專利名稱：可用于尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)基因的黃嘌呤氧化酶-dna復(fù)合物及其制備方法和在檢測(cè)中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種可用于DNA檢測(cè)的復(fù)合物及其制備方法和在DNA檢測(cè)中的具體應(yīng)用。
背景技術(shù)：
發(fā)展一種便攜式傳感器，用于快速、低成本并且能夠在住所或事發(fā)地實(shí)時(shí)定量地檢測(cè)目標(biāo)物(例如離子、小分子、DNA、蛋白質(zhì)、病毒等)，是人們長(zhǎng)期以來的夢(mèng)想。此類產(chǎn)品的開發(fā)對(duì)于科學(xué)研究、環(huán)境監(jiān)測(cè)、疾病的診斷均具有重要意義。近年來，便攜式檢測(cè)儀器的研究取得了重大進(jìn)展，尿酸儀和血糖儀等便攜式檢測(cè)儀器已經(jīng)商業(yè)化，基本滿足了大眾對(duì)于某些疾病，在個(gè)人疾病診斷和預(yù)防方面的需求，改善了數(shù)以萬(wàn)計(jì)疾病患者的生活。血糖儀和尿酸儀的巨大成功，正體現(xiàn)了人們對(duì)于發(fā)展便攜式傳感器的迫切需求。 尿酸為嘌呤代謝的終產(chǎn)物，各種嘌呤氧化后生成的尿酸隨尿排出，因溶解度較小，體內(nèi)含量過多時(shí)會(huì)形成尿路結(jié)石或痛風(fēng)，另外白血病、腎病、多發(fā)性骨髓瘤、惡性腫瘤、真性紅細(xì)胞增多癥等都會(huì)在臨床上反應(yīng)出尿酸含量升高。因此，對(duì)體內(nèi)尿酸含量的靈敏檢測(cè)具有重要的意義(成人體內(nèi)尿酸的正常含量范圍90 420 μ M)，尿酸儀就是應(yīng)這一需求而發(fā)展起來的一種家庭便攜式檢測(cè)儀器。然而，現(xiàn)有的尿酸儀作為一種便攜式的尿酸檢測(cè)儀器，目前僅用于血液中尿酸的檢測(cè)。另一方面，DNA的檢測(cè)方法也開始越來越多地受到人們的重視和關(guān)注，在生物學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。作為被廣泛使用的檢測(cè)DNA的方法，有PCR (聚合酶鏈反應(yīng))和DNA探針法，這兩種方法雖然都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的靈敏檢測(cè)，但是都需要昂貴的專業(yè)儀器設(shè)備，且必須在專業(yè)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。如果能夠開發(fā)一種利用常見的便捷式檢測(cè)儀器即可實(shí)現(xiàn)DNA檢測(cè)的方法，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，將是一項(xiàng)具有重要意義的革新。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可用于尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)基因的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物及其制備方法和在目標(biāo)DNA檢測(cè)中的應(yīng)用，以達(dá)到對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行便攜、簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、選擇性高的檢測(cè)目的。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種可用于尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)基因的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物為長(zhǎng)鏈?zhǔn)椒肿咏Y(jié)構(gòu)，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子一端為黃嘌呤氧化酶，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子另一端為可雜交于待檢測(cè)目標(biāo)基因上的輔助探針，所述黃嘌呤氧化酶和輔助探針之間是通過4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽作為原料反應(yīng)后生成的連接臂進(jìn)行連接，所述連接臂包括4-(Ν-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)。上述的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物中，優(yōu)選的,所述黃嘌呤氧化酶上含有氨基,所述輔助探針上修飾有巰基。