都全部引入作為參考)。在人類中，這些蛋白家族包括包含亞型Fe y RIa, Fe y RIb和Fe y RIc的Fe y RI (CD64)，包含亞型 Fe yRIIa(包括同種異型 H131 和 R131)、Fe Y RIIb (包括 Fe y RIIb-I 和 Fe y RIIb-2) 和Fe y RIIc的Fe y RII (CD32)；以及包含亞型Fe y RIIIa(包括同種異型V158和F158)和 Fe Y RIIIb(包括同種異型 Fe YRIIIb-NA I 和 Fe Y RIIIb_NA2)的 Fe Y RIII (CD16)(Jefferis et al. , 2002, Immunol Lett 82:57-65，全部引入作為參考)。這些受體通常具有介導與Fe結合的胞外域、跨膜區和介導細胞內一些信號事件的胞內域。這些受體在包括單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、郎格罕氏細胞、自然殺傷(NK)細胞和Y YT細胞的多種免疫細胞中表達。Fc/Fc Y R復合物的形成將這些效應細胞招募到結合抗原的位點，通常會導致細胞內發生信號發送事件和隨后重要的免疫反應，例如炎癥介質的釋放、B細胞激活、內吞作用、吞噬作用和細胞毒素攻擊。調節細胞毒素和吞噬效應器功能的能力是抗體破壞靶細胞的潛在機制。細胞介導的其中表達Fe Y Rs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上結合的抗體并隨后導致靶細胞裂解的反應被稱為抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)(Raghavan et al. ,1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220 ;Ghetie et al. , 2000, AnnuRev Immunol18:739-766 ；Ravetch et al. , 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290,全部引入作為參考)。細胞介導的其中表達FcyRs的非特異性細胞毒性細胞識別靶細胞上結合的抗體并隨后引起靶細胞吞噬作用的反應被稱為抗體依賴細胞介導的吞噬作用(ADCP)。已經弄清楚人Fe Y Rs，包括Fe y RIIa(pdb登記入冊代碼1H9V，全部引入作為參考)(Sondermann et al.，2001，J Mol Biol 309:737-749，全部引入作為參考)(pdb 登記入冊代碼 1FCG，全部引入作為參考)(Maxwell et al.，1999，Nat Struct Biol 6:437-442，全部引入作為參考)、Fe y RIIb (pdb登記入冊代碼2FCB,全部引入作為參考)(Sondermannet al.，1999，Embo J18:1095-1103，全部引入作為參考)和Fe Y RIIIb (pdb登記入冊代碼 1E4J，全部引入作為參考)(Sondermann et al. , 2000, Nature 406:267-273，全部引入作為參考)的細胞外域的大量結構。所有Fe YRs都結合圖I顯示的Fe上的C Y2域的N-末端和鉸鏈之前的相同區。從結構上可以很好地表征這一相互作用(Sondermann etal.,2001, J Mol Biol 309:737-749，全部引入作為參考)，已經弄清楚結合到人Fe Y RIIIb的細胞外域的人Fe的幾個結構(pdb登記入冊代碼1E4K,全部引入作為參考)(Sondermannet al. , 2000, Nature 406:267-273, entirely incorporated by reference,全部引入作為參考)(pdb登記入冊代碼IIIS和1IIX，全部引入作為參考)(Radaev et al.，2001，JBiol Chem276:16469-16477，全部引入作為參考)，而且他們具有人IgE Fc/Fc e RI a復合物的結構(pdb登記入冊代碼1F6A,全部引入作為參考)(Garman et al. , 2000, Nature406:259-266，全部引入作為參考)。不同的IgG亞類對Fe YRs具有不同的親和力，IgGl和IgG3通常比IgG2和IgG4能更好地結合受體(Jefferis et al. , 2002, Immunol Lett 82:57-65,全部引入作為參考)。所有的Fe Y Rs可以結合IgG Fe上的相同區，但親和力不同高親和力結合劑Fe Y RI結合IgGl的Kd為IO-8M'而低親和力受體Fe Y RII和Fe Y RIII結合時的Kd通常分別為1(T6和10' Fe Y RIIIa和Fe Y RIIIb的細胞外域的96%是相同的；但是，Fe Y RIIIb沒有胞內信號發送域。而且，Fe Y RI、Fcy Rlla/c和Fe Y RIIIa是免疫復合物觸發激活的正調節物，其特征在于具有有基于酪氨酸的免疫受體激活基序(ITAM)的胞內域，而Fe Y RIIb具 有基于酪氨酸的免疫受體抑制基序(ITIM)，因此它是抑制性的。因此前者被稱為激活受體，Fe Y RIIb被稱為抑制性受體。該受體的表達模式和水平在不同的免疫細胞上也不相同。復雜的另一水平在于人蛋白組中存在大量Fe Y R多態性。具有臨床意義的特別相關的多態性是V158/F158Fc y RIIIa0人IgGl結合到V158同種異型上的親和力比結合到F158同種異型上的親和力大。已經證明親和力差異，以及推測的該差異對ADCC和/或ADCP的影響是抗⑶20抗體利妥昔單抗(Rituxan ，BiogenIdec)功效重要的決定因素。具有V158同種異型的病人能更順利地對利妥昔單抗治療作出響應；但是，具有較低親和力的F158同種異型的病人的響應弱(Cartron et al.，2002，Blood 99:754-758，全部引入作為參考)。大約 10-20% 的人是 V158/V158 純合子，45% 是 V158/F158 雜合體，35-45% 的人是 F158/F158純合子(Lehrnbecher et al. , 1999，Blood94:4220-4232 ；Cartron et al. , 2002, Blood99:754-758，都全部完全引入作為參考)。因此，80-90%的人是弱應答者，也就是說他們擁有F158 Fe YRIIIa的至少一個等位基因。圖I顯示的Fe上的重疊但分離的位點起補體蛋白Clq分界面的作用。Fc/Clq的結合介導補體依賴性細胞毒性(CDC)，方式與Fc/Fc Y R結合介導ADCC相同。Clq與絲氨酸蛋白酶Clr和Cls形成復合物以產生Cl復合物。Clq能結合六個抗體，但是結合兩個IgGs就足以激活補體級聯反應。與Fe和Fe y Rs的相互作用相似，不同的IgG亞類對Clq具有不同的親和力，1區61和1863通常比1862和1864能更好地結合？(^1^(>打虹匕etal. , 2002, Immunol Lett 82:57-65，全部引入作為參考)。在IgG中，位于Fe上Cg2和Cg3域之間的位點(圖I)介導與新生受體FcRn的相互作用，其中結合可以讓來自內體的內吞抗體再循環到血流中(Raghavan et al.，1996，AnnuRev Cell Dev Biol 12:181-220 ;Ghetie et al.，2000，Annu Rev Immunol 18:739-766，都全部引入作為參考)。這一過程與防止大的全長分子引起的腎臟濾過一起產生一到三周的有利的抗體血清半衰期。Fe與FcRn的結合在抗體轉運中也起關鍵作用。Fe上結合FcRn的位點也是細菌蛋白A和G結合的位點。與這些蛋白的緊密結合通常可以用作蛋白純化期間，使用蛋白A或蛋白G親和色譜法純化抗體的方式。因此，Fe上該區域的保真度對抗體的臨床特性和他們的純化都很重要。可利用的大鼠Fc/FcRn復合物(Burmeisteret al. , 1994, Nature, 372:379-383 ；Martin et al. , 2001, Mol Cell 7:867-877，都全部引入作為參考)、以及Fe與蛋白A和G的復合物(Deisenhofer, 1981, Biochemistry20:2361-2370 ；Sauer-Eriksson et al.,1995,Structure 3:265-278 ；Tashiro etal. , 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481，都全部引入作為參考)的結構提供了洞察Fe與這些蛋白相互作用的方式。FcRn受體也負責將IgG轉移到新生兒的腸道和成年人的腸上皮腔中(Ghetie and Ward, Annu. Rev. Immunol. , 2000, 18:739-766 ；Yoshida etal.，Immunity, 2004，20(6) : 769-783，都全部引入作為參考)。對大鼠和人Fe域的研究表明，一些Fe殘基對結合FcRn很重要。大鼠和人序列在Fe區(Kabat等編號的殘基237-443)具有大約64%的序列同一性。大鼠/人Fe、FcRn重鏈和FcRn輕鏈(￠-2-微球蛋白)的比對參見圖3，4和5。根據現有大鼠Fc/FcRn復合物結構構建了人 Fc/FcRn 復合物模型(Burmeister et al. , 1994, Nature, 372:379-383 ；Martinet al.,2001, Mo I Cell 7:867-877，全部引入作為參考)。大鼠和人序列共用一些對FcRn結合起關鍵作用的殘基，例如 H310 和 H435 (Medesan et al.，1997J. Immunol. 158 (5) : 221-7 ；Shields et al. , 2001, J. Biol. Chem. 276 (9) : 6591-6604,都全部引入作為參考)。但是，人和大鼠蛋白在多個位點具有不同的氨基酸，致使上述殘基在人序列中與在大鼠序列中相t匕，處于不同的環境，并且可以有不同的特性。這種差異性限制了將特性從一種同系物轉移 到另一種同系物的能力。在鼠Fe Y中，位點T252、T254和T256的隨機突變和噬菌體展示選擇導致產生了FcRn親和力增加3. 5倍，血清半衰期增加I. 5倍的三聯突變體T252L/T254S/T256F (Ghetieet al.，1997, Nat. Biotech. 15(7) :637-640，全部引入作為參考)。大鼠Fc/FcRn復合物的晶體結構鑒定了對FcRn結合重要的Fe殘基(Burmeisteret al. Nature. 372:379-383(1994) ；Martin et al. Molecular Cell. 7:867-877(2001)，都全部引入作為參考)。在1994年已經確定了分辨率為的原始Fc/FcRn復合結構(表2a, Burmeister et al. Nature. 372:379-383 (1994),全部引入作為參考)。Marin 等在2001年確定的更高分辨率結構顯示了側鏈位置更詳細的視圖(Martin et al. MolecularCell. 7:867-877(2001)，全部引入作為參考)。利用包含破壞FcRn結合的突變T252G/I253G/T254G/H310E/H433E/H435E的一個單體與包含野生型Fe單體的一個單體的Fe 二聚體確定了結合大鼠FcRn的大鼠Fe的晶體結構。人Fe Y的突變研究已經對結合FcRn重要的一些殘基進行了研究，結果表明他們具有增加的血清半衰期。Hinton等在人Fe y I中逐一地將三個殘基突變成了另外19種常見的氨基酸。Hinton等發現一些點突變的雙重突變體增加了 FcRn結合親和力(Hinton etal.，2004，J. Biol. Chem. 279(8) :6213_6216，全部引入作為參考)。兩種突變增加了在猴中的半衰期。Shields等幾乎專門將殘基突變成了 Ala，并研究了他們對FcRn和Fe Y R的結合(Shields et al.，2001，J. Biol. Chem.，276(9) :6591-6604，全部引入作為參考)。DalI’ Acqua等利用曬菌體展示選擇了結合FcRn的親和力增加的Fe突變(Dali’Acqua et al. 2002，J. Immunol. 169:5171-5180，全部引入作為參考)。選擇的 DNA 序列主要是雙重和三重突變體。參考文獻中已經表達了由許多所選擇的序列編碼的蛋白，而且發現一些蛋白能比野生型Fe更緊密地結合FcRn。施用作為治療劑的抗體和Fe融合蛋白需要以與蛋白清除和半衰期特征相關的規定頻率進行注射。體內半衰期較長可以容許次數更少的注射或以較低的劑量給藥，而這顯而易見是有利的。雖然過去對Fe域的突變已經導致一些蛋白對FcRn的結合親和力增加和體內半衰期延長，但還沒有從這些突變中鑒定出具有增強的體內半衰期的最佳突變。Fe區的一個特征是發生在圖I顯示的N297上的保守N連接糖基化。有時提到這種糖或低聚糖對抗體的結構和功能起決定性作用，而且也是必須利用哺乳動物表達系統生產抗體的主要原因之一。Umafia et al. , 1999, Nat Biotechnol 17:176-180 ；Davies et al.,2001,Biotechnol Bioeng 74:288-294;Mimura et al.,2001,J BiolChem 276:45539-45547. ；Radaev et al. , 2001,J Biol Chem 276:16478-16483 ；Shields et al. , 2001, J Biol Chem 276:6591-6604 ；Shields et al. , 2002, J Biol Chem277:26733-26740 ;Simmons et al. , 2002,JTmmunoI Methods 263:133-147 ;Radaev etal., 2001, J Biol Chem276:16469-16477和Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989，都全部引入作為參考)。已經開發出用于治療的抗體。與這種治療相關的代表性的出版物包括Chamowet al.，1996，Trends Biotechnol 14:52-60 ；Ashkenazi et al.，1997，Curr Opin Immunol 9:195-200，Cragg et al.， 1999，Curr Opin Immunol 11:541-547 ;Glennieet al.，2000，Immunol Today 21:403-410，McLaughlin et al.，1998，J Clin Oncol16:2825-2833和Cobleigh et al.，1999，J Clin Oncol 17:2639-2648，都全部引入作為參考。在目前的抗癌治療中，死亡率方面的任何小的改進都能決定成功。這里公開的某些IgG變體增強了抗體限制靶癌細胞進一步生長或破壞，至少部分破壞靶癌細胞的能力。抗體的抗腫瘤效能是通過他們介導細胞毒素效應器功能，例如ADCC、ADCP和⑶C的能力的增強實現的。實施包括Clynes et al. , 1998, Proc Natl Acad Sci USA95:652-656；Clynes et al.,2000, Nat Med 6:443-446 和 Cartron et al.,2002, Blood99:754-758，都全部引入作為參考。人IgGl是最經常用于治療目的的抗體，在上下文中已經構建了大部分加工設計研究過程。IgG類的不同同種型，包括IgGl、IgG2、IgG3和IgG4具有獨特的物理、生物和臨床特性。本領域需要設計改善的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4變體。更進一步地需要設計與天然IgG多肽相比，對FcRn的結合被改善和/或體內半衰期延長的這種變體。本申請滿足了這些需要及其他需要。發明概述本發明公開了對FcRn受體的結合增強和體內血清滯留延長的Fe域新變體的產生，Fe域包括在抗體、Fe融合物和免疫粘附物中發現的那些Fe域。本發明另一方面是，使FcRn結合相對于野生型增加(具體在較低pH,大約pH 6. 0時)，以促進內體中的Fc/FcRn結合。本發明另一方面是，設計的變體在大約PH 6時的結合優于它們在大約pH 7. 4時的結合，這樣可以促進Fe在細胞內再循環后再次釋放到血液中。本發明另一方面涉及，設計對FcRn的結合降低和體內半衰期縮短的Fe變體。這種蛋白包含使FcRn親和力降低和/或使體內半衰期縮短的突變，它們可用于多種治療和診斷，包括遞送和監測放療，在所述放療中，放射標記物的半衰期理論上大約等于它的蛋白偶聯物的體內半衰期。本發明另一方面涉及改變與FcR，例如人中的Fe yRI、FcyRIIa, FcyRIIb,Fe Y RIIIa結合的Fe域。這些受體負責誘導抗體的各種效應器功能。因此，本發明另一方面涉及改變Fe域的效應器功能，例如抗體依賴細胞介導的細胞毒作用(ADCC)、補體依賴性細胞毒性(CDC)和抗體依賴細胞介導的吞噬作用(ADCP)。本發明另一方面涉及一種Fe變體，其FcRn結合有變且Fcg結合有變，導致對包含該Fe的蛋白的體內半衰期和效應器功能都產生影響。例如這些變體可具有延長的體內半衰期和改進的ADCC。例如，所述變體可具有延長的半衰期和降低的CDC。本發明另一方面提供了編碼變體Fe蛋白的重組核酸、表達載體和宿主細胞。另一方面，本發明提供了產生包含Fe變體的蛋白的方法，該方法包括在適合表達該蛋白的條件下培養本發明的宿主細胞。本發明另一方面提供了包含本發明的變體Fe蛋白和藥學載體的藥物組合物。本發明另一方面提供了治療紊亂的方法，包括給病人施用包含本發明的變體Fe的蛋白。 另一方面，本發明提供了在所述親代多肽的Fe區包含至少一個修飾的親代Fe多肽的Fe區變體，其中與親代多肽相比，所述變體蛋白對FcRn的結合顯示出改變，而且其中所述 Fe 變體包含至少一個選自由 246H，246S, 247D, 247T, 248H, 248P, 248Q, 248R, 248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251K，251M,251N,251T,251V,251Y, 252F, 252L, 253L,253T,253V,254H,254L,254N,254T,254V, ~254N,255E,255F,255H,255K,255S,255V,256E,256H,256V,257A,257C,257D,257E,257F,257G,257H,2571,257K,257L,257M,257N,257Q,257R,257S,257T,257V,257W,257Y,258R,258V,279A,279C,279D,279F,279G,279H,2791，279K,279L,279M,279N,279P,279Q,279R,279S, 279T, 279W, 279Y,280E,280H, ~281A, ~281D,~281S, ~281T,282D,282F,282H,2821，282T，283F,2831，283L，283Y,284H,284K,284P,284Q,284R,284S,284Y,285S,285V,286#，286L,287H,287S,287V,287Y,288H,288Q,288R,288S,305H,305T,306F,306H,3061，306N,306T,306V,306Y,307D,307V,307Y,308A,308C,308D,308E,308F,308G,308H,3081，308K,308L,308M,308N,308P,308Q,308R,308S,308T, 308W,308Y,309F,309H,3091,309N,309P,309Q,309V,309Y,310K,310N,310T,311H,311L,31IS,311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S,374H,374S,376H,376L,378H,378N,380T,380Y,382H,383H,383K,383Q,384E,384G,384H,385A,385C,385D,385E,385F,385H,3851，385K,385L,385M,385N,385P,385Q,385R,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#,387A,387H,387K,387Q,389E,389H,426E,426H,426L, 426N,426R,426V,426Y,4271，429D,429F,429K,429N,429Q,429S,429T,429Y,430D,430H,430K,430L,430Q,430Y,431G,431H,4311，431P，431S,432F,432H,432N,432S,432V,433E,433N,433P,433R,433S,434H,434Q,434S,434Y,435N,436E,436F,436H,436L, 436Q, 436V, 436W, 437E, 437V, 438E, 438H 和 438K 組成的群組的修飾。其中參照 EU 指數進行編號，~表示在指定位置后的插入，#表示指定位置的缺失。在另一方面，本發明提供了包含至少一個選自由246H，246S，247D，247T，248H，248P,248Q,248R,248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251K，251M,251N,251T,251V,251Y,252L,253L,253T,253V,254H,254L,254N,254V, ~254N,255E,255F,255H,255K,255S,255V,256H,256V,257A,257C,257D,257E,257F,257G,257H,2571，257K,257L,257M,257N,257Q,257R,257S,257T,257V,257W,257Y,258R,258V,279A,279C,279D,279F,279G,279H,2791，279K，279M,279N,279P,279Q,279R,279S,279T,279W,279Y,280H, ~281A, ~281D,~281S, ~281T,282D,282F,282H,2821，282T，283F,2831，283L，283Y,284H,284K,284P,284Q,284R,284S,284Y,285S,285V,286#,286L,287H,287S,287V,287Y,288H,288Q,288S,305H,305T,306F,306H,3061，306N,306T,306V,306Y,307D,307V,307Y,308C,308E,308F,308G,308H,3081,308K,308L,308M,308N,308P,308Q,308R,308S,308W,308Y,309F,309H,309N,309Q，309V，309Y，310K，310N，3 10T，311L，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q,315S，315T，317H，317S，339P, 340P,341S, 374H, 374S,376H, 376L, 378H, 378N, 380T,380Y,382H,383H,383K,383Q,384E,384G,384H,385A,385C,385F,385H,3851，385K,385L,385M,385N,385P,385Q,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#,387A,387H,387K,387Q,389E,389H,426E,426H,426L,426N,426R,426V,426Y,4271，429D,429F,429K,429N,429Q,429S,429T,429Y,430D,430H,430K,430L,430Q,430Y,431G,431H,4311,431P,431S,432F,432H,432N,432S,432V,433E,433N,433P, 433S, 434H, 434Q, 434S, 435N, 436E,436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H 和 438K 組成的群組的修飾的 Fe 變體。