更進(jìn)一步的，所述4-(Ν_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的脂肪環(huán)I號(hào)位上通過羰基與所述黃嘌呤氧化酶上的氨基相連，所述輔助探針通過其上修飾的巰基連接至所述4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的五元雜環(huán)的3號(hào)位上。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種上述的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟(a)將O. 5mM 2mM的輔助探針(巰基修飾的輔助探針)溶液、O. 75M 2M的磷酸鹽緩沖液和15mM 60mM的磷酸三(β-氯乙基)酯混合，室溫下充分孵育(孵育的時(shí)間優(yōu)選控制在Ih 2h)，再使用超濾離心管反復(fù)離心(優(yōu)選至少在3次以上)；(b)將lmg/mL 5mg/mL的黃嘌呤氧化酶溶液與4_(N_馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽(sulfo-SMCC)振蕩混合(二者混合時(shí)，要保證4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽充分過量，二者摩爾比可以控制在I : (100 1000)，室溫下振蕩反應(yīng)完全(振蕩反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選為Ih 5h)，然后用超濾離心管反復(fù)離心(優(yōu)選至少在3次以上)，得到sulfo-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液；
(c)將經(jīng)上述步驟(a)處理后的輔助探針溶液和步驟(b)制得的SUlf0-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液混合，混合時(shí)輔助探針與黃嘌呤氧化酶的摩爾比控制在(5 20) : 1，室溫下反應(yīng)完全(反應(yīng)時(shí)間優(yōu)選為36h 54h)，再用超濾離心管反復(fù)離心(優(yōu)選至少在3次以上)，即得到黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物。上述的制備方法，所述步驟(a)中使用的超濾離心管優(yōu)選為3K超濾離心管。所述步驟(b)、(c)中使用的超濾離心管均優(yōu)選為30K超濾離心管。所述超濾離心管反復(fù)離心時(shí)用到的緩沖液A優(yōu)選為O. IM NaCl和O. IM磷酸鹽配制成的pH值為7. 5的緩沖液。由于反應(yīng)的基本原理和基本規(guī)律相同，本發(fā)明的合成方法可適用于各種序列的輔助探針，相應(yīng)的可以制備得到各種目標(biāo)序列的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物。作為一個(gè)總的技術(shù)構(gòu)思，本發(fā)明還提供一種利用尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法，包括以下步驟( I)取一金膜，對(duì)其表面進(jìn)行清洗并吹干，然后在金膜表面鋪上已打孔的硅橡膠片，形成反應(yīng)室；(2)在所述反應(yīng)室內(nèi)加入針對(duì)目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)的捕獲探針溶液，溫育(溫育時(shí)間優(yōu)選為Ih 4h)后再用巰基己醇溶液使所述捕獲探針上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉(封閉時(shí)的溫育時(shí)間優(yōu)選為O. 5h 2h)，構(gòu)建得到可用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的傳感器；(3)繼續(xù)向所述反應(yīng)室內(nèi)加入待測(cè)目標(biāo)溶液，雜交反應(yīng)后(雜交反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選控制在O. 5h 4h)用低鹽緩沖液反復(fù)洗滌；然后加入上述方法制得的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的溶液，雜交反應(yīng)后(雜交反應(yīng)的時(shí)間優(yōu)選控制在O. 5h 4h)，用低鹽緩沖液反復(fù)洗滌；(4)繼續(xù)向所述反應(yīng)室內(nèi)加入黃嘌呤溶液，充分反應(yīng)后，用尿酸儀對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；如果尿酸儀顯示的結(jié)果為L(zhǎng)o，則表明待測(cè)目標(biāo)溶液中不含目標(biāo)DNA或目標(biāo)DNA的含量過少(即被捕獲在金膜表面的黃嘌呤氧化酶的量過少，不足以催化產(chǎn)生足夠強(qiáng)的信號(hào)值);如果尿酸儀上顯示有信號(hào)數(shù)值，則表明待測(cè)目標(biāo)溶液中含目標(biāo)DNA ;根據(jù)尿酸儀上信號(hào)數(shù)值的大小可以進(jìn)一步判斷待測(cè)目標(biāo)溶液中DNA的濃度值。上述檢測(cè)方法是通過“三明治”雜交方法將目標(biāo)DNA和黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物依次捕獲在金膜表面，被捕獲在金膜表面的黃嘌呤氧化酶會(huì)催化后續(xù)添加的黃嘌呤溶液其生成尿酸，最后通過尿酸儀可實(shí)現(xiàn)信號(hào)的檢測(cè)。上述的檢測(cè)方法，所述步驟(2)中，捕獲探針溶液的濃度優(yōu)選為I μ M 2 μ M，所述巰基己醇溶液的濃度優(yōu)選為O. 5mM 2mM。上述的檢測(cè)方法，所述步驟(3)中，待測(cè)目標(biāo)溶液優(yōu)選是由緩沖液B稀釋配制而成，所述緩沖液B是由O. 5M O. 9M NaCl和O. 06M O. 09M檸檬酸三鈉配制成的pH值為7. O 7. 5的緩沖液。上述的檢測(cè)方法，所述步驟(3)中，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的溶液優(yōu)選是所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物分散于緩沖液A后配制而成，所述緩沖液A為O. IM O. 3MNaCl和O. IM O. 5M磷酸鹽配制成的pH值為7. O 7. 5的緩沖液。上述的檢測(cè)方法，所述步驟(3)中，所述反復(fù)洗滌用的低鹽緩沖液優(yōu)選為IOmM IOOmMNaCl和IOmM 50mM Tris-HCl配制成的pH值為7. O 8. O的緩沖液。上述的檢測(cè)方法，所述步驟(4)中，黃嘌呤溶液的濃度優(yōu)選為4mM 12mM，所述催化反應(yīng)的時(shí)間75min 135min。上述的檢測(cè)方法，所述各個(gè)步驟的操作過程均控制在室溫下進(jìn)行(特別優(yōu)選為25。。)。本發(fā)明的上述技術(shù)方案利用黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物與目標(biāo)DNA、捕獲探針形成的“三明治”雜交結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了將待測(cè)目標(biāo)DNA與黃嘌呤氧化酶之間的聯(lián)系，從而為利用尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)DNA開辟了有效可行的途徑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明提供了一種新穎的信號(hào)獲取方式，其不需要大型、復(fù)雜、昂貴的檢測(cè)儀器和設(shè)備，利用簡(jiǎn)單、低成本的尿酸儀即可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA的有效檢測(cè)，具有便攜、簡(jiǎn)單、操作方便、靈敏度高、選擇性高等優(yōu)點(diǎn)，可以真正實(shí)現(xiàn)在事故地點(diǎn)或其他場(chǎng)合進(jìn)行簡(jiǎn)便、實(shí)時(shí)的檢測(cè)。由于本發(fā)明中利用的酶催化底物具有專一性、高效率等特點(diǎn)，其可明顯地增強(qiáng)檢測(cè)信號(hào)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)DNA高靈敏、高選擇性地檢測(cè)。由于本發(fā)明利用尿酸儀這樣一種已經(jīng)廣泛商業(yè)化的產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA的有效檢測(cè)，其在今后的DNA檢測(cè)領(lǐng)域?qū)⒕哂袕V泛的應(yīng)用前景。


圖I為本發(fā)明實(shí)施例I中黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物合成的原理示意圖。圖2為本發(fā)明實(shí)施例I中黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物SDS-PAGE電泳表征圖。圖3為本發(fā)明實(shí)施例2、實(shí)施例3中檢測(cè)方法的檢測(cè)原理示意圖。圖4為本發(fā)明實(shí)施例2中尿酸儀的檢測(cè)結(jié)果。圖5為本發(fā)明實(shí)施例2中目標(biāo)DNAl與傳感器的雜交孵育時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果。圖6為本發(fā)明實(shí)施例2中催化底物反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化結(jié)果。圖7為本發(fā)明實(shí)施例2中催化底物濃度的優(yōu)化結(jié)果。圖8為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)檢測(cè)時(shí)操作溫度的優(yōu)化結(jié)果。