在另一方面，本發明提供了包含至少一個選自由246H，246S，247D，247T，248P，248Q,248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251T，251V,252L,253L,253T,253V,254H,254L,254N,254V, ~254N,255E,255H,255K,255V,256H,256V,257A,257C,257F,257G,2571，257L,257M,257N,257Q,257S,257T,257V,257W,257Y,258V,279A,279C,279F,2791,279P,279S，279T，279W，279Y， ~281A, ~281D, ~281S, ~281T，282F，2821，282T，283F，2831，283L，283Y,284P,285V,286#,286L,287V,288Q,288S,305T,306F,306H,3061,306N,306T,306V,306Y,307V,308C,308F,308G,308L,308M,308N,308P,308Q,308S,308W,308Y,309F,309N,309Q，309V，309Y，310T，311L，311T，311V，311W，313Y，315G，315Q，315S，315T，339P，340P，341S,374H,374S,376L,378H,378N,380T,380Y,382H,383Q,384E,384G,384H,385A,385C,385F,3851，385L,385M,385N,385P,385Q,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#,387A,387H,387K,387Q,389H,426L,426N,426V,426Y,4271，429D,429F,429K,429N,429Q,429S，429T，429Y,430L,431G,4311，431P，431S，432F，432H,432V,433E,433N,433P,433S,434H,434Q,434S,435N,436F,436L,436V,436W,437E 和 437V 組成的群組的修飾的 Fe變體。本發明涉及I.親代多肽的Fe變體，其在所述親代多肽的Fe區包含至少一個修飾，與親代多肽相比，所述變體蛋白對FcRn的結合顯示出改變，且所述Fe變體包含至少一個選自由246H,246S,247D,247T,248H,248P,248Q,248R,248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251K,251M,251N,251T,251V,251Y,252F,252L,253L,253T,253V,254H,254L,254N,254T,254V, ~254N,255E,255F,255H,255K,255S,255V,256E,256H,256V,257A,257C,257D,257E,257F,257G,257H,2571,257K,257L,257M,257N,257Q,257R,257S,257T,257V,257W,257Y,258R,258V,279A,279C,279D,279F,279G,279H,2791，279K,279L,279M,279N,279P,279Q,279R, 279S,279T,279W,279Y,280E,280H, ~281A, ~281D, ~281S, ~281T,282D,282F,282H,2821，282T，283F,2831，283L，283Y, 284H,284K,284P,284Q,284R,284S,284Y,285S,285V,286#,286L,287H,287S,287V,287Y,288H,288Q,288R,288S,305H,305T,306F,306H,3061，306N,306T, 306V, 306Y,307D,307V,307Y,308A,308C,308D,308E,308F,308G,308H,3081，308K,308L,308M,308N,308P,308Q,308R,308S,308T,308W,308Y,309F,309H,3091, 309N,309P，309Q，309V，309Y，310K，310N，310T，311H，311L，311S，311T，311V，311W，312H，313Y，315E，315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P，340P，341S，374H，374S，376H，376L，378H,378N,380T,380Y,382H,383H,383K,383Q,384E,384G,384H,385A,385C,385D,385E,385F, 385H, 3851, 385K,385L,385M,385N,385P,385Q,385R,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#，387A,387H,387K,387Q,389E,389H,426E，426H，426L,426N, 426R,426V,426Y,4271，429D, 429F, 429K, 429N,429Q,429S,429T，429Y，430D,430H,430K,430L,430Q,430Y,431G,431H,4311，431P，431S，432F，432H,432N,432S,432V,433E,433N,433P,433R,433S,434H,434Q,434S,434Y,435N,436E,436F,436H,436L,436Q,436V,436W,437E,437V，438E，438H和438K組成的群組的修飾，其中參照EU指數進行編號，~表示在指定位置后的插入，#表示指定位置的缺失。2.依照項I的Fe變體，其中所述Fe變體包含至少一個選自由246H，246S，247D，247T, 248H,248P,248Q,248R,248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251K，251M,251N,251T,251V,251Y,252L,253L,253T,253V,254H,254L,254N,254V, ~254N,255E,255F,255H,255K,255S,255V,256H,256V,257A,257C,257D,257E,257F,257G,257H,2571，257K,257L, 257M,257N,257Q,257R,257S,257T,257V,257W,257Y,258R,258V,279A,279C,279D,279F,279G,279H,2791，279K，279M,279N,279P,279Q,279R,279S,279T,279W,279Y,280H, ~281A,~281D, ~281S, ~281T，282D，282F，282H,2821,282T,283F,2831，283L，283Y,284H,284K,284P,284Q,284R,284S,284Y,285S, 285V, 286#, 286L, 287H, 287S,287V,287Y,288H,288Q,288S,305H,305T,306F,306H,3061，306N,306T,306V,306Y,307D,307V,307Y,308C,308E,308F,308G,308H,3081,308K,308L,308M,308N,308P,308Q,308R,308S,308W,308Y,309F,309H,309N,309Q,309V,309Y,310K,310N,310T,311L,311T,311V,311W,312H,313Y,315E,315G，315H，315Q，315S，315T，317H，317S，339P,340P,341S,374H,374S,376H,376L,378H,378N,380T,380Y,382H,383H,383K,383Q,384E,384G,384H,385A, 385C,385F,385H,3851，385K,385L,385M,385N,385P,385Q,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#,387A,387H,387K,387Q,389E,389H,426E,426H,426L,426N,426R,426V,426Y,4271，429D,429F,429K,429N,429Q,429S,429T,429Y,430D,430H,430K,430L,430Q,430Y,431G,431H,4311,431P,431S,432F,432H,432N,432S,432V,433E,433N,433P,433S,434H,434Q,434S,435N, 436E, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E, 437V, 438H 和 438K 組成的群組的修飾。3.依照項2的Fe變體，其中所述Fe變體包含至少一個選自由246H，246S，247D，247T,248P,248Q,248Y,249T,249W,251D,251E,251H,2511，251T，251V, 252L, 253L, 253T,253V,254H,254L,254N,254V, ~254N,255E,255H,255K,255V,256H,256V,257A,257C,257F,257G,2571,257L,257M,257N,257Q,257S,257T,257V,257W,257Y,258V,279A,279C,279F,2791,279P,279S,279T,279W,279Y, ~281A, ~281D, ~281S, ~281T，282F，2821，282T，283F，2831, 283L, 283Y,284P,285V,286#,286L,287V,288Q,288S,305T,306F,306H, 3061,306N,306T,306V,306Y,307V,308C,308F,308G,308L,308M,308N,308P,308Q,308S,308W,308Y,309F,309N,309Q,309V,309Y,310T,311L,311T,311V,311W,313Y,315G,315Q,315S,315T,339P,340P,341S,374H,374S,376L,378H,378N,380T,380Y,382H,383Q,384E,384G,384H,385A,385C,385F,3851,385L,385M,385N,385P,385Q,385S,385T,385V,385W,385Y,386E,386H,386K,387#,387A,387H,387K,387Q,389H,426L,426N,426V,426Y,4271，429D，429F，429K,429N,429Q,429S,429T,429Y,430L,431G,4311,431P,431S,432F,432H,432V,433E,433N, 433P, 433S, 434H, 434Q, 434S, 435N, 436F, 436L, 436V, 436W, 437E,和 437V 組成的群組的修飾。4.依照項I的Fe變體，其中所述Fe變體包含至少一個選自由257C，257M，257L，257N, 257Y，279Q，279Y，308F 和 308Y 組成的群組的替換。5.依照項I的Fe變體，其中所述Fe變體包含G385H或N434Y。依照項3或4的Fe變體，其中所述Fe變體在所述親代多肽的Fe區包含至少兩個修飾。6.依照項3或4的Fe變體,其中所述Fe變體更進一步地包含至少一個選自由248D,248E,248K,249H,249K,249R,250A,250C,250D,250E,250F,250G,250H,2501，250K,250L,250M,250N,250P,250Q,250R,250S,250V,250W,250Y,251C,251G,251L,251Q,251S,252A,252C,252G,252N,252Q,252S,252T,252V,252W,252Y,253A,254A,254S,255C,255G, 255N,255Q,255R,255S,255T,255Y,256A,256D,256F,256K,256Q, 256R,256S, 256T, 258C,258D,258E,258G,258H,258K,258N,258Q,258S,258T,258Y,277A,277C,277D,277E,277F,277G, 277H,2771，277K，277L,277M,277N,277P,277Q,277R, 277S, 277T,277V,277W,277Y,279E,279R,280K,280R,281D,281E,281H,281K,281Q,281R,282E,282K,282R,284C,284D,284E,284G,284N,284T,285A,285C,285D,285G,285H,285N,285Q,285R,285T,285Y, 286E,286M,286T,287C,287D,287E,287G,287H,287K,287N,287Q,288D,288E,288H,288K,288R,287R,287S,287T,288A,288C,288D,288E,288F,288G,288H,288K,288L,288M,288N,288P,288T, 288V, 288W, 288Y, 304C, 305A, 305C, 305D, 305E, 305G, 305K, 305N, 305Q, 305R, 305S,305Y,306A,306C,306D,306E,306G,306K,306L,306M,306N,306P, 306Q 306R,306R,306S,306T,306V,306W,306Y,309D,309E,309K,309R,310A,310C,310D,310E,310G,310H,311A,311K，311R，312A，312C，312D，312G，312K，312N，312Q，312R，312S，312T，312Y，313D，313E，313H，313K，313R，314A，314C，314D，314E，314F，314G，314H，314I，314L，314M，314N，314P，314Q，314R，314S，314T，314V，314W，314Y，315D，315K，315R，316H，316K，316R，317A，317C，317D，317E，317G，317K，317N，317Q，317R，317T，317Y，340D,340E,340H,340K,340R,343C,343D,343E,343G,343H,343K,343N,343Q,343R,343S,343T,343Y,344L,345C,345D,345E,345G,345H,345K,345N,345Q,345R,345S,345T,345Y,360A,362A,376C, 376D, 376E, 376G,376K,376N,376Q,376R,376S,376T,376Y,378S,380A,382A,383D,383E,383R,386P, 386T,387P,387R,389D,389N,389P,389S,415A,424A,424D,424E,424H,424K,424R,426D,426K,428A, 428C, 428D, 428E,428F,428G,428H,4281，428K，428L, 428M, 428N,428P,428Q,428R,428S,428T,428V,428W,428Y,430C,430E,430G,430N,430R,430S,430T，431D，431E, 431K,431R, 432C, 432G, 432Q, 432T，432Y，433A,433K,434A,434F,434K,434L,434R,435A,436A,436D, 436R, 436T, 436Y, 438D, 438E 和 438R 組成的群組的替換。7.親代多肽的Fe變體，其在所述親代多肽的Fe區包含至少一個修飾，與所述親代多肽相比，所述變體蛋白對FcRn的結合顯示出改變，且所述至少一個修飾包括插入或缺失。8.依照項7的Fe變體，其中所述修飾顯示對FcRn的結合增高。9.依照項7的Fe變體，其中所述修飾是插入。
10.依照項9的Fe變體，其中所述插入位于環中。11.依照項9的Fe變體，其中所述插入位于位點254或281之后。12.依照項11的Fe變體，其中所述插入是~281S。13.依照項7的Fe變體，其中所述修飾是缺失，附帶條件是在同種型IgGl的位點G236沒有缺失。14.依照項13的Fe變體，其中至少一個所述的缺失發生在環內。15.依照項14的Fe變體，其中至少一個所述的缺失是位點286或387的缺失。16.親代多肽的Fe變體，其在所述親代多肽的Fe區包含至少一個修飾，與所述親代多肽相比，所述變體蛋白對FcRn和Fe Y R的結合顯示出改變。 17.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體在所述親代Fe多肽的Fe區包含至少兩個氨基酸修飾。18.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體在所述親代Fe多肽的Fe區包含至少
三個氨基酸修飾。19.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體在所述親代Fe多肽的Fe區包含至少四個氨基酸修飾。20.依照項16的Fe變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合
顯示出增高。21.依照項16的Fe變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出降低。22.依照項16的Fe變體，其中與所述親代多肽相比，所述Fe變體對Fe Y R的結合
顯示出增高。23.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體對Fe Y R和FcRn的結合顯示出增高。24.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體對Fe Y R和FcRn的結合顯示出降低。25.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體對Fe Y R的結合顯示出降低，對FcRn的結合顯示出增高。26.依照項16的Fe變體，其中所述Fe變體對Fe Y R的結合顯示出增高，對FcRn的結合顯示出降低。27.親代多肽的Fe變體，其在所述親代多肽的Fe區包含至少一個氨基酸修飾，與所述親代多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出改變，且所述Fe變體包含在特異于靶分子的多肽中，所述靶分子是從細胞因子、可溶性蛋白因子和癌細胞上表達的蛋白組成的群組中選出的。本發明還涉及I.包含親代Fe多肽的Fe變體的多肽，其在相當于所述親代多肽的Fe區含有至少一個修飾，與親代Fe多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出改變，且所述Fe變體包含至少一個選自由 246S, 257L, 257N, 257Q, 257Y, 279A, 279F, 279G, 279H, 2791，279K，279M,279N,279P,279Q,279S,279T,279W,279Y,284H,284K,284P,284Q,284R,284S,308C,308E,308F,308G,308H,308L,308M,308N,308P,308Q,308S,308T,308W,308Y,385C,385F,385H,3851，385L，385M, 385N, 385P, 385Q, 385V, 385W, 385Y, 387K 和 387Q 組成的群組的修飾，其中參照EU指數進行編號。
2.依照項I的多肽，其中所述Fe變體包含至少一個選自由257L，257N，257Y，279Q，279Y，308F和308Y組成的群組的替換。3.依照項I或2的多肽，其中所述Fe變體包含G385H。4.依照項1-3任何一項的多肽，其中所述Fe變體在所述親代多肽的Fe區包含至少兩個修飾。5.依照項1-4任何一項的多肽,其中所述Fe變體更進一步地包含至少一個選自由 248D,248E,248K,249H,249K,249R,250A,250C,250D,250E,250F,250G,250H,2501，250K，250L,250M,250N,250P,250Q,250R,250S,250V,250W,250Y,251C,251G,251L,251Q,251S,252A,252C,252G,252N,252Q,252S,252T,252V,252W,252Y,253A,254A,254S,255C,255G,255N,255Q,255R,255S,255T,255Y,256A,256D,256F,256K,256Q,256R,256S,256T,258C, 258D,258E,258G,258H,258K,258N,258Q,258S,258T,258Y,277A,277C,277D,277E,277F,277G,277H,2771,277K,277L,277M,277N,277P,277Q,277R,277S,277T,277V,277W,277Y,279E,279R,280K,280R,281D,281E,281H,281K,281Q,281R,282E,282K,282R,284C,284D,284E, 284G,284N,284T,285A,285C,285D,285G,285H,285N,285Q,285R, 285T, 285Y, 286E,286M,286T,287C,287D,287E,287G,287H,287K,287N,287Q,288D,288E,288H,288K,288R,287R,287S,287T,288A,288C,288D,288E,288F,288G,288H,288K,288L,288M,288N,288P,288T,288V,288W,288Y,304C,305A,305C,305D,305E,305G,305K,305N, 305Q, 305R, 305S,305Y,306A,306C,306D,306E,306G,306K,306L,306M,306N,306P, 306Q 306R,306R,306S,306T,306V,306W,306Y,309D,309E,309K,309R,310A,310C,310D,310E,310G,310H,311A,311K，311R，312A，312C，312D，312G，312K，312N，312Q，312R，312S，312T，312Y，313D，313E，313H，313K，313R，314A，314C，314D，314E，314F，314G，314H，314I，314L，314M，314N，314P，314Q，314R，314S，314T，314V，314W，314Y，315D，315K，315R，316H，316K，316R，317A，317C，317D,317E，317G，317K，317N，317Q，317R，317T，317Y,340D,340E,340H,340K,340R,343C,343D,343E,343G,343H,343K,343N,343Q,343R,343S,343T,343Y,344L,345C,345D,345E,345G,345H,345K,345N,345Q,345R,345S, 345T, 345Y, 360A, 362A,376C,376D,376E,376G,376K,376N,376Q,376R,376S,376T,376Y,378S,380A,382A,383D,383E,383R,386P,386T,387P,387R,389D,389N,389P,389S,415A,424A,424D,424E,424H,424K,424R,426D,426K,428A, 428C,428D,428E,428F,428G,428H,4281，428K，428L,428M,428N,428P,428Q,428R,428S,428T，428V，428W,428Y,430C,430E,430G,430N,430R,430S,430T,431D,431E,431K,431R,432C,432G,432Q,432T,432Y,433A,433K,434A,434F,434K,434L,434R,435A,436A,436D, 436R, 436T, 436Y, 438D, 438E 和 438R 組成的群組的替換。6.依照項1-5任何一項的多肽，其中與所述親代Fe多肽相比，所述Fe變體對FcRn和Fe Y R的結合顯示出改變。7.依照項1-6任何一項的多肽，其中所述Fe變體在相當于親代Fe多肽的Fe區包含至少兩個氨基酸修飾。8.依照項1-6任何一項的多肽，其中所述Fe變體在相當于親代Fe多肽的Fe區包含至少三個氨基酸修飾。9.依照項1-6任何一項的多肽，其中所述Fe變體在相當于親代Fe多肽的Fe區包含至少四個氨基酸修飾。