圖9為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)檢測(cè)特異性的考察結(jié)果。圖10為本發(fā)明實(shí)施例2中對(duì)檢測(cè)靈敏度的考察結(jié)果。圖11為本發(fā)明實(shí)施例3中對(duì)檢測(cè)靈敏度的考察結(jié)果。 圖12為本發(fā)明實(shí)施例3中對(duì)檢測(cè)特異性的考察結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。實(shí)施例I :一種本發(fā)明的可用于尿酸儀檢 測(cè)目標(biāo)基因的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物(參見圖
I)，黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物為長(zhǎng)鏈?zhǔn)椒肿咏Y(jié)構(gòu)，黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子一端為黃嘌呤氧化酶，黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子另一端為可雜交于待檢測(cè)目標(biāo)基因上的輔助探針，黃嘌呤氧化酶和輔助探針之間是通過4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽作為原料反應(yīng)后生成的連接臂進(jìn)行連接，連接臂包括4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)。本實(shí)施例中黃嘌呤氧化酶和輔助探針之間通過連接臂連接的具體連接方式為黃嘌呤氧化酶上含有氨基，輔助探針上修飾有巰基，位于連接臂處的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的脂肪環(huán)I號(hào)位上通過羰基與黃嘌呤氧化酶上的氨基相連，輔助探針則通過其上修飾的巰基連接至4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的五元雜環(huán)的3號(hào)位上。本實(shí)施例的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的制備方法如圖I所示，包括以下步驟(a)將30 μ L O. 5mM輔助探針、2 μ L IM磷酸鹽緩沖液(ρΗ=5. 5)和2 μ L 15mM磷酸三氯乙基)酯(TCEP)混合，室溫下孵育Ih;超濾離心管(3Κ)并使用Buffer A反復(fù)離心(3次以上)；(b)將400 μ L lmg/mL的黃嘌呤氧化酶溶液與Img sulfo-SMCC振蕩混合5min,并保證4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽充分過量，然后放置在振蕩恒溫金屬浴上室溫下振蕩Ih ;澄清的溶液再用超濾離心管(30K，BufTerA)反復(fù)離心(3次以上)，得到sulfo-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液；(c)將上述步驟(a)處理后的輔助探針溶液和步驟(b)制得的sulfo-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液混合(混合時(shí)輔助探針與黃嘌呤氧化酶的摩爾比控制在5 20 I即可)，室溫下反應(yīng)48h后，用超濾離心管(30K)反復(fù)離心(3次以上)，即可得到黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物。將制得的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物分散在BufferA中，4°C保存，備用。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明方法合成的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物同時(shí)具有酶的催化能力與DNA的特性。本實(shí)施例中通過變性聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳對(duì)合成的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物進(jìn)行了表征，結(jié)果如圖2所示。本實(shí)施例中所采用的分離膠的濃度為12%，其中第一條泳道是Marker ;第二條泳道是本實(shí)施例制得的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物；第三條泳道是O. 5mM輔助探針+5mg/mL黃嘌呤氧化酶的混合物；第四條泳道是5mg/mL的黃嘌呤氧化酶。