10.依照項1-9任何一項的多肽，其中與所述親代Fe多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出增高。11.依照項1-9任何一項的多肽，其中與所述親代Fe多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出降低。12.依照項1-9任何一項的多肽，其中與所述親代Fe多肽相比，所述Fe變體對Fe y R的結合顯不出增聞。13.依照項1-9任何一項的多肽，其中所述Fe變體對Fe Y R和FcRn的結合顯示出增高。14.依照項1-9任何一項的多肽，其中所述Fe變體對Fe Y R和FcRn的結合顯示出降低。 15.依照項1-9任何一項的多肽，其中所述Fe變體對Fe YR的結合顯示出降低，對FcRn的結合顯示出增高。16.依照項1-9任何一項的多肽，其中所述Fe變體對Fe YR的結合顯示出增高，對FcRn的結合顯示出降低。17.依照項1-9任何一項的多肽，其中與所述親代Fe多肽相比，所述Fe變體對FcRn的結合顯示出改變，而且其中所述Fe變體包含在特異于靶分子的多肽中，所述靶分子是從細胞因子、可溶性蛋白因子和癌細胞上表達的蛋白組成的群組中選出的。18.包含依照項1-17任何一項的Fe變體的抗體。19.包含依照項1-17任何一項的Fe變體的Fe融合物。附圖簡述圖I.抗體結構和功能。顯示全長人IgGl抗體的模型，利用來自pdb登記入冊代碼ICEl (James et al.，1999，J Mol Biol 289:293-301，全部引入作為參考)的人源化 Fab 結構和來自 pdb 登記入冊代碼 1DN2 (DeLano et al.，2000，Science 287:1279-1283，全部引入作為參考)的人IgGl Fe結構構建模型。沒有顯示連接Fab和Fe區的可彎曲鉸鏈。IgGl是同型二聚體，具有多個由兩條輕鏈和兩條重鏈組成的異二聚體。包含抗體的Ig域已經被標記,包括輕鏈的 VL和 CL，以及重鏈的 VH Cgammal (C y I)、Cgamma2 (C y 2)和 Cgamma3 (C Y 3)。標記了 Fe區。標記了相關蛋白的結合部位，包括可變區的抗原結合部位，以及Fe區中結合Fe YR, FcRn, Clq,以及蛋白A和G的結合部位。圖2.按照Kabat等進行EU編號的用于本發明的人IgG序列。圖3.按照Kabat等進行EU編號的用于本發明的人和嚙齒類動物的IgG序列實例。圖4.用于本發明的人和嚙齒類動物FcRn重鏈序列的實例。圖5.用于本發明的人和嚙齒類動物P -2-微球蛋白序列的實例。圖 6.從大鼠結構(Burmeister et al. , 1994, Nature, 372:379-383 ；Martin etal.,2001, Mo I Cell 7:867-877，都全部引入作為參考)產生的人Fc/FcRn復合模型。一些組氨酸殘基顯示在FcRn鏈(淡灰)和Fe多肽(深灰)上填充空間的原子中。圖7.用于設計包含插入或缺失的變體的一些概念的說明。圖8a-圖8b 本發明的變體。圖9a-圖9b.本發明的變體。圖IOa-圖IOb.本發明的變體。


圖11.用于構建Fe變體的載體pcDNA3. IZeo+的圖。圖12a-圖12b.野生型Fe和本發明的Fe變體競爭結合FcRn的數據。在每個畫面中，本發明的Fe變體都用左邊的曲線顯示(紅或深灰)，野生型曲妥單抗(trastuzumab)都用右邊的曲線顯示(藍或淡灰)。圖13a-圖13 j . Fe變體結合FcRn特性的概要。從右到左的欄分別顯示FcRn結合的修飾、使用的免疫球蛋白、其他修飾、通過AlphaScreen 競爭試驗測定的與野生型相比的相對FcRn親和力(中值)、實施測定的數目和蛋白的的參考號。相對FcRn親和力編號大于I. 0表明結合相對于野生型增加了。圖14a-圖14d.本發明的Fe變體結合FcRn的數據。Fe變體位于阿侖單抗(alemtuzumab)或曲妥單抗中。與野生型相比，顯示出成倍增加的結合力。圖15.對FcRn的結合有改進的Fe變體的表面質子共振實驗的概要。條形圖顯示相對于野生型Fe域,每個變體的FcRn結合親和力成倍增加。圖16a-圖16b.野生型抗體和本發明的變體的表面質子共振實驗。蹤跡顯示在pH6. 0時，Fe變體抗體與FcRn的結合和解離。圖17a-圖17c.本發明Fe變體對FcRn的結合的測定。顯示的是在pH 6. 0 (a和b)和pH 7.0(c)時，AlphaScreen 測量的直接結合測定。圖18.本發明Fe變體對FcRn的結合的測定。顯示的是變體Fe結合到表面結合的FcRn上時產生的表面質子共振單位。發明詳述本發明公開了對FcRn受體的結合增強的Fe域新變體的產生，Fe域包括在抗體、Fe融合物和免疫粘附物中發現的那些Fe域。如上所述，結合RcRn導致體內較久的血清滯
&3甶o為了增加Fe蛋白的體內滯留，結合親和力的增加必須是pH 6左右時的增加，同時不伴隨PH 7. 4左右時親和力的增加。雖然仍在研究中，但仍認為Fe區具有較久的體內半衰期是因為pH 6時在內體中與FcRn的結合隔離了 Fe (Ghetie and Ward, 1997ImmunolToday. 18(12) :592-598，全部引入作為參考)。內體室然后將Fe再循環到細胞表面。一旦該室向細胞間隙開放，更高的pH("7. 4)將導致Fe釋放回血液中。Dali’Acqua等顯示在pH6和pH 7. 4時具有增加的FcRn結合力的Fe突變體實際上具有降低的血清濃度和與野生型相同的半衰期(Dali，Acqua et al. 2002，J. Immunol. 169:5171-5180，全部引入作為參考)。認為pH 7. 4時Fe對FcRn的親和力的增加阻止了 Fe釋放回血液中。因此，增加Fe體內半衰期的Fe突變理論上將增加較低pH時的FcRn結合，但仍然允許在更高的pH釋放Fe。在pH 6. 0-7. 4的范圍內，氨基酸組氨酸可以改變它的電荷狀態。因此，在Fc/FcRn復合物的重要位點發現His殘基并不會令人覺得驚訝(圖6)。本發明另一方面是,使FcRn結合相對于野生型增加(具體在較低pH,大約pH 6.0時)，以促進內體中的Fc/FcRn結合。本發明也公開了對FcRn的結合有變且對另一類Fe受體Fe Y R的結合有變的Fe變體，對Fe Y R的差異結合，特別是對Fe y RIIIb的結合增加和對Fe y RIIb的結合降低，導致功效增強。為了更完全地理解本申請，下文闡述了幾個定義。這種定義有意包括語法上的同等物。這里使用的"ADCC"或〃抗體依賴細胞介導的細胞毒作用〃指一種細胞介導反應，在該反應中，表達Fe Y R的非特異性細胞毒活性細胞識別靶細胞上結合的抗體并隨后引起該靶細胞裂解。這里使用的"ADCP"或〃抗體依賴細胞介導的吞噬作用〃指一種細胞介導的反應，在該反應中，表達Fe Y R的非特異性細胞毒活性細胞識別靶細胞上結合的抗體并隨后引起該靶細胞的吞噬。這里的〃氨基酸修飾〃指多肽序列中的氨基酸替換、插入和/或缺失。這里的〃氨基酸替換〃或〃替換〃指用另一個氨基酸替換親代多肽序列特殊位點的一個氨基酸。例如替換物E272Y指變體多肽，在這種情況下指位點272的谷氨酸被酪氨酸替換的Fe變體。這里的〃氨基酸插入〃或〃插入〃指在親代多肽序列的特殊位點添加一個氨基酸。例如-233E或~233E指在位點233之后和位點234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或~233ADE指在位點233之后和位點234之前插入AlaAspGlu。這里的〃氨基酸缺失〃或"缺失"指在親代多肽序列的特殊位點除去一個氨基酸。例如E233-或E233#指位點233的谷氨酸缺失。另外，EDA233-或EDA233指從位點233開始的序列GluAspAla的缺失。這里使用的〃變體蛋白〃或〃蛋白變體〃或〃變體〃指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親代蛋白的蛋白。蛋白變體可以參考蛋白本身，包含該蛋白組合物或編碼它的氨基序列。與親代蛋白相比，蛋白變體優選具有最少一個氨基酸修飾，例如大約一個到大約十個氨基酸修飾，優選與親代相比大約一個到大約五個的氨基酸修飾。這里的蛋白變體序列優選具有與親代蛋白序列至少大約80%的同源性，最優選至少大約90%的同源性，更優選至少大約95%的同源性。蛋白變體可以參考變體蛋白本身，包含該蛋白變體的組合物或編碼它的氨基酸序列。因此，這里使用的〃抗體變體〃或〃變體抗體〃或〃變體〃指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親代抗體的抗體。這里使用的"IgG變體〃或〃變體IgG"指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親代IgG的抗體，這里使用的〃免疫球蛋白變體〃 或"變體免疫球蛋白"或"變體"指由于至少一個氨基酸修飾而不同于親代免疫球蛋白序列的免疫球蛋白序列。變體可以包含非天然氨基酸。實例包括US6586207 ;W0 98/48032 ；WO 03/073238 ；US2004-0214988A1 ；W0 05/35727A2 ；W0 05/74524A2 ；J.ff.Chin etal., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J. ff. Chin, &P.G. Schultz, (2002)，ChemBioChem 11:1135-1137 ；J. ff. Chin, et al., (2002), PICAS UnitedStates of America 99:11020-11024 ;and, L. Wang, &P. G. Schultz, (2002)，Chem. 1-10,都全部引入作為參考這里使用的〃蛋白〃指至少兩個共價連接的氨基酸，包括蛋白、多肽、寡肽和肽。肽基可以包含天然發生的氨基酸和肽鍵，或合成的肽模擬結構，即"類似物"，例如類肽(參見Simon et al. , PNAS USA 89 (20) : 9367 (1992)，全部引入作為參考)。正如本領域所理解的那樣，氨基酸可以是天然發生或非天然發生的氨基酸。例如同型苯丙氨酸、瓜氨酸和noreleucie被認為是可用于本發明目的的氨基酸，而且D和L(R或S)構型的氨基酸都可以被使用。本發明的變體可以包含包括利用，例如Schultz和其同事的技術，包括但不限于 Cropp&Shultz, 2004，Trends Genet. 20(12) :625-30, Anderson et al. , 2004, ProcNatl Acad Sci USA 101 (2):7566-71，Zhang et al.，2003，303(5656):371-3 和 Chin etal.，2003, Science 301(5635) :964-7描述的方法整合的非天然氨基酸的修飾。另外，多肽可以包括一個或多個側鏈或末端的合成衍生作用、糖基化、PEG化、環狀排列、環化、與其他分子連接、融合到蛋白或蛋白域和添加肽標簽或標記。這里使用的〃殘基〃指蛋白中的位置，以及它伴隨的氨基酸同一性。例如天冬酰胺297 (也稱為Asn297，也稱為N297)是人抗體IgGl中的殘基。這里使用的〃Fab 〃或〃 Fab區〃指包含VH、CH1、VL和CL免疫球蛋白區的多肽。Fab可以指分離狀態的這些區，或處于全長抗體或抗體片段前后關系中的這些區。這里使用的"IgG亞類修飾〃指將一種IgG同種型中的一個氨基酸轉換成配對的不同IgG同種型中的對應氨基酸的氨基酸修飾。例如因為IgGl在EU位點296包含酪氨酸，而IgG2包含苯丙氨酸，因此IgG2中的F296Y替換被認為是IgG亞類修飾。 這里使用的〃非天然發生的修飾〃指不是同型的氨基酸修飾。例如因為沒有IgGs在位點332包含谷氨酸，因此在IgGl、IgG2、IgG3或IgG4中的I332E替換被認為是非天然發生的修飾。這里使用的〃氨基酸〃和〃氨基酸特性〃指20個天然氨基酸或出現在具體指定位點的任何非天然類似物中的一個。這里使用的〃效應器功能〃指由抗體Fe區與Fe受體或配體的相互作用引起的生物化學事件。效應器功能包括，但不局限于ADCC、ADCP和⑶C。這里使用的〃效應細胞〃指表達一種或多種Fe受體并介導一種或多種效應器功能的免疫系統細胞。效應細胞包括，但不局限于單核細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、血小板、B細胞、大顆粒淋巴細胞、郎格罕氏細胞、自然殺傷(NK)細胞和Y ST細胞，而且他們可以來源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物體。這里使用的"IgG Fe配體〃指結合IgG抗體的Fe區以形成Fc/Fc配體復合物的來自任何生物體的分子，優選多肽。Fe配體包括，但不局限于Fe Y Rs、FcyRs, FcyRs,FcRn, Clq、C3、甘露聚糖結合凝集素、甘露糖受體、葡萄球菌蛋白A、鏈球菌蛋白G和病毒Fe y R0 Fe配體也包括是Fe受體家族的與Fe y Rs同源的Fe受體同系物(FcRH) (Davis etal. , 2002, Immunological Reviews 190:123-136，全部引入作為參考)。Fe 配體可以包括未發現的結合Fe的分子。具體IgG Fe配體有FcRn和Fe y受體。這里使用的"Fe配體〃指結合抗體Fe區以形成Fc/Fc配體復合物的來自任何生物體的分子，優選多肽。這里使用的"Fe Y受體〃或"Fe y R"指結合IgG抗體Fe區的由Fe Y R基因編碼的蛋白家族的任何成員。在人類中，這些蛋白家族包括但不局限于包括亞型Fe Y RIa、Fe y RIb 和 Fe y RIc 的 Fe yRI(CD64);包括亞型 Fe Y RIIa(包括同種異型 H131 和 R131)、Fe Y RIIb (包括 Fe Y RIIb-I 和 Fe Y RIIb-2)和 Fe Y RIIc 的 Fe Y RII (CD32);和包括亞型Fe yRIIIa(包括同種異型V158和F158)和Fe Y RIIIb (包括同種異型Fe y RIIIb-NAl和Fe yRIIIb-NA2)的 Fe YRIII (CD16)(Jefferis et al. , 2002, Immunol Lett 82:57-65，全部引入作為參考)，以及未發現的人Fe Y Rs或Fe Y R亞型或同種異型。Fe Y R可以來源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物體。小白鼠Fe Y Rs包括但不局限于Fe y RI (CD64)、Fe Y RII (CD32) ,Fe y RIII (CD16)和 Fe y RII1-2 (CD16-2)，以及任何未發現的小白鼠Fe YRs或Fe Y R亞型或同種異型。這里使用的"FcRn"或〃新生Fe受體〃指結合IgG抗體Fe區的至少部分由FcRn基因編碼的蛋白。FcRn可以來源于包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子和猴的任何生物體。功能性FcRn蛋白包含經常被稱為重鏈和輕鏈的兩條多肽，輕鏈是￠-2-微球蛋白，重鏈由FcRn基因編碼。除非這里記錄了其他方式，否則FcRn或FcRn蛋白指FcRn重鏈與3-2-微球蛋白的復合物。具有特殊意義的FcRn序列，特別是人類的序列顯示在附圖中。這里使用的〃親代多肽〃指隨后被修飾以產生變體的未經修飾的多肽。親代多肽可以是天然發生多肽，或天然發生多肽的變體或經過加工的形式。親代多肽可以參考多肽本身，包含該親代多肽的組合物或編碼它的氨基酸序列。因此，這里使用的"親代免疫球蛋白"指被修飾以產生變體的未經修飾的免疫球蛋白多肽，這里使用的"親代抗體"指被修飾以產生變體抗體的未經修飾的抗體。應注意〃親代抗體〃包括下文列出的已知的市場上可買到的重組生產的抗體。
這里使用的〃位點〃指蛋白序列中的位置。可以對位點進行連續編號，或者可以依照已確定的形式，例如Kabat等的EU指數進行編號。例如位點297是人抗體IgGl中的位點。這里使用的〃靶抗原〃指被給定抗體的可變區特異結合的分子。靶抗原可以是蛋白、糖、脂質或其他化合物。這里使用的〃靶細胞〃指表達靶抗原的細胞。這里使用的〃可變區〃指包含一個或多個基本上由Vk、VX和/或VH基因中的任何一種編碼的Ig域的免疫球蛋白區域，其中Vk ,VA和/或VH基因分別組成K、X和免疫球蛋白重鏈基因位點。這里的〃野生型或WT〃指在自然界中發現的包括等位基因變異的氨基酸序列或核苷酸序列。WT蛋白具有沒有被故意修飾的氨基酸序列或核苷酸序列。本發明涉及對FcRn的結合被調節的抗體(調節包括增加以及降低結合)。例如在有些情況下，增加的結合會導致細胞再循環抗體，并由此延長，例如治療抗體的半衰期。有時，降低FcRn結合是合乎需要的，例如用作包含放射標記的診斷抗體或治療抗體。另外，對FcRn的結合顯示出增加，同時對其他Fe受體，例如Fe y Rs的結合被改變的抗體可以用于本發明。因此，本發明提供抗體。抗體本申請涉及包含調節對FcRn的結合力的氨基酸修飾的抗體。具有特殊意義的是在較低的pH時,對FcRn的結合親和力顯示出增加,而在更高的pH時,結合基本上不顯示出改變的最低限度地包含Fe區的抗體或其功能性變體。傳統的抗體結構單位通常包含四聚體。每個四聚體通常由兩個相同的多肽鏈對組成，每對具有一條〃輕〃鏈(通常具有大約25kDa的分子量)和一條〃重〃鏈(通常具有大約50_70kDa的分子量)。人輕鏈被分為K和入輕鏈。重鏈被分為ii、A、Y、a或e，限定的抗體同種型分別為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有幾個亞類，包括但不限于IgGl、IgG2、IgG3和IgG4。IgM也具有亞類，包括但不限于IgMl和IgM2。因此，這里使用的"同種型"指由免疫球蛋白的恒定區的化學和抗原特性限定的任何免疫球蛋白亞類。已知的人免疫球蛋白同種型有 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgMl、IgM2、IgD 和 IgE。每條鏈的氨基末端部分包含主要負責抗原識別的有大約100到110或更多氨基酸的可變區。在可變區中，重鏈V域中的三個環和輕鏈V域中的三個環聚集在一起形成抗原結合簇。每個環被稱為互補決定區(以下簡稱為"CDR")，互補決定區中氨基酸序列變化最顯著。每條鏈的羧基末端部分限定了主要負責效應器功能的恒定區。Kabat等收集了重鏈和輕鏈可變區的許多一級序列。他們基于序列保守程度，將各個一級序列分為CDR和框架，并制作了他們的列表(參見 SEQUENCES OF IMMUNOLOGICAL INTERES T, 5th edition, NIHpublication, No. 91-3242, E. A. Kabat et al.,全部引入作為參考)。 免疫球蛋白IgG亞類的重鏈中有幾個免疫球蛋白功能區。這里的〃免疫球蛋白(Ig)域〃指具有獨特三級結構的免疫球蛋白區域。在本發明中有意義的有重鏈域，包含重鏈恒定(CH)域和鉸鏈域。在IgG抗體背景中，每個IgG同種型具有三個CH區。因此，IgG背景中的〃CH〃域顯示如下〃CH1"指依照Kabat的EU指數進行編號的位點118-220。〃CH2〃指依照Kabat的EU指數進行編號的位點237-340，〃CH3〃指依照Kabat的EU指數進行編號的位點341-447。另一種重鏈Ig域是絞鏈區。這里的〃鉸鏈〃或〃絞鏈區〃或〃抗體絞鏈區〃或〃免疫球蛋白絞鏈區"指在抗體的第一和第二恒定域之間包含氨基酸的可彎曲的多肽。在結構上，IgG CHl域終止于EU位點220，IgG CH2域起始于EU位點237的殘基。因此，對IgG來說，這里限定的抗體鉸鏈包含位點221 (IgGl中的D221) IlJ 236 (IgGl中的G236)，其中依照Kabat等的EU指數進行編號。在一些實施例中，例如在Fe區背景中，可以包含較少的鉸鏈，〃較少的鉸鏈〃泛指位點226或230。在本發明中有特殊意義的是Fe區。這里使用的"Fe"或"Fe區〃指包含排除第一恒定區免疫球蛋白功能區，有時還排除部分鉸鏈的抗體恒定區的多肽。因此，Fe指IgA、IgD和IgG的最后兩個恒定區免疫球蛋白功能域，IgE和IgM的最后三個恒定區免疫球蛋白功能域，和這些域N-末端的可彎曲的鉸鏈。對IgA和IgM來說，Fe可以包含J鏈。對IgG來說，Fe包含免疫球蛋白功能域C Y 2和Cy 3(C Y 2和C Y 3)，以及C Y I (Cy I) C y 2(C y 2)之間較低的絞鏈區，這一點如圖I所示。雖然，Fe區的分界線可以變化，但通常限定人IgG重鏈Fe區包含殘基C226或P230到羧基末端，其中依照Kabat的EU指數進行編號。如下所述，Fe可以指分離狀態的這些區，或處于Fe多肽前后關系中的這些區。這里使用的〃Fe多肽〃指包含全部或部分Fe區的多肽。Fe多肽包括抗體、Fe融合物、分離的Fcs和Fe片段。在一些實施例中，抗體是全長的。這里的〃全長抗體〃指組成抗體天然生物類型的包括可變區和恒定區的包括這里列出的一種或多個修飾的結構。或者，抗體可以具有多種結構，包括但不限于抗體片段、單克隆抗體、雙特異抗體、微型抗體(minibodies)、域抗體、合成抗體(這里有時稱為〃抗體模擬物")、嵌合抗體、人源化抗體、抗體融合物(有時稱為"抗體偶聯物")，以及每一種的片段。抗體片段在一個實施例中，抗體是抗體片段。尤其感興趣的是包含重鏈Fe區、Fe融合物和恒定區(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的抗體，還可包括重鏈恒定區融合物。
特異性抗體片段包括，但不局限于(i)由VL、VH、CL和CHl域組成的Fab片段、
(ii)由VH和CHl域組成Fd片段、(iii)由單個抗體的VL和VH域組成Fv片段；(iv)由單個可變區組成的dAb片段(Ward et al.，1989，Nature341:544-546，全部引入作為參考)、(v)分離的CDR區、(vi)包含兩個連接的Fab片段的二價片段F(ab’)2片段(vii)單鏈Fv分子(scfv),其中通過允許兩個域聯合形成抗原結合部位的肽接頭連接VH域和VL域(Bird et al. , 1988, Science 242:423-426，Huston et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 85:5879-5883,全部引入作為參考)(viii)雙特異單鏈Fv(W0 03/11161，引入作為參考)和(ix)通過基因融合構建的〃雙體〃或〃三體〃，多價或多特異性片段(Tomlinsonet. al. , 2000, Methods Enzymol. 326:461-479 ；W094/13804 ；Holliger et al. , 1993, Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90:6444-6448,都全部引入作為參考)。可以修飾抗體片段。例如可以通過整合連接VH和VL域的二硫鍵穩定該分子(Reiter et al. , 1996, NatureBiotech. 14:1239-1245，全部引入作為參考)。嵌合抗體和人源化抗體 在一些實施例中，支架成分可以是來自不同物種的混合物。這時，如果所述抗體是一種抗體，那么這種抗體可以是嵌合抗體和/或人源化抗體。一般而言，"嵌合抗體"和"人源化抗體"都指組合來自多個物種的功能區的抗體。例如傳統的"嵌合抗體"包含來自小白鼠(或者有時是大鼠)的可變區和來自人的恒定區。"人源化抗體"泛指可變區的框架區被換成人抗體中發現的序列的非人抗體。通常，在人源化抗體中，除CDRs之外的全部抗體是由人來源的多核苷酸編碼的，或者除CDRs之外等同于這種人來源的抗體。由起源于非人生物體的核酸編碼的一些或所有CDRs被移植到人抗體可變區的￠-片層骨架中以產生抗體，其中特異性由移入的⑶Rs決定。都全部引入作為參考的 WO 92/11018, Jones, 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al. , 1988, Science239:1534-1536中描述了制備這種抗體的過程。經常需要將選擇的受體骨架殘基〃回復突變〃為對應的供體殘基以恢復初期被移植的構建物中喪失的親和力(US 5530101 ；US5585089 ；US 5693761 ；US 5693762 ；US6180370 ；US 5859205 ；US 5821337 ；US 6054297 ；US 6407213，都全部引入作為參考)。最佳的人源化抗體還將包含免疫球蛋白恒定區的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的至少一部分，因此將通常包含人Fe區。還可以利用免疫系統被遺傳操縱的小白鼠產生人源化抗體。Roque et al. , 2004, Biotechnol.Prog. 20:639-654,全部引入作為參考。人源化和改造非人抗體的多種技術和方法在本領域為大家所熟知(參見 See Tsurushita&Vasquez, 2004, Humanization of MonoclonalAntibodies, Molecular Biology of B Cells, 533-545, Elsevier Science (USA)和其中引用的參考文獻，都全部引入作為參考)。人源化方法包括但不限于都全部引入作為參考的Jones et al. , 1986, Nature321:522-525 ；Riechmann et al. , 1988 ；Nature 332:323-329 ；Verhoeyen et al.,1988,Science,239:1534-1536 ；Queen et al. , 1989,Proc NatlAcad Sci,USA86:10029-33 ；He et al. , 1998, J. Immunol. 160:1029-1035 ；Carteret al. , 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:4285-9, Presta et al. , 1997, CancerRes. 57(20) : 4593-9 ；Gorman et al. , 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA88:4181-4185 ；O’Connor et al. , 1998, Protein Eng 11:321-8中描述的方法。降低非人類抗體可變區的免疫原性的人源化或其他方法包括表面重建方法，例如，引入作為參考的Roguska etal.，1994，Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:969-973 中描述了該方法。在一個實施例中，親代抗體已經被親合成熟，這一點本領域已經已知。基于結構的方法可以用于人源化和親合成熟，例如USSN 11/004，590中對此進行了描述。基于選擇的方法可以用于人源化和/或親合成熟抗體可變區，包括但不限于都全部引入作為參考的心et al.，1999，J. Mol.Biol. 294:151-162 ；Baca et al.，1997，J. Biol. Chem. 272 (16) : 10678-10684 ；Rosok etal.，1996，J. Biol. Chem. 271 (37) : 22611-22618 ；Rader et al.，1998，Proc. Natl. Acad.Sci. USA 95:8910-8915 ；Krauss et al.，2003，Protein Engineeringl6(10) : 753-759 中描述的方法。其他人源化方法涉及僅嫁接部分CDRs，包括但不限于都全部引入作為參考USSN09/810，510 ;Tan et al.，2002，J. Immunol. 169:1119—1125 ；De Pascalis et al.，2002，J.Immunol. 169:3076-3084 中描述的方法。雙特異性抗體在一個實施例中，本發明的抗體是多特異性抗體，特別是雙特異性抗體，有時也稱 為"雙體"。這些抗體結合兩種(或更多種)不同的抗原。可以利用本領域已知的多種方式制造雙體(Holliger and Winter, 1993, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449,完全引入作為參考)，例如，可以用化學方法制備或從雜種雜交瘤制備。微型抗.體(Minibodies)在一個實施例中，抗體是微型抗體(minibody)。微型抗體(minibody)是包含與CH3 域相連的 scFv 的最小化抗體樣蛋白。Hu et al. , 1996, Cancer Res. 56:3055-3061,全部引入作為參考。在有些情況下，scFv可以與Fe區連接，還可以包括部分或全部絞鏈區。人抗體在一個實施例中，抗體是具有這里列出的至少一個修飾的完全的人抗體。〃完全的人抗體"指具有來源于人染色體的抗體的基因序列、并具有這里列出的修飾的人抗體。抗體融合物在一個實施例中，本發明的抗體是抗體融合蛋白(有時在這里稱為"抗體偶聯物〃)。抗體融合的一種類型包括將Fe區與偶聯配偶體連接的Fe融合物。這里使用的"Fe融合物"指其中一種或多種多肽操作性地與Fe區連接的蛋白。Fe融合物在這里與現有技術中使用的術語〃免疫粘合素"、"Ig融合物〃、"Ig嵌合體〃和〃受體球蛋白〃(有時帶破折號)同義(Chamow et al. , 1996, Trends Biotechnol 14:52-60 ;Ashkenazi et al. , 1997, CurrOpin Immunol 9:195-200，都全部引入作為參考)。Fe融合物將免疫球蛋白的Fe區與通常是任何蛋白或小分子的融合配偶體連接。事實上任何蛋白或小分子都可以連接到Fe上以產生Fe融合物。蛋白融合配偶體包括，但不局限于任何抗體的可變區、受體的靶標結合區、粘附分子、配體、酶、細胞因子、趨化因子或一些其它的蛋白或蛋白域。小分子融合配偶體可以包括指導Fe融合物到治療靶的任何治療劑。這種靶可以是任何分子，優選是參與疾病的胞外受體。因此，該IgG變體可以連接到一種或多種融合配偶體上。在一個可選擇的實施例中，IgG變體被連接或操作性地連接到另一種治療化合物上。治療化合物可以是細胞毒活性制劑、化療劑、毒素、放射性同位素、細胞因子，或其他治療活性劑。IgG可以與多種非蛋白聚合物中的一種，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯，或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物連接。除Fe融合物之外，抗體融合物包括重鏈恒定區與一種或多種融合配偶體的融合(此外又包括任何抗體的可變區)，而其他抗體融合是基本全長抗體或完全全長抗體與融合配偶體的融合。在一個實施例中，融合配偶體的作用是介導靶標結合，因此它在功能上類似于抗體可變區(而且實際上可以就是抗體可變區)。事實上任何蛋白或小分子都可以連接到Fe上產生Fe融合物(或抗體融合物)。蛋白融合配偶體包括，但不局限于受體的靶標結合區、粘附分子、配體、酶、細胞因子、趨化因子或一些其它的蛋白或蛋白域。小分子融合配偶體可以包括指導Fe融合物到治療靶位的任何治療劑。這種靶可以是任何分子，優選是與疾病有關的胞外受體。偶聯配偶體可以是蛋白性的或非蛋白性的；后者通常是利用抗體和偶聯配偶體上的功能基團產生的。例如，銜接物在本領域是已知的，例如同或異雙功能銜接物是眾所周知的(參見，1994 Pierce Chemical Company catalog, technical section oncross-linkers, pages 155-200,在這里引入作為參考)。適當的偶聯物包括，但不局限于如下所述的標記、藥物和細胞毒活性制劑，其中藥物和細胞毒活性制劑包括但不限于細胞毒類藥物(例如化療劑)，毒素或這種毒素的活性片段。適當的毒素和他們的對應片段包括白喉毒素A鏈、外毒素A鏈、篦麻毒素A鏈、相思 豆毒素A鏈、瀉果素、巴豆毒素、酚霉素、伊諾霉素等等。細胞毒活性制劑也包括通過將放射性同位素連接到抗體上或者讓放射性核素結合已經共價附著于抗體的螯合劑上制備的放射化學試劑。另外的實施例利用了刺孢霉素(calicheamicin)、auristatins、格爾德霉素(geldanamycin)、美登素(maytansine),以及duocarmycins和類似物；后者參見在此全部引入作為參考的美國2003/0050331A1。抗體的共價修飾抗體的共價修飾包括在本發明的范圍內，而且通常在翻譯后進行，但不總是如此。例如，通過讓抗體的特異氨基酸殘基與有機衍生劑反應可以將幾種類型的抗體共價修飾引入該分子中，其中有機衍生劑能與選擇的側鏈或N或C末端殘基反應。半胱氨酰殘基與a -鹵乙酸(和對應的胺)，例如氯乙酸或氯乙酰胺反應產生羧甲基或羧酰氨甲基衍生物是最常見的。也可以通過與溴三氟丙酮(bromotrifluoroacetone)、a-溴-￠-(5-咪唑基(imidozoyl))丙酸、氯乙酰基磷酸鹽、N-烷基馬來酰亞胺、3_硝基-2-吡啶二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、P-對氯汞苯甲酸、2-氯汞基-4-硝基苯酚或氯-7-硝基苯-2-氧雜-1，3- 二唑等等反應衍生化半胱氨酰殘基。通過在pH 5. 5-7. 0時與焦碳酸二乙酯反應可以衍化組氨酰殘基，因為這種情況下這種制劑可以相對特異地針對組氨酰側鏈。對-溴苯酰基溴化物也是有用的；優選在PH6.0時，在0. IM 二甲胂酸鈉中實施該反應。賴氨酰基(Lysinyl)和氨基末端殘基與琥珀酸酐或其他羧酸酐反應。這些制劑的衍生作用具有逆轉賴氨殘基電荷的效果。衍生包含a氨基的殘基的其他適當試劑包括亞氨酸酯，例如甲基皮考啉亞氨酸酯(methyl picolinimidate);磷酸卩比卩多醒；卩比卩多醒；硼氫化氯(chloroborohydride);三硝基苯磺酸；0_甲基異尿素；2，4_戍二酮和由轉氨酶催化的與乙醛酸的反應。通過與苯甲酰甲醒、2，3_ 丁二酮(butanedione)、1，2_環己二酮和卻三酮中的一種或幾種常規試劑反應可以修飾精氨酰殘基。因為胍功能團的PKa高，因此精氨酸殘基的衍生作用要求在堿性條件下實施反應。而且，這些試劑可以與賴氨酸基團，以及精氨酸e
氨基反應。
通過與芳香族重氮化合物或四硝基甲烷反應可以對酪氨酰殘基進行特異修飾，實現引入光譜標記到酪氨酰殘基中的特殊目的。用N-acetylimidizole和四硝基甲烷分別形成0-乙酰酪氨酰種類和3-硝基衍生物是最常見的。可以利用1251或1311碘化酪氨酰殘基以制備供放射免疫測定用的標記蛋白，如上所述的氯胺T法是適當的方法。通過與碳化二亞胺(R’ -N=C=N-R')反應可以有選擇地修飾羧基側基(天冬氨酰基或谷氨酰)，其中R和R’隨意地是不同的烷基，例如I-環己基-3-(2-嗎啉基-4-乙基)碳化二亞胺或I-乙基-3-(4-氮-4，4-二甲戍(dimethylpenyl))碳化二亞胺。而且,通過與銨離子反應，可以將天冬氨酰基和谷氨酰殘基轉化為天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰基殘基。與雙功能試劑的衍生作用可用于將抗體交聯到不溶于水的支持基質或表面上，其中所述基質或表面還用于除如下所述方法之外的多種方法。通常使用的交聯劑包括， 例如，1，I- 二(重氮乙酰)-2_苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯，例如具有4-疊氮水楊酸的酯、同(基)雙功能亞氨酸酯，包括雙琥拍酰酯(disuccinimidyl esters),例如3，3’ -dithiobis (琥珀酰丙酸鹽)、雙功能馬來酰亞胺，例如雙氮馬來酰亞胺-1，8辛烷。衍生試劑，例如甲基-3_(p-疊氮苯)二硫代]propioimidate可產生存在光時能形成交聯的光敏化中間物。或者，都全部引入作為參考的美國專利Nos. 3，969，287 ;3，691，016 ；4，195，128 ;4，247，642 ;4，229，537和4，330，440中描述的不溶于水的反應性基質，例如溴化氰激活的糖和反應性底物可以用于蛋白固定。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基殘基經常分別被脫去酰胺基而成為對應的谷氨酰和天冬氨酰殘基。或者，在溫和的酸性條件下可以使這些殘基脫去酰胺基。這些殘基的兩種形式中的任何一種都在本發明的范圍內。其他修飾包括脯氨酸和賴氨酸的羥基化作用、絲氨酰或蘇氨酰殘基的羥基的磷酸化、賴氨酸、精氨酸和組氨酸側鏈a氨基的甲基化(T. E. Creighton, Proteins: Structureand Molecular Properties, ff. H. Freeman Co. , San Francisco, pp. 79_86[1983],全部引入作為參考)、N-末端胺的乙酰化和任何C末端羧基的酰胺化。糖基化另一種共價修飾是糖基化。在另一個實施例中，可以修飾這里公開的IgG變體以包括一種或多種加工的糖形。這里使用的〃加工的糖形〃指共價附著于IgG的糖組合物，其中所述的糖組合物化學上不同于親代IgG的糖。加工的糖形可用于多種目的，包括但不限于增強或降低效應器功能。可以通過本領域已知的多種方法產生加工的糖形(Limana et al. , 1999, Nat Biotechnoll7:176-180 ；Davies et al. , 2001, BiotechnolBioeng 74:288-294 ;Shields et al. , 2002, J Biol Chem 277:26733-26740 ;Shinkawaet al. , 2003, J Biol Chem278:3466-3473 ；US 6,602, 684 ；USSN 10/277, 370 ；USSN10/113,929 ；PCT W000/61739A1 ；PCT WO 01/29246A1 ；PCT WO 02/31140A1 ；PCTW002/30954A1,都全部引入作為參考；(Potelligent 技術[Biowa, Inc. , Princeton, NJ]；GlycoM Ab 糖基化工程技術[Glycart Biotechnology AG, Ziirich, Switzerland])。這些技術中的許多都基于控制共價附著于Fe區的巖藻糖化的寡糖和/或等分的寡糖的水平，例如可通過在各種生物體或細胞系中表達IgG、加工或其他方法(例如Lec-13 CHO細胞或大鼠雜交瘤YB2/0細胞)、通過調節參與糖基化路徑的酶(例如FUT8 [1，6-墨角藻糖基轉移酶]和/或P1-4-N-乙酰葡糖氨基轉移酶III [GnTIII])、或通過在表達IgG后修飾糖進行控制。加工的糖形通常指不同的碳水化合物或寡糖，因此IgG變體，例如抗體或Fe融合物可以包含加工的糖形。或者，加工的糖形可以指包含不同碳水化合物或寡糖的IgG變體。糖基化模式既取決于蛋白序列(例如存在或缺少下述具體糖基化氨基酸殘基)，又取決于生產蛋白的宿主細胞或生物體，這一點本領域是已知的。下文討論了具體表達系統。 多肽的糖基化通常是N-連接或0-連接。N-連接指碳水化物部分附著到天冬酰胺殘基的側鏈上。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是酶催化碳水化物部分附著到天冬酰胺側鏈上的識別順序，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因此，多肽中存在這些三肽序列中的任何一個就可以產生潛在的糖基化位點。0-連接糖基化指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一個附著到羥氨基酸上，雖然可以使用5-羥脯氨酸或5-羥基賴氨酸，但通常大多數附著到絲氨酸或蘇氨酸上。通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述的三肽序列(適合于N-連接的糖基化位點)，可以方便地添加糖基化位點到抗體上。也可以通過添加或替換一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基到起始序列上來實施改變(適合于0-連接糖基化位點)。簡單說來，優選 通過DNA水平的變化來改變抗體的氨基酸序列，特別是通過突變編碼靶多肽的DNA的預選堿基以產生將翻譯成目的氨基酸的密碼子來進行改變。另一個增加抗體上碳水化合物部分的數目的方式是通過化學偶合或酶催化偶合糖苷到蛋白上。這些過程是有利的，因為他們不需要在具有N-和0-連接糖基化能力的宿主細胞中產生蛋白。糖可以附著于(a)精氨酸和組氨酸、(b)自由羧基、(C)自由硫氫基，例如半胱氨酸的那些硫氫基、(d)自由羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸中的那些羥基、(e)芳香族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸中的那些殘基、或(f)谷氨酰胺的酰胺基，具體附著方式取決于使用的偶合方式。都全部引入作為參考的WO 87/05330和Aplin andWriston, 1981，CRC Crit. Rev. Biochem.，pp. 259-306 中描述了這些方法。可以用化學方法或酶方法完成除去存在于起始抗體上的碳水化合物部分的過程。化學去糖基化需要將蛋白暴露于化合物三氟甲磺酸或同等化合物。這種處理會導致除連接糖(N -乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖被切割，剩下完整無缺的多肽。都全部引入作為參考的Hakimuddin et al. , 1987, Arch. Biochem.Biophys. 259:52and by Edge et al.，1981，Anal. Biochem. 118:131 中描述了化學去糖基化。通過利用全部引入作為參考的Thotakura et al.，1987，Meth. Enzymol. 138:350描述的多種內-和外糖苷酶可以實現用酶從多肽上切割糖部分。通過利用全部引入作為參考的Duskin et al.，1982，J. Biol. Chem. 257:3105描述的化合物衣霉素可以防止潛在糖基化位點發生糖基化。衣霉素阻斷蛋白-N-糖苷連接形成。抗體的另一種共價修飾包括按照，例如都全部引入作為參考的2005-2006 PEGCatalog from Nektar Therapeutics (從 Nektar 網站可以獲得)美國專利 4，640，835 ;4，496, 689 ;4，301，144 ;4，670，417 ;4，791，192 或 4，179，337 列出的方式，將抗體連接到多種非蛋白聚合物上，包括但不限于連接到各種多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯上。另外，可以在抗體內的多個位點進行氨基酸替換以促進聚合物，例如PEG的添加，這一點本領域已經已知。例如，參見完全引入作為參考的美國公開No. 2005/0114037A1。標記抗體在一些實施方式中，本發明的抗體的共價修飾包括添加一種或多種標記。有些情況下，這些也被認為是抗體融合物。術語〃標記基團〃指任何可檢測的標記。在一些實施方式中，通過減少潛在空間阻礙的各種長度的間隔臂將標記基團連接到抗體上。標記蛋白的多種方法本領域已經已知，而且這些方法都可以用于實施本發明。通常，依據檢測標記的測定將標記分為多種類別a)同位素標記，可以是放射性同位素或重同位素山)磁性標記(例如，磁顆粒)；c)氧化還原活性部分；d)熒光染料；酶催化基團(例如，辣根過氧化酶、3 -半乳糖苷酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)；e)生物素化基團；和0被第二報告物識別的預先確定的多肽表位(例如，亮氨酸拉鏈配對序列、第二抗體結合部位、金屬結合域、表位標簽等等)。在一些實施方式中，通過減少潛在空間阻礙的各種長度的間隔臂將標記基團連接到抗體上。標記蛋白的多種方法本領域已經已知，而且這些方法都可以用于實施本發明。特異性標記包括光學染料，包括但不限于生色團、磷和熒光團，后者在許多情況下是特異性的。熒光團可以是"小分子〃或蛋白性質的fluores。〃熒光標記〃指通過固有的熒光特性被檢測的任何分子。適當的熒光標記包含，但 不局限于突光素、若丹明(rhodamine)、四甲基若丹明、伊紅(eosin)、藻紅(erythrosin)、香豆素(coumarin)、甲基香豆素、花(pyrene)、孔雀綠(Malacite green)、1_2_ 二苯乙烯、熒光黃、Cascade BlueJ、得克薩斯紅、IAEDANS、EDANS、BODIPY FL,LC Red 640、Cy5、Cy5. 5、LC Red 705、0regon green、Alexa_Fluor 染料(Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、AlexaFluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680)、Cascade Blue、Cascade Yellow和 R-藻紅蛋白(PE)(Molecular Probes, Eugene, OR)、FITC、若丹明和得克薩斯紅(Pierce, Rockford, IL)、Cy5、Cy5. 5> Cy7 (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) 全部引入作為參考的 MolecularProbes Handbook by Richard P. Haugland中描述了包括突光團在內的適當的光學染料。適當的蛋白性質的熒光標記也包括，但不局限于綠色熒光蛋白、包括Renilla、Ptilosarcus 或 Aequorea 物種的 GFP(Chalfie et al.，1994，Science263:802-805)、EGFP (Clontech Laboratories, Inc. , Genbank 登記入藏號 U55762)、藍突光蛋白(BFP,Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd.West, 8th Floor,Montreal, Quebec,Canada H3H 1J9 ；Stauber, 1998,Biotechniques 24:462-471;Heim et al.，1996，Curr Biol. 6:178-182)、增強的黃色熒光蛋白(EYFP, ClontechLaboratories, Inc.)、突光素酶(Ichiki et al.，1993，J. Immunol. 150:5408-5417)、3 半乳糖苷酶(Nolan et al. , 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85:2603-2607)和 Renilla(W092/15673，W095/07463, W098/14605, W098/26277, W099/49019,美國專利 Nos. 5292658，5418155，5683888，5741668，5777079, 5804387, 5874304, 5876995，5925558)。本段中引用的所有文獻引入這里作為參考。IgG 變體在一個實施方式中，本發明提供了 IgG變體蛋白。IgG變體至少包含含有重鏈CH2-CH3區的抗體片段。另外，適當的IgG變體包含Fe域(例如包含較低的絞鏈區)，包含重鏈恒定區(CH1-鉸鏈-CH2-CH3)的IgG變體在本發明中也是有用的，所有這些變體都可以融合到融合配偶體上。相對于親代IgG多肽，有時是相對于野生型IgG，IgG變體包含一種或多個氨基酸修飾。IgG變體可以具有一種或多種優化的特性。至少一個氨基酸修飾導致IgG變體的氨基酸序列不同于它的親代IgG。因此，與親代相比，IgG變體具有至少一個氨基酸修飾。或者，與親代相比，IgG變體具有一個以上的氨基酸修飾，例如大約一個到大約五十個氨基酸修飾，優選與親代相比大約一個到大約十個的氨基酸修飾，最優選與親代相比大約一個到大約五個的氨基酸修飾。因此，IgG變體的序列和親代Fe多肽的序列基本上是同源的。