從圖2中可以看出，單純的黃嘌呤氧化酶、或者黃嘌呤氧化酶與輔助探針的簡(jiǎn)單混合物這兩個(gè)樣品在膠板上處于同一個(gè)位置，而本實(shí)施例的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的那個(gè)條帶則處于黃嘌呤氧化酶的上方，這說明有黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物生成。上述的表征手段是以客觀的反應(yīng)原理和反應(yīng)規(guī)律為前提，直接反應(yīng)的是分子量的一個(gè)變化。在圖I所示的合成路線中僅示出了一分子黃嘌呤氧化酶只與一條DNA結(jié)合形成復(fù)合物的情形，但實(shí)際上一分子黃嘌呤氧化酶可能存在10 20幾個(gè)帶有氨基的殘基，因此并不能確定一分子黃嘌呤氧化酶上到底結(jié)合上了幾條DNA，相應(yīng)的，在電泳圖上顯示出的是一個(gè)相對(duì)較寬的帶狀條帶。因此，即使一分子黃嘌呤氧化酶通過連接臂連接多條DNA時(shí)得到的復(fù)合物，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例2 本實(shí)施例中將用到以下的引物序列(所有DNA序列均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)目標(biāo) DNA 1:5' -GGTTGTGAGGCGCTGCCCAAGCGA-3 '；捕獲探針I(yè) :5 ' -CGCCTCACAACCAAAAAA-SH-3 ;；輔助探針I(yè) :5’ -HS-AAAAAAAAAAAATCGCTTGGGCAG-3'；單堿基錯(cuò)配DNAl (smDNAl) 5 ; -GGT TGT GAG GCG GTG CCC AAG CGA-3 ;；雙堿基錯(cuò)配DNAl (dmDNAI) 5 ; -GGT AGT GAG GCG GTG CCC AAG CGA-3 ;； 三堿基錯(cuò)配DNAl (tmDNAI) 5 ; -GGTAGT GAG GCG GTG CCC TAG CGA-3 ;；隨機(jī)序列DNAl (ranDNAI) 5 ; -TAC CAG TTGAGAACC CTGAAT CCG-3 ;。如圖3所示，一種本發(fā)明的利用尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法，包括以下步驟(I)將金膜表面分別用丙酮、乙醇、水清洗，然后用氮?dú)獯蹈桑伾弦汛蚝每椎墓柘鹉z片PDMS，形成陣列式的反應(yīng)室；(2)在每個(gè)反應(yīng)室內(nèi)進(jìn)行以下的反應(yīng)首先加入20 μ L2 μ M捕獲探針，室溫下孵育2h,用BufferA清洗后，每個(gè)反應(yīng)室中加入20 μ LlmM的巰基己醇，室溫下孵育30min后用BufferA清洗表面，構(gòu)建得到可用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的傳感器；(3)繼續(xù)向各個(gè)反應(yīng)室內(nèi)分別加入20 μ L不同濃度的待測(cè)目標(biāo)溶液(包括含目標(biāo)DNAl濃度為0ηΜ、100ηΜ、250ηΜ、400ηΜ、800ηΜ的待測(cè)目標(biāo)溶液)，各待測(cè)目標(biāo)溶液用BufferB配制，室溫下分別雜交60min，用Buffer D低鹽緩沖系統(tǒng)反復(fù)洗滌；然后再分別加入20 μ L黃嘌呤氧化酶-DNAl復(fù)合物的溶液(該復(fù)合物是由黃嘌呤氧化酶和輔助探針I(yè)按照實(shí)施例I的合成方法生成的復(fù)合物)，室溫下分別雜交Ih,用Buffer D反復(fù)洗漆去除未雜交的部分；(4)最后向各個(gè)反應(yīng)室內(nèi)分別加入I. 5mM的黃嘌呤溶液,經(jīng)過90min的催化反應(yīng)后，分別移取3. 3 μ L液體到尿酸試紙條上，用尿酸儀對(duì)信號(hào)進(jìn)行獲取。尿酸儀的檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，當(dāng)待測(cè)目標(biāo)溶液中不存在目標(biāo)DNAl時(shí),尿酸儀顯示的結(jié)果是Lo ;隨著目標(biāo)DNAl濃度的增加，尿酸儀上顯示的數(shù)值不斷增大。這充分說明，隨著目標(biāo)DNAl濃度的增力口，捕獲在金膜表面的黃嘌呤氧化酶越多，其催化能力越強(qiáng)，因此在尿酸儀上顯示的數(shù)值也相應(yīng)增大。因此，通過尿酸儀上顯示的數(shù)值可以間接定性、定量地反應(yīng)待測(cè)目標(biāo)溶液中目標(biāo)DNAl的濃度，這充分驗(yàn)證了本發(fā)明檢測(cè)方法的可行性。對(duì)目標(biāo)DNAl與傳感器的雜交孵育時(shí)間進(jìn)行考察上述檢測(cè)方法的步驟(3)中，將目標(biāo)DNAl與金膜表面DNA傳感器的雜交時(shí)間分別調(diào)整為20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min和90min進(jìn)行實(shí)驗(yàn),其余的操作步驟不變(選用的目標(biāo)DNAl的濃度為400nM)，結(jié)果如圖5所示，由圖5可見，隨著雜交時(shí)間的增加，尿酸儀的數(shù)值增大，并逐漸趨向平穩(wěn)。