例如，這里的IgG變體序列與親代IgG變體序列將具有大約80%的同源性，優選至少大約90%的同源性，最優選至少大約95%的同源性。可以利用分子生物學產生遺傳修飾，或者可以用化學方法或酶方法產生修飾。抗體的靶抗原事實上，IgG變體可以靶向任何抗原，包括但不限于屬于下列列表中的靶抗原的蛋白、亞單位、域、基序和/或表位，下列列表包括如細胞因子的可溶性因子和膜結合因子，膜結合因子包括跨膜受體17-IA，4-1BB, 4Dc，6-keto-PGFla，8-iso_PGF2a，8-oxo-dG， 腺苷受體，A33, ACE, ACE-2,活化素,活化素A,活化素AB,活化素B,活化素C,活化素RIA,活化素 RIA ALK-2,活化素 RIB ALK-4，活化素 RIIA，活化素 RIIB，ADAM, ADAMlO, ADAMl2,ADAMl5, ADAMl7/TACE, ADAM8, ADAM9, ADAMTS, ADAMTS4, ADAMTS5，地址素，aFGF, ALCAM, ALK,ALK-I, ALK-7，a -I-抗胰蛋白酶，a -V/ ^ -I 拮抗劑，ANG, Ang, APAF-I, APE, APJ, APP，APRIL, AR, ARC, ART, Artemin，抗-Id，ASPARTIC，心房利鈉因子，av/b3 整聯蛋白，Axl，b2M,B7-1, B7-2, B7-H, B-淋巴細胞刺激物(BlyS), BACE, BACE-I, Bad, BAFF，BAFF-R, Bag-1,BAK, Bax, BCA-I, BCAM, Bcl，BCMA, BDNF, b-ECGF，bFGF, BID, Bik, BIM, BLC, BL-CAM，BLK,BMP，BMP-2BMP-2a, BMP-3 成骨蛋白(Osteogenin)，BMP-4 BMP_2b，BMP-5，BMP-6 Vgr-I,BMP-7 (OP-I)，BMP-8(BMP-8a, 0P-2), BMPR, BMPR-IA(ALK-3), BMPR-IB(ALK-6), BRK-2，RPK-1, BMPR-II (BRK-3)，BMPs，b-NGF，B0K，蛙皮素(Bombesin)，骨衍生神經營養因子，BPDE，BPDE-DNA, BTC,補體因子 3 (C3)，C3a, C4, C5, C5a, CIO, CA125, CAD-8,降鈣素，cAMP,癌胚抗原(CEA)，癌相關抗原，組織蛋白酶A，組織蛋白酶B，組織蛋白酶C/DPPI，組織蛋白酶D，組織蛋白酶E，組織蛋白酶H，組織蛋白酶L，組織蛋白酶0，組織蛋白酶S，組織蛋白酶V，組織蛋白酶 X/Z/P, CBL, CCI, CCK2, CCL, CCLl, CCLlI, CCL12, CCL13, CCL14, CCL15, CCL16, CCL17,CCL18, CCL19, CCL2, CCL20, CCL21，CCL22，CCL23, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, CCL28, CCL3,CCL4, CCL5, CCL6, CCL7, CCL8, CCL9/10, CCR, CCRl，CCR10, CCR10, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5,CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CDl，CD2, CD3, CD3E, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CDlla, CDllb,CDllc, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD25, CD27L, CD28,CD29, CD30, CD30L, CD32, CD33 (p67 蛋白)，CD34, CD38, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD46,CD49a, CD52, CD54, CD55, CD56, CD61, CD64, CD66e, CD74, CD80(B7_1)，CD89, CD95, CD123,CD137, CD138, CD140a, CD146, CD147, CD148, CD152, CD164, CEACAM5, CFTR, cGMP, CINC,肉毒桿菌毒素，產氣莢膜梭菌毒素，CKb8-l, CLC, CMV, CMV UL, CNTF, CNTN-I, COX, C-Ret，CRG-2，CT-I，CTACK, CTGF，CTLA-4，CX3CL1, CX3CR1, CXCL, CXCLl，CXCL2, CXCL3, CXCL4, CXCL5,CXCL6, CXCL7, CXCL8, CXCL9, CXCLlO， CXCLlI， CXCLl2， CXCLl3， CXCL14, CXCLl5， CXCL16,CXCR, CXCRl，CXCR2，CXCR3，CXCR4，CXCR5，CXCR6，細胞角蛋白腫瘤相關抗原，DAN，DCC, DcR3,DC-SIGN，衰變加速因子，des (1-3)-IGF-I (腦 IGF-1)，Dhh，地高辛，DNAM-I, Dnase, Dpp,DPPIV/CD26，Dtk, ECAD, EDA,EDA-A1，EDA-A2，EDAR,EGF,EGFR(ErbB-I)，EMA,EMMPRIN,ENA,內皮素受體，腦啡肽酶，eNOS，Eot，嗜酸細胞活化趨化因子I (eotaxinl)，EpCAM, Ephrin B2/EphB4, EPO, ERCC, E-選擇素(E-selectin)，ET-I,因子 IIa,因子 VII,因子 VIIIc,因子 IX，成纖維細胞激活蛋白(FP)，Fas, FcRl, FEN-1，鐵蛋白，FGF, FGF-19，FGF-2，FGF3，FGF-8，FGFR, FGFR-3，纖維蛋白，FL, FLIP, Flt-3, Flt_4，促卵泡激素，Fractalkine, FZDl，FZD2,FZD3, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, G250, Gas 6，GCP-2，GCSF，GD2, GD3, GDF，⑶F-1，⑶F-3(Vgr-2)， ⑶F_5(BMP_14，CDMP-1)，⑶F_6(BMP_13，CDMP-2)，⑶F_7(BMP_12，CDMP-3)，⑶F-8 (筒箭毒堿)，⑶F-9，⑶F-15 (MIC-I)，⑶NF，⑶NF，GFAP, GFRa-I，GFR- a 1，GFR-a 2，GFR-a 3，GITR，胰高血糖素，Glut 4，糖蛋白 IIb/IIIa(GP Ilb/IIIa), GM-CSF,gpl30, gp72，GRO，生長激素釋放因子，半抗原(NP-cap 或 NIP-cap)，HB-EGF, HCC, HCMV gB包膜糖蛋白，HCMV)gH包膜糖蛋白，HCMV UL，造血生長因子(HGF)，H印B gpl20，類肝素酶，Her2，Her2/neu(ErbB-2)，Her3(ErbB-3)，Her4(ErbB-4)，單純皰疹病毒(HSV) gB 糖蛋白，HSVgD糖蛋白，HGFA，高分子量黑素瘤相關抗原(HMW-MAA)，HIV gpl20，HIV IIIB gp 120V3環，HLA, HLA-DR,HM1. 24, HMFG PEM，HRG，Hrk，人心臟肌球蛋白，人巨細胞病毒(HCMV)，人生長激素(HGH)，HVEM, 1-309，IAP, ICAM, I CAM-1, ICAM-3，ICE, I COS, IFNg, Ig, IgA 受體，IgE，IGF,IGF 結合蛋白，IGF-1R, IGFBP, IGF-I, IGF-II, IL, IL-1，IL-1R，IL-2，IL-2R，IL-4，IL-4R，IL-5, IL-5R, IL-6, IL-6R，IL-8，IL-9，IL-10，IL-12，IL-13，IL-15，IL-18，IL-18R，IL-23，干擾素(INF) - a，INF- ^，INF- y，抑制素，iNOS,胰島素A-鏈，胰島素B-鏈，胰島素樣生長因子I,整聯蛋白a2，整聯蛋白a3，整聯蛋白a4，整聯蛋白a4/01，整聯蛋白a4/37，整聯蛋白a5(aV)，整聯蛋白a5/01，整聯蛋白a5/03，整聯蛋白a6，整聯蛋白￠1，整聯蛋白P 2，干擾素￥，1 -10，1-1々(，邛，激肽釋放酶2，激肽釋放酶5，激肽釋放酶6，激肽釋放酶11，激肽釋放酶12，激肽釋放酶14，激肽釋放酶15，激肽釋放酶LI，激肽釋放酶L2，激肽釋放酶13，激肽釋放酶14，1((，1(01 ，角質化細胞生長因子(KGF)，層粘連蛋白5，LAMP，LAP，LAP(TGF-I)，潛在 TGF-1，潛在 TGF-I bpl, LBP，LDGF，LECT2, Lefty, Lewis-Y 抗原，Lewis-Y相關抗原，LFA-I，LFA-3，Lfo, HF, LIGHT，脂蛋白，LIX，LKN, Lptn, L-選擇蛋白，LT_a，LT_b，LTB4，LTBP-I，肺表面活性物質，促黃體發生激素，淋巴細胞毒素B受體，Mac-I，MAdCAM,MAG, MAP2, MARC, MCAM, MCAM, MCK-2，MCP, M-CSF, MDC, Mer，金屬蛋白酶，MGDF 受體，MGMT，MHC (HLA-DR)，MIF, MIG, MIP, MIP-I-a，MK, MMACl, MMP, MMP-I, MMP-10, MMP-II, MMP-12,MMP-13, MMP-14, MMP-15, MMP-2, MMP-24, MMP-3, MMP-7, MMP-8, MMP-9, MPIF, Mpo, MSK, MSP,粘蛋白(Mucl)，MUC18，Muellerian-抑制素(inhibitin)物質，Mug，MuSK，NAIP，NAP，NCAD，N-Cadherin, NCA 90, NCAM, NCAM, Neprilysin,神經營養因子-3，-4 或-6, Neurturin，神經生長因子(NGF)，NGFR, NGF-^，nNOS, NO, NOS, Npn, NRG-3，NT, NTN, OB, OGGI, OPG, OPN,OSM, 0X40L, 0X40R, pl50, p95, PADPr,甲狀旁腺激素，PARC，PARP, PBR, PBSF, PCAD，胎盤鈣粘蛋白(P-Cadherin)，PCNA, PDGF, PDGF, PDK-I, PECAM, PEM, PF4, PGE, PGF, PGI2, PGJ2，PIN,PLA2，胎盤堿性磷酸酶(PLAP)，PlGF, PLP, PP14，前胰島素，前松弛素(Prorelaxin)，蛋白C，PS, PSA, PSCA，前列腺特異性膜抗原(PSMA)，PTEN, PTHrp, Ptk, PTN, R51, RANK, RANKL,RANTES, RANTES,松弛素A-鏈，松弛素B-鏈，腎素，呼吸道合胞病毒(RSV) F，RSV Fgp, Ret,類風濕因子，RLIP76, RPA2, RSK, S100, SCF/KL, SDF-I, SERINE，血清白蛋白，sFRP-3，Shh,SIGIRR, SK-I, SLAM, SLPI, SMAC, SMDF, SMOH, SOD, SPARC, Stat, STEAP, STEAP-II, TACE,TACI, TAG-72 (腫瘤相關糖蛋白-72)，TARC, TCA-3，T-細胞受體(例如T-細胞受體a /3 )，TdT, TECK, TEMl，TEM5, TEM7, TEM8, TERT,睪丸 PLAP 樣堿性磷酸酶，TfR, TGF, TGF- a，TGF- P，TGF- P Pan 特異，TGF- P RI (ALK-5)，TGF- P RII，TGF- P RIIb，TGF- P RIII，TGF- 3 I，TGF-P 2，TGF-P 3，TGF-P 4，TGF-P 5，凝血酶，胸腺 Ck-I，促甲狀腺激素，Tie, TIMP, TIQ，凝血激酶(Tissue Factor)，TMEFF2, Tmpo, TMPRSS2, TNF, TNF-a，TNF-a ^，TNF-P 2，TNFc,TNF-RI, TNF-RII, TNFRSFIOA(TRAIL Rl Apo-2, DR4), TNFRSFIOB(TRAIL R2DR5, KILLER,TRICK-2A, TRICK-B)，TNFRSF10C (TRAIL R3 DcRl，LIT, TRID)，TNFRSFIOD (TRAIL R4 DcR2,TRUNDD)，TNFRSF11A(RANK ODFR, TRANCE R)，TNFRSF11B (OPG OCIF, TRl)，TNFRSF12 (TWEAKRFN14)，TNFRSF13B(TACI)，TNFRSF13C(BAFF R)，TNFRSF14(HVEMATAR, HveA,LIGHT R, TR2)，TNFRSFI6(NGFR p75NTR)， TNFRSFI7(BCMA)， TNFRSFI8(GITR AITR)， TNFRSFI9(TROY TAJ,TRADE)，TNFRSFI9L(RELT)，TNFRSFIA(TNF RI CD120a，p55_60)，TNFRSF1B(TNFRII CD120b，p75-80)，TNFRSF26(TNFRH3)，TNFRSF3(LTbR TNF RIII，TNFC R)，TNFRSF4(0X40 ACT35,TXGPl R)，TNFRSF5 (CD40 p50)，TNFRSF6(Fas Apo_l，APT1，CD95)，TNFRSF6B(DcR3M68，TR6)，TNFRSF7(CD27)，TNFRSF8(CD30)，TNFRSF9 (4-1BB CD137, ILA)，TNFRSF21 (DR6)，TNFRSF22(DcTRAIL R2 TNFRH2)， TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)， TNFRSF25(DR3 Apo-3, LARD, TR-3, TRAMP, WSL-1), TNFSF10 (TRAIL Apo_2 配體，TL2)，TNFSFl I (TRANCE/RANK 配體 ODF，OPG 配體)，TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配體，DR3 配體)，TNFSF13 (APRIL TALL2)，TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl, THANK, TNFSF20), TNFSF14(LIGHTHVEM 配體，LTg)，TNFSF15(TL1A/VEGI), TNFSF18 (GITR 配體 AITR 配體，TL6)，TNFSF IA (TNF-a Conectin,DIF, TNFSF2), TNFSF1B (TNF-bLTa，TNFSFI), TNFSF3 (LTb TNFC, p33)，TNFSF4 (0X40 配體gp34, TXGPI)，TNFSF5 (CD40 配體 CD154，gp39, HIGMl，IMD3, TRAP)，TNFSF6 (Fas 配體 Apo-1配體，APTl 配體)，TNFSF7 (CD27 配體 CD70)，TNFSF8 (CD30 配體 CD153)，TNFSF9 (4-1BB 配體 CD137 配體)，TP-I, t-PA, Tpo, TRAIL, TRAIL R, TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRANCE，轉移因子，TRF, Trk, TROP-2, TSG，TSLP，腫瘤相關抗原CA 125，腫瘤相關抗原表達LewisY相關碳水化合物，TWEAK, TXB2, Ung, uPAR, uPAR-1，尿激酶，VCAM, VCAM-I, VECAD, VE-鈣粘蛋白，VE-鈣粘蛋白-2，VEFGR-I (flt-1)，VEGF, VEGFR, VEGFR-3 (flt-4), VEGI, VIM，病毒抗原，VLA, VLA-I, VLA-4, VNR 整聯蛋白，von Willebrands 因子，WIF-I, WNTI, WNT2, WNT2B/13,WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9A, WNT9B,WNTIOA, WNTI OB, WNTl I，WNT16, XCLl，XCL2, XCRl，XCRl，XEDAR, XIAP, XPD,以及激素和生長因子受體。本領域熟練技術人員應理解上述靶標列表不僅指具體蛋白和生物分子，而且也指包含他們的生物化學路徑。例如CTLA-4作為靶抗原暗示組成T細胞共同刺激路徑的配體和受體也是靶標，其中配體和受體包括CTLA-4、B7-l、B7-2、⑶28和任何其他的未發現的結合這些蛋白的配體或受體。因此，這里使用的靶標不僅指具體的生物分子，而且指與所述靶標相互作用的一類蛋白和所述靶標屬于其中的生物化學路徑的成員。本領域熟練技術人員應更進一步地理解上述任何目標抗原、結合他們的配體或受體、或他們對應的生物化學路徑的其他成員可以操作性地與本發明的Fe變體連接以產生Fe融合物。因此，通過將Fe變體操作性地連接到EGF、TGF-b或任何發現或未發現的結合EGFR的其他配體上可以構建靶向EGFR的Fe融合物。因此，可以將本發明的Fe變體操作性地連接到EGFR上以產生結合EGF、TGF-b或任何發現或未發現的結合EGFR的其他配體的Fe融合物。因此，事實上任何多肽，不論配體、受體或其它蛋白或蛋白域，包括但不限于上述靶標和組成他們的對應生物化學路徑的蛋白，都可以操作性地連接到本發明的Fe變體上以產生Fe融合物。適當抗原的選擇取決于想要實現的用途。對抗癌治療來說，具有表達只限于癌細胞的靶標是合乎需要的。已經證明一些特別適合用于抗體治療的靶標是那些具有信號發送功能的靶標。其他的治療抗體通過抑制受體和它的同族配體之間的結合阻斷受體發送信號來發揮他們的作用。治療抗體的另一種作用機制是使受體下調。其他抗體不通過發送信號通過他們的目標抗原起作用。有時使用針對傳染病因子的抗體。在一個實施方案中，本發明的Fe變體被摻入抗細胞因子抗體中。或者，Fe變體與細胞因子融合或偶聯。這里使用的"細胞因子"是一群細胞釋放的作為細胞間介質作用于另一細胞的蛋白總稱。例如正如特別引入作為參考的Penichet et al.，2001，JImmunol Methods 248:91-101中所述,可以將細胞因子融合到抗體上以提供合乎需要的特性組。這種細胞因子的實例有淋巴因子、單核因子和傳統的多肽激素。包括在細胞因子之 中的有生長激素，例如人生長激素、N-甲硫氨酰人生長激素和牛生長素；甲狀旁腺激素；甲狀腺素；胰島素；胰島素原；松弛肽；前松弛素；糖蛋白激素，例如促卵泡激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)和促黃體生成激素(LH);肝臟生長因子；成纖維細胞生長因子；催乳素；胎盤催乳素；腫瘤壞死因子-a和;mullerian-抑制物質；小白鼠促性腺激素相關肽；抑制素；活化素；血管內皮生長因子；整聯蛋白；促血小板生成素(TPO);神經生長因子，例如NGF-P ;血小板生長因子；轉化生長因子(TGFs)，例如TGF-a和TGFj ;胰島素樣生長因子-I和-II ;促紅細胞生成素(EPO);骨誘導性因子；干擾素，例如干擾素-a、P和_ Y ;集落刺激因子(CSFs)，例如巨噬細胞-CSF(M-CSF);粒細胞-巨噬細胞-CSF(GM-CSF)和粒細胞-CSF (G-CSF);白細胞介素(IL)，例如 IL-l，IL-la , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8, IL-9, IL-10, IL-II，IL-12, IL-15 ;腫瘤壞死因子，例如 TNF-a 或 TNF-P ；C5a ;及其他多肽因子，包括LIF和試劑盒配體(KL)。這里使用的術語細胞因子包括來自天然來源或來自重組細胞培養物的蛋白，以及天然序列細胞因子的生物學活性同等物。細胞因子和可溶性靶標，例如TNF超家族成員是用于本發明變體的優選靶標。例如抗VEGF、抗CTLA-4和抗TNF抗體或其片段是用于增加FcRn結合的Fe變體的特別優良的抗體。針對這些靶標的治療經常涉及治療自身免疫疾病，而且需要長期多次注射。因此，本發明變體帶來的較長的血清半衰期和較低的治療頻率是特別優選的。批準在臨床試驗或在研發中使用的大量抗體和Fe融合物可以從本發明的Fe變體得益。這些抗體和Fe融合物在這里稱為"臨床產物和候選物"。因此，在優選實施方案中，本發明的Fe多肽可以用于大量臨床產物和候選物。例如大量靶向CD20的抗體可以從本發明的Fe多肽得益。例如，本發明的Fe多肽可以用于基本上與嵌合的批準用于治療非何杰金(氏)淋巴瘤的抗⑶20抗體利妥昔單抗(rituximab, Rituxan ,IDEC/Genentech/Roche)(例如參見 US 5，736，137)相似的抗體；Genmab 目前的抗CD20 HuMax-CD20、US5, 500，362 中描述的抗 CD20 抗體、AME-133 (Applied MolecularEvolution)、hA20 (Immunomedics, Inc. )、HumaLYM(Intracel)和 PR070769 (PCT/US2003/040426，題為〃免疫球蛋白變體及其用途〃)。靶向表皮生長因子受體家族成員，包括 EGFR(ErbB-I)、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)的大量抗體可以從本發明的Fe多肽得益。例如，本發明的Fe多肽可以用于基本上與批準用于治療乳腺癌的人源化抗Her2/neu抗體曲妥單抗(trastuzumab，Herceptin , Genentech)
(例如參見 US 5，677，171)相似的抗體；Genentech 目前的 pertuzumab (rhuMab_2C4，Omnitarg ) ；US 4，753，894中描述的抗-Herf抗體；在多種癌的臨床試驗中使用的嵌合的抗 EGFR 抗體西妥昔單抗(cetuximab，Elbitux , Imclone) (US4，943，533 ；PCTW096/40210) ；Abgenix-Immunex-Amgen 目前的 ABX_EGF(US6，235，883) ；Genmab 目前的HuMax-EGFr (USSN 10/172, 317) ;425、EMD55900、EMD62000 和 EMD72000 (Merck KGaA)(US 5，558，864 ；Murthy et al. 1987，Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60 ；Rodecket al.，1987，J Cell Biochem. 35(4) :315-20 ；Kettleborough et al.，1991，ProteinEng.4(7) :773-83) ；ICR62 (Institute of Cancer Research) (PCT W095/20045 ；Modjtahedi et al. , 1993,J.CelI Biophys. 1993，22(1-3) :129-46 ；Modjtahediet al.，1993，Br J Cancer. 1993，67 (2):247-53 ;Modjtahedi et al，1996，Br JCancer,73(2):228-35 ；Modjtahedi et al，2003， Int JCancer,105(2):273-80)；TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular， Cuba (US 5，891，996 ；US 6，506，883 ；Mateo et al, 1997，Immunotechnology, 3 (I) : 71-81)；an~Kettering)(Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (2):639-44)；KSB-102(KS Biomedix) ;MR1_1(IVAX，National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2)和SClOO (Scancell) (PCT W001/88138)。在另一個優選實施方案中，本發明的Fe多肽可以用于目前批準用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病的人源化單克隆抗體阿侖單抗(alemtuzumab，CaiHpath ，Millenium)。本發明的Fe多妝可以用于基本上與其他臨床產物和候選物相似的多種抗體或Fe融合物，包括但不限于Ortho Biotech/Johnson&Johnso 的抗 CD3 抗體莫羅單抗(muromonab)-CD3 (Orthoclone OKT3 )、IDEC/Schering AG 的抗 CD20 抗體替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan, Zevalill )、Celltech/Wyeth 的抗 CD33(p67 蛋白)抗體 gemtuzumab ozogamicin (Mylotarg )、Biogen 的抗 LFA_3Fc 融合物 alefacept (Allievive⑧)、Centocor Lilly 的阿昔單抗(abciximab，ReoPro )、Novartis 的巴利昔單抗(basiliximab，Simulect )、MedImmune 的巾白利珠單抗(palivizumab，SynagiS )、Centocor 的抗 TNFa 抗體英夫利昔單抗(infliximab，Remicade )、Abbott的抗TNF a抗體阿達木單抗(adalimumab，Humira )、Celltech 的抗 TNF a 抗體 Humicade 、Immunex/Amgen 的抗TNF a Fe 融合物 etanercept (Enbrel)⑧)、Abgenix 的抗 CD147 抗體 ABX-CBL、Abgenix的抗 IL8 抗體 ABX-IL8、Abgenix 的抗 MUC18 抗體 ABX-MA1、Antisoma 正在的抗 MUClPemtumomab (R1549，90Y_muHMFGl)、Antisoma 的抗 MUCl 抗體 Therex (R1550)、Antisoma 的AngioMab (AS1405)、Antisoma 的 HuBC-1、Antisoma 的 Thioplatin (AS1407)、Biogen 的抗a -4- ￠-1 (VLA-4)和 a-4-_7 抗體 Antegren (那他珠單抗(natalizumab) )、Biogen 的抗VLA-I整聯蛋白抗體VLA-I mAb、Biogen的抗淋巴細胞毒素P受體(LTBR)抗體LTBRmAb、Cambridge Antibody Technology 的抗 TGF-2 抗體 CAT-152、Cambridge AntibodyTechnology 和 Abbott 的抗 IL-12 抗體 J695、Cambridge Antibody Technology 和 Genzyme的抗TGFP I抗體CAT-192、Cambridge Antibody Technology的抗嗜酸細胞活化趨化因子抗體 CAT-213、Cambridge Antibody Technology 和 Human Genome Sciences Inc.的抗Blys 抗體 LymphoStat-B 、Cambridge Antibody Technology 和 Human Genome SciencesInc.的抗 TRAIL-Rl 抗體 TRAIL-RlmAb、Genentech 的抗 VEGF 抗體 Avastin (貝伐單抗(bevacizumab), rhuMAb-VEGF)、Genentech 的抗 HER 受體家族抗體、Genentech 的抗組織因子抗體抗組織因子(ATF)、Genentech 的抗 IgE 抗體 Xolair (Omalizumab)、Genentech 和Xoma 的抗 CDlla 抗體 Raptiva (Efalizumab)、Genentech 和 Millenium Pharmaceuticals的 MLN-02 抗體(以前的 LDP-02)、Genmab 的抗 CD4 抗體 HuMax CD4、Genmab 和 Amgen 的抗IL15 抗體 HuMax_IL15、Genmab 和 Medarex 的 HuMax-Inf lam、Genmab 和 Medarex 和 OxfordGcoSciences的抗類肝素酶I抗體HuMax-癌、Genmab和Amgen的HuMax-淋巴瘤、Genmab的HuMax-TAC> IDEC Pharmaceuticals 的抗 CD40L 抗體 IDEC-131、IDEC Pharmaceuticals 的抗 CD40L 抗體 IDEC-151 (克立昔單抗(clenoliximab)) >IDEC Pharmaceuticals 的抗 CD80抗體 IDEC-114、IDEC Pharmaceuticals 的抗 CD23 抗體 IDEC-152、IDEC Pharmaceuticals的抗巨噬細胞遷移因子(MIF)抗體、Imclone的抗獨特型抗體BEC2、Imclone的抗KDR抗體IMC-1C11、Imclone 的抗 flk_l 抗體 DClOl、Imclone 的抗 VE I丐粘蛋白抗體、Immunomedics的抗癌胚抗原(CEA)抗體 CEA-Cide (Iabetuzumab)、Immunomedics 的抗 0)22 抗體 LymphoCide (依中白珠單抗(Epratuzumab))、Immunomedics 的 AFP-Cide> Immunomedics 的MyelomaCide、Immunomedics 的 LkoCide、Immunomedics 的 ProstaCide、Medarex 的抗 CTLA4抗體 MDX-010、MDMedarex 的抗 CD30 抗體 MDX_060、Medarex 的 MDX_070、Medarex 的 MDX-018、Medarex 和 Immuno-Designed Molecules 的抗 Her2 抗體 Osidem (IDM-l)、Medarex 和Genmab 的抗 CD4 抗體 HuMax -CD4、Medarex 和 Genmab 的抗 IL15 抗體 HuMax_IL15、Medarex和 Centocor/J&J 的抗 TNF a 抗體 CNTO 148、Centocor/J&J 的抗細胞因子抗體 CNTO 1275、MorphoSys 的抗在細胞間粘附分子-I (ICAM-I) (CD54)抗體 MORlOl 和 M0R102、MorphoSys的抗成纖維細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗體M0R201、Protein Design Labs的抗CD3抗體Nuvion (visilizumab)、Protein Design Labs 的抗 Y 干擾素抗體 HuZAF 、ProteinDesign Labs 的抗 a 5P I 整聯蛋白、Protein Design Labs 的抗 IL-12、Xoma 的抗 Ep-CAM抗體ING-1、和Xoma的抗B2整聯蛋白抗體MLN01，本段中引用的所有文獻引入這里作為參考。本發明Fe多肽可以整合到上述臨床候選物和產物中，或者整合到與他們基本相似的抗體和Fe融合物中。本發明Fe多肽可以整合到上述臨床候選物和產物的用某種其他方法人源化、親合成熟、加工或修飾的形式中。在一個實施方式中，本發明的Fe多肽被用來治療自身免疫、炎性或移植適應癥。與這種疾病相關的靶抗原和臨床產物和候選物包括但不局限于抗- a 40 7整聯蛋白抗體，例如LDP-02，抗￠2整聯蛋白抗體，例如LDP-01，抗補體(C5)抗體，例如5G1. 1，抗 CD2 抗體，例如 BTI-322, MEDI-507,抗 CD3 抗體，例如 0KT3, SMART 抗 CD3,抗 CD4 抗體，例如 IDEC-151, MDX-CD4, 0KT4A,抗 CDlla 抗體，抗 CD14 抗體，例如 IC14,抗 CD18抗體，抗CD23抗體，例如IDEC 152，抗CD25抗體，例如Zenapax,抗CD40L抗體，例如 5c8, Antova, IDEC-131,抗 CD64 抗體，例如 MDX-33，抗 CD80 抗體，例如 IDEC-114,抗CD147抗體，例如ABX-CBL，抗E-選擇素抗體，例如CDP850，抗gpIIb/IIIa抗體，例如 ReoPro/Abcixima,抗 ICAM-3 抗體，例如 ICM3,抗 ICE 抗體，例如 VX-740,抗 FcRl抗體，例如MDX-33,抗IgE抗體，例如rhuMab-E25,抗IL-4抗體，例如SB-240683,抗IL-5抗體，例如SB-240563，SCH55700,抗IL-8抗體，例如ABX-IL8，抗干擾素Y抗體，抗-TNF (TNF，TNFaj TNFaj TNF- a )抗體，例如 CDP571，CDP870，D2E7，英夫利昔單抗，MAK-195F 和 VLA-4 抗體，例如 Antegren。本發明的Fe變體，例如那些對FcRn的結合增強的變體可以用在TNF抑制劑分子中以提供增強的特性。有用的TNF抑制劑分子包括在哺乳動物中抑制TNF-a作用的任何分子。適當的實例包括Fe融合物Enbrel (etanercept)，抗體Humira (阿達木單抗)和Remicade (英夫利昔單抗)。利用本發明 的Fe變體加工以增加FcFn結合的單克隆抗體(例如Remicade和Humira)可以通過延長的半衰期轉變為最好的功效。在一些實施方案中，可以使用針對傳染性疾病的抗體。針對真核細胞的抗體包括革巴向酵母細胞的抗體，包括但不限于釀酒酵母(Saccharomyces erevisiae)、多形漢森酵母(Hansenula polymorpha)、脆壁克魯維酵母(Kluyveromyces fragilis)和乳酸克魯維酵母(K. lactis)、Pichia guillerimondii和巴斯德畢赤酵母(P. pastoris)、稷酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、惡性癥原蟲(plasmodium falciparium)和解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。針對其他真菌細胞的抗體也是有用的，包括與包含光滑假絲酵母(Candidaglabrata)、白色念珠菌(C. albicans)、克柔氏念珠菌(C. krusei)、葡萄牙念珠菌(C. Iusitaniae)和麥芽糖假絲酵母(C. maltosa)的念珠菌屬菌株，以及曲霉(Aspergillus)、隱球菌屬(Cryptococcus)、組織胞衆菌屬(Histoplasma)、球孢子菌屬(Coccidioides)、芽生菌(Blastomyces)和青霉菌(Penicillium)的菌種有關的祀抗原。針對與原生動物有關的祀抗原的抗體包括，但不局限于與錐蟲屬(Trypanosoma)、包括杜氏利什曼原蟲(L. donovanii)的利什曼蟲(Leishmania)種、癥原蟲種(Plasmodiumspp.)、卡氏月市囊蟲(Pneumocystis carinii)、小球隱抱子蟲(Cryptosporidium parvum)、蘭氏賈第鞭毛蟲(Giardia Iamblia)、溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)和圓孢子蟲(Cyclospora cayetanensis)有關的抗體。針對原核生物抗原的抗體也是有用的，包括針對適當的細菌，例如致病和不致病原核生物的抗體，其中致病和不致病原核生物包括但不限于芽孢桿菌屬(Bacillus)，包括炭疽桿菌(B. anthracis);弧菌屬(Vibrio)，例如霍亂弧菌(V. cholerae);埃希氏菌屬(Escherichia)，例如腸產毒性大腸桿菌(Enterotoxigenic E. coli);志賀氏菌屬(Shigella)、例如痢疾志賀氏菌(S. dysenteriae);沙門氏菌屬(Salmonella)，例如傷寒沙門氏菌(S. typhi);分枝桿菌屬(Mycobacterium)，例如結核分枝桿菌(M. tuberculosis)、麻風分枝桿菌(M. leprae);梭菌屬(Clostridium)，例如肉毒梭菌(C. botulinum)、破傷風梭菌(C. tetani)、艱難梭菌(C. difficile)、產氣莢膜梭菌(C. . perfringens);棒狀桿菌屬(Cornyebacterium)，例如白喉桿菌(C. diphtheriae);鏈球菌屬(Streptococcus)，胺鏈球菌(S. pyogenes)、肺炎鏈球菌(S. pneumoniae);葡萄球菌屬(Staphylococcus)，例如金黃色葡萄球菌(S. aureus);嗜血桿菌屬(Haemophi Ius)，例如流感嗜血桿菌(H. influenzae);奈瑟氏菌屬(Neisseria)，例如腦膜炎奈奈瑟菌(N. meningitidis)、淋病奈瑟菌(N. gonorrhoeae);耶爾森氏菌屬(Yersinia)，例如賈第鞭毛蟲耶爾森氏菌(Y. Iamblia)、鼠疫耶爾森氏菌(Y. pest is，)、假單胞菌屬(Pseudomonas)，例如銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、惡臭假單胞菌(P. putida);衣原體(Chlamydia)，例如沙眼衣原體(C. trachomatis);博德特氏菌屬(Bordetella),例如百日咳博德特氏菌(B. pertussis)；梅毒螺旋體(Treponema),例如梅毒螺旋體(T. palladium) ;B. anthracis、布魯氏桿菌(Brucella spp. )、F. tularensis、B. mallei、B. pseudomallei、沙門氏菌(Salmonellaspp.)、SEB V.霍亂毒素B、大腸桿菌0157:H7、李斯特菌(Listeria spp.)、白色毛孢子菌(Trichosporon beigelii)、紅酵母(Rhodotorula species)、異常漢遜氏酵母(Hansenulaanomala)、腸桿菌(Enterobacter sp.)、克雷伯氏桿菌 (Klebsiella sp.)、李斯特菌(Listeria sp.)、支原體(Mycoplasma sp.)等等。在一些方案中，抗體針對病毒感染；這些病毒包括，但不局限于包括正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、腿腺炎病毒(mumps virus)、麻疫病毒(measles virus))、腺病毒、鼻病毒(rhinovirus)、冠狀病毒(coronavirus)、呼腸病毒(reovirus)、披膜病毒(togavirus)(例如風疫病毒(rubella virus))、細小病毒(parvovirus)、痘病毒(例如類天花病毒(variola virus)、痘苗病毒(vaccinia virus))、腸道病毒(例如脊髓灰質炎病毒(poliovirus)、柯薩奇病毒(coxsackievirus))、肝炎病毒(包括甲、乙和丙型)、皰疫病毒(例如單純皰疫病毒、水痘-帶狀皰疫病毒(varicella-zoster virus)、巨細胞病毒、EB病毒)、輪狀病毒、諾瓦克病毒(Norwalk virus)、漢坦病毒(hantavirus)、沙粒病毒(arenavirus)、棒狀病毒(rhabdovirus)(例如狂犬病病毒)、逆轉錄病毒(包括艾滋病病毒、HTLV-I和-II)、乳多空病毒(papovavirus)(例如乳頭瘤病毒(papillomavirus))、多瘤病毒(polyomavirus)和細小核糖核酸病毒(picornavirus)等等。優化的IgG變體特性本申請也提供了多種治療相關特性被優化的IgG變體。被加工或預計顯示出一種或多種優化特性的IgG變體在這里被稱為"優化的IgG變體"。可以被優化的最優選的特性包括，但不局限于對FcRn的親和力增強或降低和體內半衰期延長或降低。適當的實施方式包括在較低的PH，例如與內體有關的pH，例如pH 6. 0時顯示出對FcRn的結合親和力增力口，而在更高的pH，例如7. 4時不顯示出相應的增高的結合親和力以允許內體吸收增加，同時保持正常的釋放速率。同樣，FcRn結合被調節的這些抗體可以隨意地具有其他合乎需要的特性，例如經調節的 Fe YR 結合，如 U. S. S. N. Si 1/174，287，11/124，640，10/822，231，10/672，280，10/379，392和2005年10月21日提交的標題為具有優化的效應器功能的IgG免疫球蛋白變體的申請號為no.的專利申請所列出的其他特性。也就是說，優化特性也包括，但不局限于對Fe Y R的親和力增強或降低。在一個隨意的實施方式中，可以優化IgG變體使其對人激活Fe YR具有增強的親和力，除FcRn結合譜之外，還優選對Fe YRIIIa具有增強的親和力。在另一隨意的可替換的實施方案中，可以優化IgG變體使其對人抑制性受體Fe y RIIb具有降低的親和力。也就是說，具體實施方式
包括利用對FcRn的結合顯示出增加和對Fe YRIIIa的結合顯示出增加的抗體。其他的實施方式利用了對FcRn的結合顯示出增加和對Fe YRIIIa的結合顯示出增加的抗體的用途。預期這些實施例可以提供在人中具有增強的治療特性，例如具有增強的效應器功能和更高的抗癌效能的IgG多肽。在可選擇的實施方式中，可以優化IgG變體使其具有增加或降低的FcRn親和力，以及增加或降低的人Fe y R，包括但不限于Fe YRI、FcyRIIa, FcyRIIb, FcyRIIc, Fe Y RIIIa和包括他們的等位基因變異的Fe YRIIIb親和力。預期這些實施例可以提供在人中具有增強的治療特性，例如具有延長的血清半衰期和降低的效應器功能的IgG多肽。在其他實施方式中，IgG變體提供了增強的FcRn親和力，以及增強的一種或多種Fe y Rs親和力，但對一種或多種其他Fe y Rs的親和力降低。例如=IgG變體對FcRn和Fe y RIIIa的結合可以增強，但對Fe y RIIb的結合降低。或者，IgG變體對FcRn和Fe Y R的結合可以降低。在另一個實施方式中，IgG變體具有降低的FcRn親和力，以及增強的Fe y RIIb親和力，但對一種或多種激活Fe y Rs的親和力降低。在另一實施方式中，IgG變體具有延長的血清半衰期和降低的效應器功能。優選實施方案包括優化對人FcRn和Fe YR的結合，但是在可選擇的實施方案中，IgG變體對來自非人類生物體，包括但不限于嚙齒類動物和非人靈長目動物的FcRn和Fe Y R具有增強或降低的親和力。對非人類FcRn的結合被優化的IgG變體可以用于實驗中。例如可以獲得能測試給定藥物候選者的特性，例如功效、毒性和藥物動力學的多種疾病的小白鼠模型。可以通過稱為異種移植的方法將癌細胞移植或注入到小白鼠中以模仿人類癌癥，這一點本領域已經已知。對IgG變體的測試可以提供關于蛋白清除特性、它的清除機制 等有價值的信息，其中IgG變體包括對FcRn的結合被優化的IgG變體。也可以優化IgG變體以使其在非糖基化(aglycosylated)形式中具有增強的功能性和/或溶解特性。Fe配體包括，但不局限于FcRn、Fe y Rs> Clq和蛋白A和G,而且可以來自任何來源,包括但不限于人、小白鼠、大鼠、兔子或猴，優選人。在可選擇的優選實施方案中，可以優化IgG變體使其比親代IgG變體的非糖基化形式更穩定和/或更可溶。IgG變體可以包括調節與除FcRn和Fe Y Rs以外的Fe配體,包括但不限于補體蛋白和Fe受體同系物(FcRHs)的相互作用的修飾。FcRHs包括但不局限于FcRHl、FcRH2、FcRH3、FcRH4、FcRH5 和 FcRH6(Davis et al. , 2002, Immunol. Reviews 190:123-136，全部引入作為參考)。優先地，IgG變體的Fe配體特異性將決定它的治療應用。給定IgG變體用于治療目的將取決于靶抗原的表位或形式，以及待治療的疾病或適應癥。對大多數靶和適應癥來說，增強的FcRn結合可是更優選的，因為增強的FcRn結合可以導致血清半衰期延長。較長的血清半衰期允許治療時以較低的頻率和劑量給藥。為了使需要重復給藥的適應癥作出反應而施用該治療劑時，這種特性可是特別優選的。對一些靶和適應癥來說，當需要變體Fe具有增加的清除或降低的血清半衰期時，例如當Fe多肽用作顯象劑或放射治療劑時，降低的FcRn親和力可是特別優選的。可以使用包含提供了增強的FcRn親和力，增強的激活Fe y Rs親和力和/或降低的抑制性Fe y Rs親和力的IgG變體的IgG變體。對一些靶和適應癥來說，使用對不同激活Fe Y Rs提供了差異選擇性的IgG變體可是更有利的；例如有時可需要對Fe Y RIIa和Fe y RIIIa,而不是Fe y RI的結合增強，而在其它情況下，僅僅只有對Fe y RIIa的結合增強可是優選的。對某些靶和適應癥來說，利用改變了 FcRn結合和增強了 Fe Y R介導的效應器功能和補體介導的效應器功能的IgG變體可是優選的，但在其他情況下，利用FcRn結合增強或血清半衰期延長，以及Fe Y R介導的效應器功能或補體介導的效應器功能增強的IgG變體可是有利的。對一些靶或癌癥適應癥來說，降低或消除一種或多種效應器功能，例如通過敲除對Clq、一種或多種Fe y R、FcRn或一種或多種其他Fe配體的結合可是有利的。對其他靶或適應癥來說，利用對抑制性Fe y RIIb的結合增加，但對激活Fe y Rs的結合為WT水平，降低或消除的IgG變體可是優選的。例如，當IgG變體的目的是抑制炎癥或自身免疫病，或在某些方面調節免疫系統時，這種IgG變體可是特別有用的。因為自身免疫疾病通常持續時間久，而且需要重復給藥進行治療，用對FcRn的結合增加的具有延長的半衰期的Fe變體對他們進行治療是特別優選的。修飾可以改善IgG穩定性、可溶性、功能或臨床用途。在優選實施方案中，IgG變體可以包含減少在人體內的免疫原性的修飾。在最優選的實施方案中，利用完全引入作為參考的USSN 11/004，590描述的方法降低了 IgG變體的免疫原性。在可選擇的實施方案中，IgG變體是人源化的(Clark, 2000，Immunol Today 21:397-402，完全引入作為參考)。IgG變體可以包含降低免疫原性的修飾。降低免疫原性的修飾包括降低來源于親代序列的經過處理的肽對MHC蛋白的結合的修飾。例如可以設計氨基酸修飾使沒有或有最少數量的免疫表位，其中免疫表位預計會以高親和力結合任何普遍的MHC等位基因。鑒定蛋白序列中MHC結合表位的幾種方法本領域已經已知，而且可以用來對I gG變體中的表位進行評分。列如，參見 WO 98/52976 ；W0 02/079232 ;W0 00/3317 ；USSN 09/903, 378 ； USSN10/039, 170 ；USSN 60/222, 697 ；USSN 10/754, 296 ；PCT WO 01/21823 ；和 PCTWO02/00165 ；Mallios,1999, Bioinformatics 15:432-439 ；Mallios,2001, Bioinformatics17:942-948 ；Sturniolo et al. , 1999, Nature Biotech.17:555-561 ；W0 98/59244 ；W002/069232 ；W0 02/77187 !Marshall et al.，1995,J.Immunol. 154:5927-5933 和 Hammeret al.，1994，J. Exp. Med. 180:2353-2358，都全部引入作為參考。基于序列的信息可用于確定給定肽-MHC相互作用的結合得分(例如，參見Mallios, 1999, BioinformaticsI 5 : 432-439 ； Ma 11i o s, 2001，Bioinformatics 17 :p942_948 ； Sturn i oIoet. al.，1999，Nature Biotech. 17:555-561，都全部引入作為參考)。加工的IgG變體可以通過多種方式設計本發明的變體。本文所述變體可以是插入、缺失、替換、其他的修飾，或這些及其他改變的組合。本發明的特別新的實施方案是設計改善或降低Fe多肽對Fe配體的結合的插入和缺失。正象這里所公開的那樣，可以實施增加或降低Fe多肽對FcRn的親和力的插入或缺失。可以通過合理的方法，或者通過包括用途或隨機分量的方法，例如隨機或半隨機庫建立或篩選設計插入和缺失。