當(dāng)雜交時(shí)間為60min時(shí),黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤達(dá)到最大值,因此,本發(fā)明中優(yōu)選60min作為目標(biāo)DNAl與傳感器的雜交孵育時(shí)間。對(duì)催化底物反應(yīng)時(shí)間的考察將底物黃嘌呤溶液的催化反應(yīng)時(shí)間分別調(diào)整為45min、60min、75min、90min、105min、120min和135min,其余的操作步驟不變(選用的目標(biāo)DNAl的濃度為400nM)，結(jié)果如圖6所示，由圖6可見，隨著催化反應(yīng)時(shí)間的增加，產(chǎn)生的尿酸越多，尿酸儀測(cè)出來的數(shù)值越大，但是當(dāng)催化反應(yīng)時(shí)間為90min時(shí)，基本達(dá)到最大值，因此本發(fā)明中優(yōu)選采用90min作為黃嘌呤氧化酶催化反應(yīng)的時(shí)間。對(duì)催化底物濃度的考察將底物黃嘌呤溶液的濃度分別調(diào)整為O. 5mM、lmM、
I.5mM、5mM、8mM、10mM、12mM (選用的目標(biāo)DNAl的濃度為400nM)，其余的操作步驟不變，結(jié)果如圖7所示，由圖7可見，當(dāng)黃嘌呤的濃度為5mM時(shí)達(dá)到平臺(tái)期，此時(shí)尿酸儀的信號(hào)值最佳，因此本發(fā)明中選取5mM作為催化底物反應(yīng)的最佳濃度(與上述實(shí)施例2中的濃度稍有不同)。
對(duì)反應(yīng)溫度的考察將構(gòu)建好DNA傳感器后的實(shí)驗(yàn)操作溫度定依次調(diào)整為15°C、25°C、35 °C，其余操作步驟不變，催化底物的濃度定為5mM，催化反應(yīng)時(shí)間定為90min，結(jié)果如圖8所示，由圖8可見，選取25°C作為檢測(cè)操作的最佳溫度。以上實(shí)施例2的檢測(cè)操作也均是在25°C溫度下進(jìn)行。對(duì)檢測(cè)特異性的考察我們還將上述待測(cè)目標(biāo)溶液中用到的目標(biāo)DNAl分別換成smDNAl、dmDNA K tmDNA I 以及 ranDNAl，四種基因序列濃度均配制為 O. 01ηΜ、50ηΜ、ΙΟΟηΜ、400nM、800nM，其余步驟與實(shí)施例2中的檢測(cè)操作步驟相同，結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出，dmDNA K tmDNA I以及ranDNAl基本沒有響應(yīng)；對(duì)smDNAl而言，隨著濃度的增加，尿酸儀采集數(shù)據(jù)略有增加，但遠(yuǎn)小于同濃度的目標(biāo)DNAl引起的信號(hào)，這說明本發(fā)明的檢測(cè)方法具有很好的選擇性和專一性。對(duì)檢測(cè)靈敏性的考察在上述優(yōu)化后的工藝條件下對(duì)濃度在IOpM I μ M范圍內(nèi)的目標(biāo)DNAl進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果如圖10所示。由圖10可知，目標(biāo)DNAl的濃度與尿酸儀采集
500 6 V
數(shù)據(jù)成一定關(guān)系，其滿足如方程^ = 198.1 + ——-，其中y表示尿酸儀采集的數(shù)據(jù)，X表示
59.7 + X
目標(biāo)DNAl的濃度。由圖10可知，本發(fā)明優(yōu)選后的檢測(cè)方法其檢測(cè)下限為ΙΟρΜ。實(shí)施例3 本實(shí)施例中將用到以下的引物序列(所有DNA序列均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)有限公司)目標(biāo) DNA2 5 ; -TGG GAG GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGG TTAAAG GT-3 ;；捕獲探針2 5 ; -TC CCC CAA CTC CTC CCA TTT TTT-SH-3 ;；輔助探針2 :5 ' -SH-TTT TTT TTT TTT ACC TTT AAC CTA ATC TCC-3 ;；單堿基錯(cuò)配DNA2(smDNA2):5' -TGG GAG GAG TTG GGG GAG GAG ATT AGA TTAAAGGT-3 ;；雙堿基錯(cuò)配DNA2 (dmDNA2) 5 ; -TGG GAG GAG TTG GGG GAGAAGATTAGATTAAAGGT-3 ;；三堿基錯(cuò)配DNA2(tmDNA2):5' -TGG GAG GAA TTG GGG GAG AAG ATT AGA TTAAAGGT-3 ;；隨機(jī)序列DNA2(ranDNA2):5 ; -AAT TCA CAC CTG GGG GAG TAT TGC GGA GGAAGGTG-3 ;。如圖3所示，一種本發(fā)明的利用尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法，除了將實(shí)施例2中的目標(biāo)DNAl替換為目標(biāo)DNA2、捕獲探針I(yè)替換為捕獲探針2、輔助探針I(yè)替換為輔助探針2夕卜，其余的各步操作均與實(shí)施例2的操作步驟相同。