在可選擇的實施方式中，公開了增加或降低Fe多肽對FcRn的親和力的替換。插入和缺失用變體氨基酸代替Fe多肽上某位點的親代氨基酸可以創造制備Fe多肽變體。通過將Fe多肽中的一個或多個氨基酸替換成變體氨基酸，可以改變那些位點的側鏈。大多數有用的替換通過改變Fe側鏈修飾Fe特性。替換的側鏈可以直接或間接地與Fe結合配偶體作用，其中Fe結合配偶體與Fe功能或特性相關。至少一個替換改變了親代Fe多肽的一個或多個側鏈的共價結構。或者，改變親代Fe多肽骨架的共價結構可以創造制備出Fe多肽變體。蛋白中的骨架原子有肽氮、a碳、羰基或肽碳和羰基氧。改變骨架的共價結構提供了附加的改變Fe多肽特性的方法。通過添加原子到骨架中，例如插入一個或多個氨基酸、或從骨架中除去原子，例如刪除一個或多個氨基酸可以改變Fe骨架的共價結構。通過將骨架的單個原子變為其他原子也可以改變骨架的共價結構(Deechongkit et al. , J Am ChemSoc. 2004. 126(51) :16762-71,全部引入作為參考)。通過插入或刪除編碼Fe多肽的DNA中的對應核苷酸，可以實施在Fe多肽中插入或缺失氨基酸，這一點本領域已經已知，在這里也進行了說明。或者，可以在合成Fe多肽期間實現氨基酸的插入或缺失，這一點本領域已經已知。通過考慮Fe多肽和它的結合配偶體的復合物的結構可以實現插入或缺失氨基酸的設計過程，其中插入或缺失氨基酸會改變Fe多肽與一種或多種結合配偶體(例如Fe y R's.FcRn,Clq)的相互作用。在優選程度較低的實施方案中，通過考慮Fe多肽的結構和參與與結合配偶體的結合的Fe區域的信息可以完成設計。通過誘變實驗、噬菌體展示實驗、同源性比較、計算機模型或其他方式可以獲得這些信息。氨基酸序列中影響Fe結合相互作用，但不影響Fe多肽的整體結構、穩定性、 表達或用途的插入或缺失優選位置位于參與Fc/Fc結合配偶體相互作用的環內。為了改變 Fe 多肽對 FcRn 的結合，位點 244-257、279-284、307-317、383-390 和 428-435是插入或缺失的優選環位置(編號來自EU index of Kabat et al. , Burmeister etal. , 1994, Nature, 372:379-383 ；Martin et al.,2001, Mol Cell7:867_877，全部引入作為參考)。為了改變Fe多肽對Fe y受體的結合，位點229-239、266-273、294-299和324-331是插入或缺失的優選環位置(編號來自EU index of Kabat et al. , PDB code 1E4K. pdbSondermann et al. Nature. 2000406:267,全部引入作為參考)。環是不涉及a螺旋或3片層結構的多肽區域。環位點是不在a螺旋或P片層中的位點(van Holde, Johnson andHo.Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998，Chapterlpp2-67，全部引入作為參考)。環位點是優選的，因為與a螺旋和P片層的骨架原子相t匕，該骨架原子通常更容易彎曲，而且參與氫鍵的可性更小。因此，插入或缺失一個或多個氨基酸導致環延長或縮短很少會導致Fe多肽發生大的破裂性變化，包括穩定性、表達或其他問題。插入和缺失可以用來改變多肽的長度。例如在環區域中，改變環的長度會導致環的屈曲性和構象熵發生改變。環中的插入通常會增加環的構象熵，構象熵被定義為乘以可構象數目的自然對數的波耳茲曼常數(Boltzman’s constant) (van Holde, Johnson andHo. Principles of Physical Biochemistry. Prentice Hall, New Jersey 1998，pp78,都全部引入作為參考)。將至少一個氨基酸插入到多肽中，可以使多肽可獲得的構象的總數增力口。這些附加的構象可對形成有利的Fc/Fc-結合配偶體相互作用有好處，因為Fe多肽在結合Fe-結合蛋白時可以利用附加構象中的一種。在這種情況下，插入可以產生更強的Fe/Fe結合配偶體相互作用。如果附加的構象沒有用于結合界面，那么插入可導致更弱的Fe/Fe結合配偶體相互作用，因為附加的構象將與有結合能力的構象競爭。同樣，多肽片段的缺失也可以產生更強或更弱的Fc/Fc結合配偶體相互作用。如果降低骨架構象可數目的片段缺失消除了有結合能力的構象，那么缺失可以產生更弱的Fc/Fc結合配偶體相互作用。如果缺失沒有消除有結合能力的構象，那么缺失可以產生更強的Fc/Fc結合配偶體相互作用，因為缺失可以除去與有結合能力的構象競爭的構象。插入和缺失可以用來改變Fe多肽中氨基酸的的位置與方向。因為插入和缺失導致骨架的共價結構發生變化，因此他們必然會引起骨架原子位點的變化。圖7比較了三個不同骨架中標記為L1-L4的一些環片段上的骨架位點。參考的骨架結構包含四個環節段，缺失骨架缺乏節段LI，插入節段在節段LI之前，即節段LI的N-末端包含附加的節段。缺失和插入會導致靠近插入或缺失位點的骨架結構發生最大的變化。刪除靠近環N-末端的節段，例如節段LI，環可以縮短，剩余的節段會改變他們靠近環N末端的位置。這會產生朝著LI節段在前位點和環N末端方向移動L2節段的影響。當初始信息表明位于L2的氨基酸位于LI時能與Fe結合配偶體產生有利的相互作用時，L2節段位點朝著LI節段方向的變化可以增強Fc/Fc結合配偶體復合物的結合，因此也是優選的。例如如果L2包含丙氨酸和酪氨酸，那么以前的兩個LI氨基酸替換成丙氨酸和酪氨酸將導致Fe變體結合增加，因此缺失LI可以產生對Fe結合配偶體的親和力增加的Fe變體。同樣，在環的N-末端側將多肽節段插入Fe多肽會導致環節段的位點朝著環C末端側的方向改變。圖7中，在節段LI之前，即節段LI的N末端插入一個或多個氨基酸會改變骨架構象，其中骨架構象包括LI節段朝著環C末端的方向改變。當已知位于節段LI的氨基酸位于L2位點時能產生有利的相互作用時，這類插入是優選的，因為插入可以產生更強的Fc/Fc結合配偶體相互作用。如果想要較弱的Fc/Fc結合配偶體相互作用，那么插入可以用來將不利的氨基酸移動到新位點。插入、刪除和參考節段(圖7中的LI到L4)可以 是Fe多肽中多于一個氨基酸的一個或多個節段。或者，可以以類似于環N-末端插入或缺失的方式，在環的C末端利用插入或缺失。環C末端的插入可以導致插入N-末端的位點朝著環N末端的方向運動。環C末端的缺失可以導致缺失的N-末端的位點朝著環C末端的方向運動。基于位于環中的氨基酸、想要增加或降低Fc/Fc-結合配偶體親和力的渴望和想要的位置改變，選擇利用環N-末端或C末端的插入或缺失。插入或缺失可以用于Fe多肽的任何區域，包括環、a螺旋和0片層區域。插入和缺失的優選位置包括不是a螺旋或P片層區域的環區域。環是優選的，因為他們通常比a螺旋或P片層能更好地接受骨架中的改變。產生更強蛋白/蛋白相互作用的特別優選的插入或缺失位置是環的N-末端或C末端邊緣。如果環的側鏈參與Fc/Fc結合配偶體相互作用，那么邊緣的插入或缺失很少會導致結合相互作用發生強烈的有害變化。環正中的缺失很可會除去Fc/Fc結合配偶體界面中重要的殘基，環正中的插入很可會在Fc/Fc結合配偶體界面產生不利的相互作用。通過骨架改變的容量可以確定刪除或插入的殘基數目，插入或缺失15個或更少殘基是優選的，插入或缺失10個或更少殘基是更優選的，插入或缺失5個或更少殘基是最優選的。一旦設計了 Fe缺失變體的位置和大小，就可以完全確定全部多肽序列，通過本領域已知的方法可以構建該多肽。但是，Fe插入變體具有設計至少一個被插入氨基酸的序列的附加步驟。在Fe多肽中預期將被暴露的位點插入極性殘基，包括Ser、Thr、Asn、Gin、Ala、Gly、His是優選的。較小的氨基酸，包括Ser、Thr和Ala是特別優選的，因為尺寸小很少會在空間上干擾Fc/Fc結合配偶體的相互作用。Ser和Thr也具有與Fe結合配偶體上的原子形成氫鍵的能力。插入物也可以具有增加的屈曲性，當希望Fc/Fc結合配偶體的結合更強時，插入的多肽被設計成與Fe結合配偶體產生有利相互作用的形式將是合乎需要的。通過構建變體骨架與一般簡單的待插入序列的模型可以確定骨架插入物的長度。例如可以構建不同長度的聚絲氨酸、聚甘氨酸或聚丙氨酸插入物，并將其模型化。通過多種方法，包括基于包含插入物的同系物的已知的三維結構進行的同源模型構建、包括都全部引入作為參考的 MODELLER (M. A. Marti-Renom et al. Annu. Rev. Biophys. Biomol.Struct. 29，291-325，2000)和 ROSETTA(Kuhlman et al. (2003) Science 302，1364-8)的計算機模型構建可以實施建模過程。通常，開始先產生各種骨架構象，然后在確定側鏈的同一性之后再確定最后的骨架結構。可以通過PDA 算法(US6，188,965 ;6，269，312 ;6，403，312 ;6，801，861 ;6，804，611 ;6，792，356，6，950，754 和 USSN 09/782，004 ；09/927，790 ；10/101, 499 ； 10/666, 307 ；10/666311 ;10/218，102，都全部引入作為參考)設計側鏈。可以通過本文所述方法設計除Fe多肽之外的任何多肽的插入和缺失。例如借助于APRIL三維結構的幫助可以在TNF超家族成員APRIL中設計插入或缺失(DB code 1XU1.pdb, Hymowitz, et al. (2005) J. Biol. Chem. 280:7218,全部引入作為參考)。可以設計插入或缺失以增加APRIL對它的受體TACI的結合。作為插入或缺失位點的優選的環殘基有殘基 Serll8-Vall24、Aspl64-Phel67、Prol92-Alal98、Pro221-Lys226。這些環與 APRIL/TACI復合物中的TACI相互作用并介導結合。 整合多肽的變體IgG變體可以基于人IgG序列，因此人IgG序列可以用作其他序列與之比較的〃基礎"序列，其他序列包括但不限于來自其他生物體的序列，例如嚙齒類動物和靈長目動物的序列。IgG變體也可以包含來自其他免疫球蛋白類，例如IgA、IgE、IgD、IgM等等的序列。注意到雖然是在一個親代IgG背景中加工設計IgG變體，但也可以在另外的第二親代IgG背景中設計變體，或者將變體〃轉移〃到另外的第二親代IgG背景中。通常，以IgGs序列之間的序列或結構同源性為基礎，通過確定第一和第二 IgG之間〃同等〃或〃對應〃的殘基和替換可以實現這一目的。可以直接將這里列出的第一 IgG的氨基酸序列與第二 IgG的序列相比較以確定同源性。在利用本領域已知的一個或多個同源性比對程序(例如，利用物種之間的保守殘基)比對序列之后，可以限定第一個IgG變體的一級序列中相當于特殊氨基酸的殘基，其中比對時為了維持配對考慮了必需的插入和缺失(即避免通過任意的缺失和插入消除保守殘基)。保守殘基的比對應該保全100%的這種殘基。但是，保守殘基大于75%或低至50%的配對也足以限定同等殘基。通過確定第一和第二 IgG結構上的同源性也可以限定同等殘基，其中結構同源性是結構已經確定的IgGs的三級結構水平的同源性。在這種情況下，同等殘基被定義為比對后，親代或前體的特殊氨基酸殘基的兩個或多個主鏈原子的原子坐標(N上的N、CA上的CA、C上的C和0上的0)在0. 13nm的區域之內，優選在0. Inm的區域之內的那些殘基。在已經定向和定位最好的模型蛋白使非氫蛋白原子的原子坐標出現最大重疊之后，可以實現比對。無論怎樣確定同等或對應的殘基，無論產生IgGs的親代IgG的同一性是多少，所要傳達的意思是發現的IgG變體可以加工成與IgG變體具有顯著的序列或結構同源性的任何第二親代IgG。因此，如果通過利用如上所述的方法或其他確定同等殘基的方法產生了其中親代抗體是人IgGl的變體抗體，那么可以在結合不同抗原的另一個IgGl親代抗體、人IgG2親代抗體、人IgA親代抗體、小白鼠IgG2a或IgG2b親代抗體等等中加工變體抗體。如上所述，親代IgG變體的背景不影響轉移IgG變體到其他親代IgGs的能力。提供了加工、生產和篩選IgG變體的方法。所描述的方法無意限制于任何具體應用或操作理論。相反，提供的方法通常是用于舉例說明可以用實驗方法加工、生產和篩選一個或多個IgG變體以獲得具有優化的效應器功能的IgG變體。在都全部引入作為參考的USSN 10/754，296和USSN 10/672, 280中描述了設計、生產和測試抗體和蛋白變體的多種方法。多種蛋白工程方法可以用來設計具有優化的效應器功能的IgG變體。在一個實施方案中，可以使用基于結構的加工操縱方法，在該方法中可得到的結構信息可用來指導替換、插入或缺失。在優選實施方案中，可以使用計算機操作的篩選法，其中以計算機操作計算的能量適應性為基礎設計替換。例如，參見USSN 10/754，296和USSN 10/672，280，以及其中引用的參考文獻，所有都全部引入作為參考。序列比對可以用來指導所鑒定位點的替換。本領域熟練技術人員應理解利用序列信息可以抑制引入潛在有害于蛋白結構的替換。序列的來源很廣泛，包括一個或多個已知的數據庫，包括但不限于Kabat數據庫(Northwestern University)； Johnson&ffu, 2001, Nucleic Acids Res.29:205-206 ；Johnson&ffu,2000, NucleicAcids Res. 28:214-218)，IMGT 數據庫(IMGT, the international ImMunoGeneTicsinformation system ; ;Lefranc et al. , 1999, Nucleic Acids Res. 27:209-212 ;Ruizet al. , 2000 Nucleic Acids Res. 28:219-221 ；Lefranc et al. , 2001, Nucleic AcidsRes. 29:207-209 ；Lefranc et al. , 2003, Nucleic Acids Res. 31:307-310)和 VBASE,所有都全部引入作為參考。可以從種系序列或來自任何生物體，包括但不限于哺乳動物的天然發生抗體的序列的序列比對獲得、編輯和/或產生抗體序列信息。本領域熟練技術人員應理解在施用給人時，利用人序列或基本上是人的序列更進一步地具有免疫原性更低的優勢。是更普遍的核酸或蛋白數據庫的其他數據庫，即不為抗體所特有的其他數據庫包括但不局限于SwissProt、GenBank Entrez和EMBL核苷酸序列數據庫。比對的序列可以包括VH、VL、CH和/或CL序列。本領域已經已知許多基于序列的比對程序和方法，所有這些程序和方法都可以用于進行序列比對。或者，隨機或半隨機誘變方法可以用來在想要的位點產生氨基酸修飾。這樣的話，可以隨機選擇位點，或者可以利用過分簡化的規則產生氨基酸改變。例如，可以將全部殘基突變為丙氨酸，這稱為丙氨酸掃描。這種方法可以與使用選擇法以篩選較高層次的序列多樣性的更復雜的加工設計方法聯合使用。多種選擇技術可以用于這種方法，例如包括顯示技術，例如如下所述的噬菌體展示、核糖體展示、細胞表面展示等等，這一點本領域已經公知。生產和篩選IgG變體的方法為大家所熟知。Duebel&Kontermann編輯的AntibodyEngineering,Springer-Verlag, Heidelberg, 2001 ；Hayhurst&Georgiou, 2001, Curr OpinChem Biol 5:683-689 ；Maynard&Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76 中描述了抗體分子生物學、表達、純化和篩選的一般方法。此外還參見都全部引入作為參考的USSN10/754，296 ；USSN10/672, 280 ；USSN 10/822，231 和 11/124，620 中描述的方法。本發明優選的變體包括圖8中的那些。或者，本發明優選的變體包括圖9中的那些。另外或者，本發明優選的變體包括圖10中的那些。本發明特別優選的變體包括G385H和 N434Y。本發明最優選的變體包括 257C、257M、257L、257N、257Y、279Q、279Y、308F 和 308Y。制備IgG變體
通過本領域已知的任何方法可以制備IgG變體。在一個實施方案中，IgG變體序列被用來產生編碼成員序列的核酸，而且如果想要的話可以將他們克隆到宿主細胞中，進行表達和測定。利用眾所周知的方法可以實施這些實際操作，都全部引入作為參考的 Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Maniatis, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York, 2001)和 Current Protocols in Molecular Biology (Johnffiley&Sons)中描述了多種有用的方法。編碼IgG變體的核酸可以整合到表達載體中以表達蛋白。表達載體通常包括操作性地與控制或調節序列、可選擇標記、任何融合配偶體和/或附加元件連接，即被放入功能關系中的蛋白。通過在誘導或引起蛋白表達的適當條件下培養用核酸，優選用包含編碼IgG變體的核酸的表達載體轉化的宿主細胞可以生產IgG變體。可以使用多種適當的宿主細胞，包括但不限于哺乳動物細胞、細菌、昆蟲細胞和酵母。例如從完全引入作為參考的美國典型培養菌種庫獲得的ATCC細胞系目錄中描述了多種可有用的細胞系。將外源性核酸插入宿主細胞中的方法在本領域為大家所熟知，而且該方法隨使用的宿主細胞而變化。在優選實施方案中，在表達后純化或分離IgG變體。可以用本領域熟練技術人 員所知的多種方式分離或純化抗體。標準提純法包括色譜技術、電泳、免疫、沉淀、透析、過濾、濃縮和色譜聚焦技術。本領域已知多種天然蛋白與抗體結合，例如細菌蛋白A、G和L，因此這些蛋白可用于純化。通過具體融合配偶體常常能實現純化。例如如果使用了GST融合物，就可以利用谷胱甘肽樹脂純化蛋白，如果使用了 His標簽，就可以使用Ni+2親和色譜法，如果使用了 flag標簽，就可以使用固定的抗flag抗體。適當的純化技術的總指導參見引入作為參考的 Antibody Purification:Principles and Practice, 3rdEd.，Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994。篩詵IgG變體可以利用多種方法，包括但不限于那些使用體外測定、體內和基于細胞的測定和選擇技術的方法篩選IgG變體。可以在篩選程序中使用自動化高通量篩選技術。可以通過利用融合配偶體或標記，例如免疫標記、同位素標記或小分子標記，例如熒光或比色染料進行篩選。在優選實施方案中，體外測定篩選IgG變體的功能性和/或生物物理學特性。在優選實施方案中，篩選蛋白的功能性，例如催化反應的能力或對它的靶的結合親和力。利用本領域已知的多種方法，包括但不限于基于FRET(熒光共振能量轉移)和BRET(生物發光共振能量轉移)的測定、AlphaScreen (擴增發光光均質鄰近測定)、閃爍鄰近分析法、ELISA (酶聯免疫吸附測定)、SPR(表面質子共振，又名BiACORE )、等溫滴定量熱術、差示掃描量熱法、凝膠電泳和包括凝膠過濾的色譜法可以進行結合測定。這些及其他方法可以利用一些融合配偶體或標記。測定可以使用包括但不限于產色、熒光、發光或同位素標記的多種檢測方法。利用本領域已知的多種方法，可以篩選蛋白的生物物理學特性，例如穩定性和可溶性。通過測量折疊和展開狀態之間的熱力學平衡可以確定蛋白的穩定性。例如利用化學變性劑、加熱或PH可以展開IgG變體，利用包括但不限于圓二色譜學、熒光光譜學、吸光光譜學、NMR光譜學、量熱法和蛋白水解的方法可以監測這一轉換。本領域熟練技術人員應理解，利用這些及其他技術也可以監測折疊和展開轉換的動力參數。利用本領域已知的各式各樣的方法可以定量或定性地確定IgG變體的可溶性和總的結構完整性。可用于表征IgG變體生物物理學特性的方法包括凝膠電泳、色譜法，例如分子排阻色譜和反相高效液相色譜法、質譜分析法、紫外光吸收光譜法、熒光光譜學、圓二色譜學、等溫滴定量熱法、差示掃描量熱法、分析超速離心、動態光散射、蛋白水解，交聯、濁度測定、過濾阻滯測定、免疫測定、熒光染料結合測定、蛋白染色測定、顯微鏡檢查，檢測ELISA聚集物或其他結合測定。也可以使用利用X射線結晶技術和NMR光譜學的結構分析。本領域已知，一類篩選法包括選擇庫中有利成員的方法。在這里該方法被稱為〃選擇方法"，這些方法可以用于篩選IgG變體。當利用選擇方法篩選蛋白庫時，只有那些有利的庫成員，也就是滿足一些選擇標準的成員會被繁殖，分離和/或觀察。應理解因為只有最合適的變體被觀察到，因此這種方法能篩選的庫比逐一測定庫成員擬合的方法能篩選的庫大。通過任何方法、技術、共價或非共價連接蛋白表型和它的基因型，即共價或非共價連接蛋白功能和編碼它的核酸的融合配偶體可以進行選擇。例如，將庫成員融合到基因III蛋白中使大家能利用噬菌體展示作為選擇方法。因此，選擇或分離滿足一些標準的IgG變體，例如對蛋白靶具有結合親和力的IgG變體也是選擇或分離編碼它的核酸。一旦分離出來，就可以擴增編碼Fe變體的基因。可以重復允許富集庫中有利的IgG變體的被稱為淘洗的分離和擴增過程。附著核酸的核酸測序最終考慮了基因鑒定。本領域已知的多種選擇方法可以用于篩選蛋白庫。這些包括但不限于噬菌體展不(Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay etal.,1996，Academic Press, San Diego, CA, 1996 ；Lowman et al.,1991，Biochemistry30:10832-10838 ；Smith, 1985，Science 228:1315-1317)和其衍生方法，例如選擇性噬菌體感染(Malmborg et al.，1997，J Mol Biol 273:544-551)，選擇感染性嗷菌體(Krebber etal.，1997，J Mol Biol 268:619-630)，和延遲的感染性淘洗(Benhar et al.，2000，J MolBiol 301:893-904)，細胞表面展示(Witrrup，2001，Curr Opin Biotechnol，12:395-399)，例如細菌(Georgiou et al.，1997，Nat Biotechnol 15:29-34 ；Georgiou etal.， 1993，Trends Biotechnol 11:6-10 ;Lee et al.，2000，Nat Biotechnol 18:645-648;Jun et al.， 1998，Nat Biotechnol 16:576-80)，酵母(Boder&Wittrup，2000，MethodsEnzymol 328:430-44 ；Boder&Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557)和哺乳動物細胞(Whitehorn et al.，1995，Bio/technology 13:1215-1219)上的展不，以及體外展不技術(Amstutz et al.，2001，Curr Opin Biotechnol 12:400-405)，例如多核糖體展不(Mattheakis et al.，1994，Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026)，核糖體展不(Hanes et al.，1997，Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942)，mRNA 展7j\ (Roberts&Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302 ;Nemoto etal.，1997，FEBS Lett414:405-408)和核糖體失活展示系統(Zhou et al.，2002，J Am ChemSoc 124,538-543)。這段中的所有參考文獻都全部引入作為參考。其他有用的選擇方法包括，不依賴展示的方法，例如體內方法，包括但不限于胞質表達和細胞計數篩選(Chen et al.，2001，Nat Biotechnoll9:537_542，全部引入作為參考)、蛋白片段互補測定(Johnsson&Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA91:10340-10344 ；Pelletier et al.，1998，Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146，全部引入作為參考)，用于選擇方式(Visintin et al.