由于輔助探針發(fā)生變化，實(shí)施例2中相應(yīng)制得的黃嘌呤氧化酶-DNAl復(fù)合物也替換為黃嘌呤氧化酶-DNA2復(fù)合物。在工藝參數(shù)及條件的控制上，主要工藝參數(shù)選用實(shí)施例2優(yōu)化后的工藝參數(shù)，檢測(cè)操作的溫度同樣設(shè)定為25°C，催化底物黃嘌呤溶液的濃度同樣定為5mM，催化反應(yīng)的時(shí)間同樣定為90min，目標(biāo)DNA2與傳感器的雜交孵育時(shí)間同樣定為60min，其余工藝參數(shù)和條件與實(shí)施例2相同，在前述工藝步驟和工藝條件下，同樣是分別對(duì)濃度為O I μ M的含目標(biāo)DNA2的待測(cè)目標(biāo)溶液進(jìn)行檢測(cè)。本實(shí)施例同樣考察了對(duì)目標(biāo)DNA2檢測(cè)的靈敏度和選擇性，其靈敏度的考察結(jié)果如圖11所示。由圖11可知，在4ρΜ ΙμΜ范圍內(nèi)，目標(biāo)DNA2的濃度與尿酸儀采集數(shù)據(jù)成
一定關(guān)系，滿足如方程
權(quán)利要求
1.ー種可用于尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)基因的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物，其特征在于所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物為長(zhǎng)鏈?zhǔn)椒肿咏Y(jié)構(gòu)，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子一端為黃嘌呤氧化酶，所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的分子另一端為可雜交于待檢測(cè)目標(biāo)基因上的輔助探針，所述黃嘌呤氧化酶和輔助探針之間是通過4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽作為原料反應(yīng)后生成的連接臂進(jìn)行連接，所述連接臂包括4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物，其特征在于所述黃嘌呤氧化酶上含有氨基，所述輔助探針上修飾有巰基，所述4- (N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的脂肪環(huán)I號(hào)位上通過羰基與所述黃嘌呤氧化酶上的氨基相連，所述輔助探針通過其上修飾的巰基連接至所述4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)的五元雜環(huán)的3號(hào)位上。
3.ー種黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟 Ca)將O. 5mM 2mM的輔助探針溶液、O. 75M 2M的磷酸鹽緩沖液和15mM 60mM的磷酸三氯こ基)酷混合，室溫下充分孵育，再使用超濾離心管反復(fù)離心； (b)將lmg/mL 5mg/mL的黃嘌呤氧化酶溶液與4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己燒_1_羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽振蕩混合，并保證4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-I-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽充分過量，室溫下振蕩反應(yīng)完全，然后用超濾離心管反復(fù)離心，得到sulfo-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液； (c)將經(jīng)上述步驟(a)處理后的輔助探針溶液和步驟(b)制得的sulfo-SMCC活化的黃嘌呤氧化酶溶液混合，混合時(shí)輔助探針與黃嘌呤氧化酶的摩爾比控制在(5 20) 1，室溫下反應(yīng)完全，再用超濾離心管反復(fù)離心，即得到黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述步驟(a)中，充分孵育的時(shí)間控制在Ih 2h ;所述步驟(b)中，振蕩反應(yīng)的時(shí)間為Ih 5h ;所述步驟(c)中，室溫下反應(yīng)的時(shí)間為36h 54h。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的制備方法，其特征在于所述步驟(a)中使用的超濾離心管為3K超濾離心管；所述步驟(b)、(c)中使用的超濾離心管為30K超濾離心管；所述超濾離心管反復(fù)離心時(shí)用到的緩沖液A為O. IM NaCl和O. IM磷酸鹽配制成的pH值為7. 5的緩沖液；所述超濾離心管反復(fù)離心時(shí)的重復(fù)離心次數(shù)至少在3次以上。