，1999，Proc Natl Acad Sci USA96:11723-11728，全部引入作為參考)的酵母雙雜交篩選(Fields&Song, 1989, Nature、340:245-246，全部引入作為參考)。在可選擇的實施方式中，能通過結合表達載體上的特異序列的融合配偶體進行選擇，因此融合配偶體能共價或非共價地連接聯合的Fe變體庫成員和編碼他們的核酸。例如都全部引入作為參考的USSN 09/642，574 ；USSN10/080, 376 ；USSN 09/792, 630 ；USSN 10/023,208 ；USSN 09/792, 626 ；USSN10/082, 671 ；USSN09/953, 351 ；USSN 10/097, 100 ；USSN 60/366, 658 ；PCT W000/22906 ；PCT WO 01/49058 ；PCT WO 02/04852 ；PCT WO 02/04853 ；PCTffO 02/08023 ；PCT WO 01/28702 和 PCT WO02/07466描述了可以使用的這種融合配偶體和技術。在可選擇的實施方案中，如果蛋白的表達賦予細胞一些生長、繁殖或存活優點，那么就可以進行體內選擇。稱為〃定向進化〃方法的一類選擇方法是那些在選擇期間包括交配或再生有利序列，有時整合新突變的方法。本領域熟練技術人員應理解定向進化方法可以促進對庫中最有利序列的鑒定，而且可以增加篩選序列的多樣性。多種定向進化方法在本領 域是已知的，他們可用于篩選IgG變體，包括但不限于DNA重排(PCT WO 00/42561A3 ；PCT WO 01/70947A3),外顯子改組(US 6，365，377 ;Kolkman&Stemmer，2001，NatBiotechnol 19:423-428),家族重排(Crameri et al. , 1998, Nature 391:288-291 ；US 6,376, 246), RACHITT (Coco et al.,2001, Nat Biotechnol 19:354-359 ;PCTWO 02/06469), STEP 合體外重組隨機引物法(Zhao et al.，1998，Nat Biotechnol16:258-261 ；Shao et al.，1998，Nucleic Acids Res 26:681-683)，外切核酸酶介導的基因組合(US6, 352，842 ;US 6，361，974)，Gene Site Saturation Mutagenesis (US6,358,709), Gene Reassembly (US 6,358,709), SCRATCHY(Lutz et al. , 2001, Proc NatlAcad Sci USA 98:11248-11253)，DNA 斷裂方法(Kikuchi et al.，Gene236:159-167)，單鏈 DNA 重排(Kikuchi et al. , 2000, Gene 243:133-137)和 AMEsystem 定向進化蛋白工程技術(Applied Molecular Evolution) (US5, 824，514 ；US 5，817，483 ；US 5，814，476 ；US5，763，192 ；US 5，723，323)。這段中的所有參考文獻都全部引入作為參考。在優選實施方案中，利用一種或多種基于細胞的測定或體內測定篩選IgG變體。進行這種測定時，通常需要外源添加純化或未純化的蛋白，以使細胞暴露于獨立的變體或屬于庫的變體庫。這些測定通常是，但不總是以IgG功能為基礎，IgG功能也就是IgG結合它的靶和介導一些生物化學事件的的能力，例如效應器功能、配體/受體結合抑制、凋亡等等。這種測定經常涉及監測細胞對IgG的反應，例如細胞存活率、細胞死亡、細胞形態學方面的變化或翻譯激活，例如天然基因或報告基因的細胞表達。例如這種測定可以測量IgG變體引發ADCC、ADCP或CDC的能力。在一些測定中，除靶細胞之外，可需要添加另外的細胞或組分，例如血清補體或效應細胞，例如外周血單核細胞(PBMCs)、NK細胞、巨噬細胞等等。這種另外的細胞可以來自任何生物體，優選來自人、小白鼠、大鼠、兔子和猴。抗體可以引起某些表達靶的細胞系凋亡，或者他們可以介導已經添加到測定中的免疫細胞攻擊靶細胞。監測細胞死亡或成活力的方法在本領域是已知的，包括利用染料、免疫化學試劑、細胞化學試劑和放射性試劑。例如半胱天冬酶染色測定能測量凋亡，而且放射性底物或熒光染料，例如alamar藍的吸收或釋放能使細胞生長或激活被監測。在優選實施方案中，使用了基于細胞毒性測定的DELF丨A EuTDA (Perkin Elmer, MA)。或者，通過測量一種或多種天然胞內蛋白，例如乳酸脫氫酶的釋放可以監測死亡或損害的靶細胞。轉錄激活也可以作為在基于細胞的測定中測定功能的方法。在這種情況下，通過測定可被上調的天然基因或蛋白，例如測量某些白細胞間介素的釋放，或者由報告構建物獲取讀數可以監測反應。基于細胞的測定也可以涉及測量細胞的形態變化作為對蛋白存在的反應。這種測定的細胞類型可以是原核或真核細胞，可以使用本領域已知的多種細胞系。或者，可利用已經用編碼變體的核酸轉化或轉染的細胞實施基于細胞的篩選。也就是說，沒有外源添加IgG變體到細胞中。例如在一個實施方案中，基于細胞的篩選使用了細胞表面展示。可以使用能在細胞表面上顯不 IgG變體的融合配偶體(Witrrup, 2001，Curr Opin Biotechnol, 12:395-399,完全引入作為參考)。在優選實施方案中，利用一種或多種基于細胞的測定實驗確定IgG變體的免疫原性。幾種方法可以用于表位的試驗性確認。在優選實施方案中，利用體外T細胞激活測定以實驗性定量免疫原性。在該方法中，用目標肽或完整蛋白攻擊抗原呈遞細胞和來自匹配供體的天然T細胞一次或多次。然后，利用許多方法，例如監測細胞因子的生產或測量氚化胸腺嘧啶的吸收可以檢測T細胞激活。在最優選的實施方案中，利用Elispot測定監測干擾素 Y 的生產(Schmittel et. al.，2000，J. Immunol. Meth. 24:17-24，全部引入作為參考)。
可以在細胞、組織和完整生物體實驗中表征IgG變體的生物學特性。為了測量藥物治療疾病或疾病模型的功效、或測量藥物的藥物動力學、毒性及其他特性，經常在包括但不限于小白鼠、大鼠、兔子、狗、貓、豬和猴的動物中測試藥物，這一點本領域已經已知。動物可以被稱為疾病模型。經常在包括但不限于裸鼠、SCID小白鼠、異種移植小白鼠和轉基因小白鼠(包括敲入和敲除)的小白鼠中測試治療劑。這種實驗可以提供有價值的數據以確定蛋白被用作治療劑的潛力。任何生物體，優選哺乳動物可以被用來進行測試。例如，因為猴與人的遺傳相似性，因此猴可以作為適當的治療模型，用來測試IgGs的功效、毒性、藥物動力學或其他特性。批準作為藥物最終需要在人體內進行測試，因此毫無疑問已經打算進行這些實驗。因此，可以在人體內測試IgGs以確定他們的治療功效、毒性、免疫原性、藥物動力學和/或其他臨床特性。IgG變體的使用方法IgG變體可以用于范圍廣泛的產物中。在一個實施方案中，IgG變體是治療試劑、診斷試劑或研究試劑，優選是治療試劑。IgG變體可用于是單克隆或多克隆的抗體組合物中。在優選實施方案中，IgG變體可以用來殺死負載靶抗原的靶細胞，例如癌細胞。在可選擇的實施方案中，IgG變體被用來阻斷、對抗或干擾靶抗原，例如對抗細胞因子或細胞因子受體。在可選擇的優選實施方案中，IgG變體被用來阻斷、對抗或干擾靶抗原，并殺死負載靶抗原的靶細胞。IgG變體可以用于多種治療目的。在優選實施方案中，可以給病人施用包含IgG變體的抗體以治療與抗體相關的紊亂。適合于該目的的"病人"包括人及其他動物，優選哺乳動物，最優選人。在這里〃抗體相關紊亂〃或〃抗體應答紊亂〃或〃狀況〃或〃疾病〃指通過施用包含IgG變體的藥物組合物能改善的紊亂。抗體相關紊亂包括，但不限于自身免疫疾病、免疫疾病、感染性疾病、炎性疾病、神經學上的疾病，以及腫瘤和新生物疾病，包括癌癥。在這里〃癌癥〃和〃癌〃指或描述的是哺乳動物中通常以無限制的細胞生長/增殖為特征的生理狀態。癌癥的實例包括，但不局限于癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤(包括脂肪肉瘤)、神經內分泌腫瘤、間皮瘤、雪旺氏瘤(schwanoma)、腦膜瘤、腺癌、黑素瘤，以及白血病和淋巴系統的惡性腫瘤。
在一個實施方案中，IgG變體是施用給人的唯一治療活性劑。或者，可以與一種或多種其他治療劑，包括但不限于細胞毒活性制劑、化療劑、細胞因子、生長抑制制劑、抗激素制劑、激酶抑制劑、抗血管生成制劑、心臟保護劑或其他治療劑結合施用IgG變體。施用IgG變體時，可以伴隨施用一種或多種其他治療方式。例如可以將IgG變體與化療、放療、或者放化療一起施用給病人。在一個實施方案中，可以和是或不是IgG變體的一種或多種抗體一起施用IgG變體。依照另一個實施方案，可以使用IgG變體和一種或多種其他抗癌治療在體外治療癌細胞。預計這種體外治療可對骨髓移植有用，對自體骨髓移植可特別有用。當然，應考慮到這種IgG變體仍然可以與其他治療技術，例如手術組合使用。多種其他治療劑可以用于和IgG變體一起施用。在一個實施方案中，與抗血管生成劑一起施用IgG。在這里使用的〃抗血管生成劑〃指阻斷或一定程度上干擾血管發生的化合物。抗血管生成因子可以是，例如結合涉及促進血管發生的生長因子或生長因子受體的小分子或蛋白，例如抗體、Fe融合物或細胞因子。這里優選的抗血管生成因子是結合血管內皮細胞生長因子(VEGF)的抗體。在可選擇的實施方案中，與誘導或增強適當免疫反應的治療劑，例如靶向CTLA-4的抗體一起施用IgG。在可選擇的實施方案中，與酪氨酸激酶抑 制劑一起施用IgG。這里使用的"酪氨酸激酶抑制劑"指在一定稈度上抑制酪氨酸激酶的酪氨酸激酶活性的分子。在可選擇的實施方案中，與細胞因子一起施用IgG變體。其中配制了 IgG變體和一種或多種治療活性劑的藥物組合物也在考慮之中。通過將具有想要純度的IgG與任意的藥學可接受載體、賦形劑或穩定劑混合(Remington’sPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.，1980,全部引入作為參考)，可以制備凍干劑型或水溶液形式的用于儲藏的IgG變體制劑。用于體內給藥的制劑優選是無菌的。通過過濾通過過濾除菌膜或其他方法很容易實現這一目的。也可以以免疫脂質體形式配制這里公開的IgG變體及其他治療活性劑，和/或將他們俘獲在微膠囊中。制劑中治療活性IgG變體的濃度按重量計在大約0. 1-100%之間變化。在優選實施方案中，IgG濃度在0. 003-1. 0摩爾的范圍之內。為了治療病人，可以施用治療有效量的IgG變體。這里的"治療有效暈"指施用時產生效果的劑量。準確劑量取決于治療目的，本領域普通技術人員利用已知技術可確定準確劑量。劑量可以在從0. 01-100mg/kg體重或更大的范圍中變化，例如為0.01、0. 1、1.0、10或50mg/kg體重，其中l-10mg/kg是優選的。本領域已經已知調節蛋白降解，與局部遞送相比較的系統遞送、新蛋白酶合成的速度，以及年齡、體重、大體健康、性別、飲食、給藥時間、藥物相互作用和狀況的嚴重可是必需的，本領域熟練技術人員通過常規實驗可確定這一點。包含IgG變體的藥物組合物，優選無菌水溶液形式的藥物組合物的給藥可以通過多種途徑進行，包括但不限于口服、皮下、靜脈內、胃腸外、耳內(intraotically)、眼內、直腸、陰道、經皮、局部(例如凝膠劑、油膏劑、洗劑、乳膏等等。)、腹膜內、肌內、肺內(例如從Aradigm可買到的AERx吸入技術或從Nektar Therapeutics可買到的Inhance肺遞送系統)等等。可以與其他治療伴隨施用本文所述治療劑，即本文所述治療劑可以與其他治療或治療劑，包括例如小分子、其他生物制劑、放療、手術等等一起施用。實施例以下實施例舉例說明本發明。這些實施例無意將本發明限制于任何特殊應用或操作理論。本發明所述所有位點都依照Kabat中的EU指數進行編號(Kabat etal.，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. , United StatesPublic Health Service, National Institutes of Health，Bethesda，全部引入作為參考)。抗體領域的熟練技術人員應理解，這一規定由免疫球蛋白序列具體區域的非順序編號組成，因此能參照免疫球蛋白家族中的保守位點進行標準化。因此，EU指數所指任何給定免疫球蛋白的位點不一定對應于它的有序序列。實施例I :Fc奪體的DNA構律、表汰和鈍化利用人IgGl Fe域和曲妥單抗(Hercepti丨I ，Genentech)的可變域構建Fe變體。Fe多肽是阿侖單抗、曲妥單抗或AClO的一部分。阿侖單抗(Campath ，Millenium的注冊商標)是目前批準用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病的人源化單克隆抗體(Hale etal. , 1990, Tissue Antigens 35:118-127，全部引入作為參考)。曲妥單抗(Herceptin ，Genentech的注冊商標)是治療轉移性乳腺癌的抗HER2/neu抗體。AClO是抗CD30單克隆抗體。Herc印tin可變區利用回歸PCR來組裝。然后將該可變區與人IgGl—起克隆到pcDNA3. 1/Zeo (+)載體(Invitrogen)中，見圖 11。質粒在 One Shot TOP 10 大腸桿菌細胞(Invitrogen)中繁殖，并利用 Hi-Speed Plasmid Maxi Kit (Qiagen)純化。質粒經測序證 實存在克隆的插入物。定點誘變利用Quikchange 方法(Stratagene)進行。包含所需替換、插入和缺失的質粒在One Shot T0P10大腸桿菌細胞(Invitrogen)中繁殖，并利用Hi-Speed PlasmidMaxi Kit (Qiagen)純化。DNA測序證實序列的保真度。將含重鏈基因(VH-Cy I-C Y 2-C Y 3)(野生型或變體)的質粒與含輕鏈基因(VL-Ck)的質粒共轉染到293T細胞中。轉染5天后，收獲培養基，利用蛋白A親和色譜法(Pierce)從上清液中純化抗體。通過雙金雞寧酸(bicinchoninic acid) (BCA)測定(Pierce)確定抗體濃度。實施例2 :結合親和力測量用表面質子共振測量測定Fe多肽對Fe配體的結合。利用BIAcore 3000儀器(BIAcore AB)實施表面質子共振(SPR)測量。利用固相蛋白L(PierceBiotechnology, Rockford, IL)捕獲野生型或變體抗體，并測量對受體分析物的結合。在CM5傳感器芯片上利用5ul/min流速的N-羥基琥珀酰亞胺/N-乙基-N’ - (-3- 二甲氨基-丙基)碳化二亞胺(NHS/EDC)，將存在于pH 4. 5的IOmM醋酸鈉中的濃度為IuM的蛋白L共價連接到CM5傳感器芯片上。用NHS/EDC模擬(mock)每個傳感器芯片的流動細胞I作為結合的陰性對照。所用緩沖液是 0. OlM HEPES pH 7. 4、0. 15M NaCl、3mM EDTA、0. 005%v/v 表面活性劑P20 (HBS-EP, Biacore, Uppsala, Sweden),芯片再生緩沖液是IOmM甘氨酸-HCl pHI. 5。將125nM野生型或變體曲妥單抗以流速lul/min與HBS-EP中的蛋白L CM5芯片結合5分鐘。注入在I和250nM之間連續稀釋的FcRn-His-GST分析物(FcRn與His標簽和谷胱甘肽S轉移酶融合)，在HBS-EP中結合20分鐘，解離10分鐘，流速10ul/min。在注射受體之后的1200秒，獲取按共振單位(RU)計量的反映近穩態結合的反應。用抗體和緩沖液進行的循環僅提供基線反應。產生RU對1/log濃度的曲線圖，并利用GraphPad Prism進行非線性回歸，將其調整為S形曲線劑量反應。Fe多肽對Fe配體的結合也利用AlphaScreen (擴增發光鄰近均質測定，Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay)石角定。AlphaScreen 是基于珠的非放射發光鄰近測定。供體珠激發出激光，從而激發氧，當氧離受體珠足夠近時，產生一連串化學發光事件，最終導致在520-620nm發射熒光。AlphaScreen 的主要優點在于它的敏感性。因為一個供體珠每秒發射多達60，000個激發態氧分子，信號放大程度非常高，其允許檢測低至阿托摩爾(attomolar，10_18)的水平。野生型抗體通過標準方法生物素化，以附著鏈親和素供體珠，標記的Fe配體(例如FcRn)與螯合谷胱甘肽的受體珠連接。用AlphaScreen 作為直接結合測定,其中Fc/Fc配體的相互作用將供體和受體珠帶到一起。另外，用AlphaScreen 作為競爭測定，來篩選所設計的Fe多肽。缺乏競爭型Fe多肽時，野生型抗體與FcRn相互作用，在520-620nm產生信號。未標記的Fe域競爭野生型Fc/FcRn相互作用，使熒光大大減弱，從而能確定相對結合親和力。實施例3 Fc奪體的FcRn結合特件IgGl Fe對FcRn的結合親和力用變體抗體和AlphaScreen 測量。Fe多肽是阿侖單抗、曲妥單抗的一部分。阿侖單抗(Canipath ，ilex)是目前批準用于治療B細胞慢性淋巴細胞性白血病的人源化單克隆抗體(Hale et al. , 1990, Tissue Antigens 35:118-127, 全部引入作為參考)。曲妥單抗(Herceptin ，Genentech)是治療轉移性乳腺癌的抗HER2/neu抗體。收集競爭性AlphaScreen 數據以測量pH6. 0時，Fe變體與野生型抗體相比的相對結合。AlphaScreen 信號相對于競爭型抗體的函數的實例見圖12。圖中顯示12個變體曲線，其中 P257L、P257N、V279E、V279Q、V279Y、~281S、E283F、V284E、L306Y T307V、V308F和Q311V的曲線表現出增加的親和力，每一變體曲線在其框中移到野生型曲線左側。本發明Fe變體的競爭AphaScreen 數據概括在圖13和14中。變體與野生型相比的相對FcRn結合已列表。值大于I表明，與野生型相比，Fe變體對FcRn的結合增強。例如變體E283L和V284E的結合分別比野生型的強9. 5倍和26倍。多咯變體經表面質子共振測量也顯示對FcRn的結合增加，見圖15和16。在位點257，除去亞氨基酸、脯氨酸以及將不帶骨架N的氨基酸替換成側鏈共價鍵所得的所有變體都使骨架屈曲性更強，這樣可以允許Fe域更自由以便更好地結合FcRn。特別地，位點257變成L和N后得到的變體在pH 6時具有強烈的FcRn結合，這表明四原子側鏈和該側鏈的Y分支形式可以幫助Fe域產生有價值的，即強烈的FcRn相互作用。位點308與位點257相互作用。這兩個位點依次與直接參與Fc/FcRn相互作用的H310相互作用(表 2，Burmeister et al (1994)Nature 372:379-383，全部引入作為參考)。相對于野生型，Fe變體V308F和V08Y的FcRn親和力增加2. 9倍和4. 3倍。位點279和385與FcRn相互作用，因為變體V279E、V279Q和V279Y和G385H和G385N全都具有更強的FcRn相互作用。這些變體都替換成了能進行氫鍵連接的氨基酸。Fe變體N434Y在pH 6. 0時對FcRn的結合特別強，見圖13。單個變體N434Y的結合增加16倍。該變體與其他修飾聯合導致更強的結合。例如P257L/N434Y、'281S/N434Y和V308F/N434Y的FcRn結合增加830倍、180倍和350倍。實施例4 :整合插入和缺失的變體構建改變Fc/FcRn相互作用強度的插入和缺失，并測量它們對各種Fe配體的結合特性。設計一種Fe變體，其在殘基281和282 (按Kabat等的EU編號)之間插入Ser殘基，以增加Fe域的FcRn結合特性。該變體稱~281S，〃~"表示指定位點后的插入。在位點編號后給出插入序列，其可以超過一個殘基。利用本文所述方法，在K IgGl抗體曲妥單抗(H Herceptin , Genetech)中構建該Fe變體。在殘基281和282之間進行插入，使殘基281C末端的Fe環殘基移向該環C末端，并改變了該側鏈的位置。一些Fe變體在位點282、283和284包含替換，它們表明該環C末端的移位是有益的(參見圖14)。另構建了一個N286缺失變體(也稱N286#)，以改變該FcRn結合環的位置。在pH 6.0時，這兩個變體對FcRn的結合親和力都顯示出增加。A lphaScreen 數據顯示了 ~281S變體及其他變體對FcRn的結合。收集AlphaScreen 數據作為直接的結合測定。較高水平的化學發光信號表明更強的結合。因為測定中變體的濃度提高了，因此產生了更強的信號。圖17a和17b中pH 6.0時的這些數據表明，相對于野生型Fe，~2815、？2571、？25717~2815(替換/插入組合變體)及其他變體的 親和力增加。另有一種雙重替換T250Q/M428L，以前的報道稱，其在猴體內具有延長的血清半衰期(Hinton et al.，2004，J. Biol. Chem. 279(8) :6213_6216，全文引入作為參考)。單獨的~281S插入增加了 Fc/FcRn結合。另外，如 40nM的數據點所示，當在變體P257L/~281S中組合兩個修飾時，~281S更進一步地增強了 P257L的結合。圖17c中的數據表明，這些變體在pH 7. 0時未顯示FcRn結合增加。pH 7. 0時降低的親和力是延長體內半衰期所希望的，因為它允許Fe多肽從FcRn釋放到細胞外間隙中，這是Fe再循環中的重要步驟。表面質子共振實驗也表明，~281S對FcRn的結合被改進。圖18顯示了各種Fe變體與芯片表面FcRn結合時產生的響應單位。在變體完全結合到芯片上后，記錄響應單位并將其顯示在縱坐標上。~281S插入顯示出與本文所述其他變體相當的結合特性，即相比于野生型，對FcRn的親和力增加(例如參見圖13、14和15)。缺失變體N286#包含N286的缺失，其相對于野生型，也顯示出增加的FcRn親和力。如圖13所示，該變體的FcRn親和力增加2. 0倍。其中的數據也是pH 6. 0時從作為競爭實驗的A lphaScreen 收集的數據。用這些變體抑制連接供體珠的野生型Fe與連接受體珠的FcRn的結合。通過Fc/FcRn復合物抑制供體/受體珠的結合需要比游離野生型Fe少兩倍的游離N286#。這表明N286#比野生型的結合強2倍。包含插入或缺失的其他Fe變體對FcRn親和力的降低。插入變體~254N對FcRn的結合大大降低，這可從該變體的性質和定位預期到。該變體在FcRn結合環的中間位置插入Asn。該插入物僅有野生型的結合親和力的I. 1%(圖13)。本發明如上所述的具體實施例是為了進行解釋說明，本領域熟練技術人員應理解不脫離附加要求所描述的本發明可以對細節實施數目眾多的變異。所有這里引用的參考文獻都全部引入作為參考。
權利要求
1.包含人IgGFe多肽Fe變體的多肽，其中所述Fe變體包含在位置434的絲氨酸，并且其中參照Kabat等的EU指數進行編號。
2.權利要求I所述的多肽，其中包含Fe變體的所述多肽具有對于選自下組的靶分子的特異性細胞因子，可溶性蛋白因子和癌細胞上表達的蛋白質。
3.權利要求1-2任一項所述的包含Fe變體的多肽，其中所述多肽是抗體。
4.權利要求3所述的抗體，其中所述抗體選自嵌合抗體、人源化抗體、或人抗體。
5.權利要求1-4任一項所述的包含Fe變體的多肽，其中所述多肽是Fe融合物。
6.制備權利要求1-5任一項所述的包含Fe變體的多肽之方法，所述方法包括提供包含編碼所述多肽的核酸之細胞，其中所述細胞在適合所述多肽表達的條件下培養。
7.權利要求6的方法,其中所述核酸包含在表達載體中。
8.宿主細胞,包含編碼權利要求1-5任一項所述的包含Fe變體的多肽之核酸。
9.表達載體,其中所述表達載體編碼權利要求1-5任一項所述的包含Fe變體的多肽。
全文摘要
本申請涉及優化的IgG免疫球蛋白變體，產生他們的加工方法以及他們的應用，特別是用于治療目的。本申請涉及對FcRn的結合被改變的Fc變體。
文檔編號C12P21/02GK102746404SQ20121018165
公開日2012年10月24日 申請日期2005年11月14日 優先權日2004年11月12日
發明者格雷戈里.A.拉扎爾, 約斯特.維爾梅特, 約翰.R.德斯賈萊斯, 肖恩.C.約德, 謝爾.B.卡基, 阿倫.K.張伯倫 申請人:贊科股份有限公司