6.ー種利用尿酸儀檢測(cè)目標(biāo)DNA的方法，包括以下步驟 (1)取一金膜，對(duì)其表面進(jìn)行清洗井吹干，然后在金膜表面鋪上已打孔的硅橡膠片，形成反應(yīng)室； (2)在所述反應(yīng)室內(nèi)加入針對(duì)目標(biāo)DNA設(shè)計(jì)的捕獲探針溶液，溫育后再用巰基己醇溶液使所述捕獲探針上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)封閉，構(gòu)建得到可用于檢測(cè)目標(biāo)DNA的傳感器； (3)繼續(xù)向所述反應(yīng)室內(nèi)加入待測(cè)目標(biāo)溶液，雜交反應(yīng)后用低鹽緩沖液反復(fù)洗滌；然后加入含權(quán)利要求2所述的或者權(quán)利要求3 5中任一項(xiàng)制備方法制得的黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的溶液，雜交反應(yīng)后，用低鹽緩沖液反復(fù)洗滌； (4)繼續(xù)向所述反應(yīng)室內(nèi)加入黃嘌呤溶液，充分的催化反應(yīng)后，用尿酸儀對(duì)反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)；如果尿酸儀顯示的結(jié)果為L(zhǎng)o，則表明待測(cè)目標(biāo)溶液中不含目標(biāo)DNA或目標(biāo)DNA的含量過少；如果尿酸儀上顯示有信號(hào)數(shù)值，則表明待測(cè)目標(biāo)溶液中含目標(biāo)DNA ;根據(jù)尿酸儀上信號(hào)數(shù)值的大小可以進(jìn)一歩判斷待測(cè)目標(biāo)溶液中DNA的濃度值。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，捕獲探針溶液的濃度為I μ M 2 μ M，修飾捕獲探針時(shí)的溫育時(shí)間為Ih 4h，所述巰基己醇溶液的濃度為O. 5mM 2mM，巰基己醇溶液封閉時(shí)的溫育時(shí)間為O. 5h 2h。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(3)中，待測(cè)目標(biāo)溶液是由緩沖液B稀釋配制而成，所述緩沖液B是由O. 5M O. 9M NaCl和O. 06M O. 09M檸檬酸三鈉配制成的PH值為7. O 7. 5的緩沖液；所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的溶液是所述黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物分散于緩沖液A后配制而成，所述緩沖液A為O. IM O. 3M NaCl和O. IM O. 5M磷酸鹽配制成的pH值為7. O 7. 5的緩沖液；加入待測(cè)目標(biāo)溶液后的雜交反應(yīng)時(shí)間以及加入黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物的溶液后雜交反應(yīng)的時(shí)間均控制在Ih以上；所述反復(fù)洗滌用的低鹽緩沖液為IOmM IOOmM NaCl和IOmM 50mM Tris-HCl配制成的pH值為7. O 8. O的緩沖液。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述步驟(4)中，黃嘌呤溶液的濃度為4mM 12mM,所述催化反應(yīng)的時(shí)間為75min 135min。
10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述方法的操作過程均是在室溫下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種黃嘌呤氧化酶-DNA復(fù)合物，其分子一端為黃嘌呤氧化酶，另一端為輔助探針，二者是通過sulfo-SMCC作為原料反應(yīng)后生成的連接臂進(jìn)行連接，連接臂包括4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷基團(tuán)。該復(fù)合物的制備方法是先將輔助探針、緩沖液等混合、孵育，然后將黃嘌呤氧化酶與sulfo-SMCC振蕩混合反應(yīng)，最后將得到的輔助探針溶液和黃嘌呤氧化酶溶液混合。本發(fā)明的復(fù)合物可通過尿酸儀來檢測(cè)目標(biāo)DNA，其方法是取金膜預(yù)處理后加入捕獲探針構(gòu)建傳感器；再加入待測(cè)目標(biāo)溶液雜交后洗滌，加入復(fù)合物溶液雜交后洗滌；最后加入黃嘌呤，并用尿酸儀對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在操作方便、靈敏度高且選擇性高。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102703596SQ20121020041
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者劉芳, 朱紅志, 王柯敏, 王青, 羊小海, 翦立新 申請(qǐng)人:湖南大學(xué)