人胱抑素c納米抗體及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及人胱抑素C納米抗體及其高靈敏定量檢測的試劑盒。本發明揭示了針對胱抑素C不同表位的納米抗體以及單克隆抗體，所述的抗體與胱抑素C具有良好的親和性。利用所述的納米抗體與單克隆抗體，可制備出方便、快速且準確地檢測胱抑素C的系列試劑盒。本發明解決的技術問題：提供一種可用于配對檢測胱抑素C的納米抗體；本發明的試劑盒解決的技術問題一：靈敏檢測胱抑素C抗原，重復性好，結果穩定；本發明的試劑盒解決的技術問題二：快速檢測，方便快捷，納米抗體生產成本低且易于獲得。
【專利說明】人胱抑素C納米抗體及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】；更具體地，本發明涉及人胱抑素C納米抗體及其高靈敏定量檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002]自比利時布魯塞爾自由大學的免疫學家Hamers Casterman從駱5它血液中分離出的天然缺失輕鏈，僅含兩條重鏈，相比傳統抗體在結構上簡單許多的天然抗體后，基于一個重鏈可變區組成的單域抗體(VHH)，因其晶體結構直徑為2.5nm、長4nm，納米抗體概念得以提出。納米抗體一經發現，它所具有的一些獨特特征便引起研究者們的注意。作為一種小分子抗體，納米抗體有很多的優點。包括:1、分子小，結構穩定，耐熱性好。研究證實，將納米抗體在37°C放置一周或在高溫條件(90°C)下保存，都能保持比較好的生物活性。另外，納米抗體在強變性劑的條件下表現出不易變性或者變性后易復性的特點，研究表明納米抗體比常規抗體更容易儲藏和運輸，作為診斷試劑更具有優勢。2、親和力較高。雖然納米抗體缺少VL，但是VHH自身的一些性質使得納米抗體仍然保持了較高的親和力。研究發現從免疫的單域VHH抗體庫中分離出來的VHH單體具有nmol/L級的親和力，并且特異性好；3、對人體的免疫原性弱。目前已有的抗體大都是鼠源的，作用于人體會產生人抗鼠抗體的免疫反應。Revets等將其制備的納米抗體反復注射小鼠后未見有針對這種單域VHH抗體的抗體產生。所以納米抗體的免疫原性較弱，與人的生物相容性較好，可能是由于駱駝VHH基因與人VH3家族序列高度同源的原因；4、易表達、易純化。由于納米抗體單獨能夠形成完整的獨立結合抗原的結構域，很容易實現可溶性表達，從而使得納米抗體的生產比一般抗體的生產更加容易，作為診斷試劑 的制備也更快、更便宜。
[0003]另一方面，血清胱抑素C是首次在雞蛋清中被發現的，然后分離純化得到高純度的半胱氨酸蛋白酶抑制劑(Cysteine Protease Inhibitor, CPI),后被命名為Cys C,屬于CPI超家族，是一種非糖基化的堿性低分子蛋白，相對分子質量為13.6KDa,由120個氨基酸組成，帶正電荷，等電點為9.3，編碼基因位于20號染色體短臂，長約615kb。胱抑素C是一種分泌性蛋白，廣泛存在于各種體液中，如腦脊液、唾液、尿液、精液等，其中腦脊液中的濃度最高，為5.8±2.2mg/L,唾液中胱抑素C含量為1.8±0.88mg/L，血清中的胱抑素C的含量在0.7±0.23mg/L，而尿液中胱抑素C的含量最低，約為0.095 ±0.057mg/L。胞外胱抑素C含量高可能是由于局部的高分泌速率，或是低的組織液更新速率的結果。
[0004]胱抑素C由看家基因控制，在所有有核細胞內表達，并且以恒定的速度產生。在人體多數組織中持續恒定表達，由于胱抑素C相對分子質量低、等電點高，使胱抑素C能被腎小球自由濾過，然后在近曲小管上皮細胞內分解代謝，不被腎小管重吸收和分泌，其排泄僅受腎小球濾過率(GRF)的影響，而不受其它因素如性別、年齡、飲食、炎癥和血脂水平等的影響，且與性別、年齡、肌肉量無關。
[0005]利用胱抑素C對一些疾病的顯著指示作用為人們對某些疾病的早期診斷和及時救治提供了可能性，胱抑素C已在臨床評價心腦血管疾病，腎臟移植，血液疾病，甲亢，腫瘤，化療，兒童、老年人疾病等多個領域得以應用，并顯示了良好的應用前景。
[0006]然而，現有技術中的檢測胱抑素C的檢測試劑，如用于配對的單克隆的制備存在困難，專利“一種制備胱抑素C配對單克隆抗體的方法(201110254775.8) ”為解決這一困難提供了一種途徑。然而，即便如此，此種方法仍然操作繁雜，且所研制出來的單克隆抗體仍然存在部分缺陷，例如敏感性低、再現性差、抗體不易獲得等問題。因此，本領域迫切需要開發改進的檢測胱抑素C的檢測試劑，以滿足市場所需。
【發明內容】

[0007]本發明的目的在于提供人胱抑素C納米抗體及其高靈敏定量檢測試劑盒。
[0008]在本發明的第一方面，提供一種來源于駝羊或駱駝的納米抗體(單域重鏈抗體，VHH)，能高親和力特異性與人胱抑素C結合；且骨架區含有如SEQ IDNO=Il所示的共同特征氨基酸序列。
[0009]在一個優選例中，所述的納米抗體中，在抗體超變區含有共同特征氨基酸序列:IT* * GNT，其中“ ”代表一個隨機氨基酸。
[0010]在另一優選例中，所述的納米抗體具有SEQ ID NO: 1-10任一所示的氨基酸序列。
[0011]在本發明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼前面任一所述的納米抗體。
[0012]在本發明的另一方面，提供一種表達載體，該表達載體中含有所述的多核苷酸。
[0013]在本發明的另一方面，提供一種宿主細胞，該宿主細胞中含有所述的表達載體或其基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0014]在本發明的另一方面，提供一種產生納米抗體的方法，包括:培養所述的宿主細胞，使之表達所述的納米抗體。
[0015]在本發明的另一方面，提供一種納米抗體噬菌體(噬菌粒)，其包括:噬菌體(噬菌粒)，以及展示于噬菌體表面的前面任一所述的納米抗體。
[0016]在另一優選例中，所述的噬菌體是商業化噬菌體，即是常規用于進行蛋白展示的噬菌體。較佳地，所述的噬菌體是Μ13Κ07。
[0017]在本發明的另一方面，提供一種特異性檢測人胱抑素C的試劑盒，包括:前面任一所述的納米抗體；或任一所述的納米抗體曬菌體。
[0018]在一個優選例中，所述試劑盒還包括人胱抑素C特異的單克隆抗體；所述的單克隆抗體與所述的納米抗體結合人胱抑素C蛋白的不同表位。
[0019]在一個優選中，所述的試劑盒中，所述的人胱抑素C特異的單克隆抗體選自:
[0020](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體；或
[0021](b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
[0022]在另一優選例中，所述的試劑盒中包括:
[0023](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體；或
[0024](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體；或[0025](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體；或[0026](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體；或
[0027](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0028](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0029](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0030](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0031](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的納米抗體,和(b)表面展不有具有SEQID NO:7所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0032](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的納米抗體,和(b)表面展不有具有SEQID N0:8所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或
[0033](a)具有SEQ ID NO:1所不的氣基酸序列的納米抗體,和(b)表面展不有具有SEQID NO: 10所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體。
[0034]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括固相載體，所述的納米抗體被固定于固相載體(如多孔板、蓋玻片、微珠)；或所述的單克隆抗體被固定于固相載體。
[0035]在另一優選例中，所述試劑盒中還包括:能與所述的納米抗體或單克隆抗體連接的可檢測標記物(如HRP)，所述的可檢測標記物被連接于所述的納米抗體或單克隆抗體或分離地存在于試劑盒；
[0036]胱抑素C標準品；和/或
[0037]與可檢測標記物相對應的底物；和/或
[0038]酶聯免疫反應試劑(包括但不限于:包被(緩沖)液，洗滌(緩沖)液，封閉液，固定液，終止液，顯色液);和/或
[0039]說明檢測人胱抑素C的方法的使用說明書。
[0040]在本發明的另一方面，提供一種單克隆抗體，所述的單克隆抗體選自:
[0041](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體；或
[0042](b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
[0043]在本發明的另一方面，提供所述的納米抗體或所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測人胱抑素C的檢測試劑盒。[0044]在本發明的另一方面，提供產生特異性結合人胱抑素C的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，選自:
[0045](a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株；或
[0046](b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株。
[0047]在本發明的另一方面，提供一種檢測(較佳地，為非診斷性地)待測樣品中胱抑素C存在情況的方法，所述方法包括:
[0048]以所述的試劑盒中(a)抗體作為包被抗體(第一抗體)，(b)抗體作為檢測抗體(第二抗體)，且在所述的檢測抗體上設置一可檢測標記物；通過雙抗夾心酶聯免疫反應法來檢測待測樣品中胱抑素C的存在情況。
[0049]本發明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1、單抗5F2的親和系數測定。
[0051]圖2、單抗4E4的親和系數測定。
[0052]圖3、單抗IEll的親和系數測定。
[0053]圖4、鎳柱純化后的納米抗體SDS-PAGE(左圖)，以及各個克隆納米抗體的理論分子量(右圖)。`
[0054]圖5、以單抗5F2作為包被抗體，以相應納米抗體進行檢測的結果。
[0055]圖6、以單抗IEll作為包被抗體，以相應納米抗體進行檢測的結果。
[0056]圖7、以單抗5F2作為包被抗體，以相應納米抗體噬菌粒進行檢測的結果。
[0057]圖8、以單抗IEll作為包被抗體，以相應納米抗體噬菌粒進行檢測的結果。
[0058]圖9、以納米抗體3-2作為包被抗體，以相應納米抗體噬菌粒進行檢測的結果。
[0059]圖10、以單抗5F2作為包被抗體，以相應納米抗體噬菌粒進行檢測的結果。
[0060]圖11、精密度檢測結果。
【具體實施方式】
[0061]本發明人經過長期的研究和試驗，找到了針對胱抑素C不同表位的納米抗體以及單克隆抗體(即可用于配對檢測胱抑素C)，所述的抗體與胱抑素C具有良好的親和性。利用所述的納米抗體與單克隆抗體，可制備出方便、快速且準確地檢測胱抑素C的試劑盒。本發明解決的技術問題:提供一種可用于配對檢測胱抑素C的納米抗體；本發明的試劑盒解決的技術問題一:靈敏檢測胱抑素C抗原，重復性好，結果穩定；本發明的試劑盒解決的技術問題二:快速檢測，方便快捷，納米抗體生產成本低且易于獲得。
[0062]術語
[0063]如本文所用，所述的“單克隆抗體(單抗)”指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特異性地針對單個抗原位點。而且，與常規多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不同抗體)不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗體的好處還在于它們是通過雜交瘤培養來合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。“單克隆”表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特殊方法來生產抗體。
[0064]如本文所用，所述的“納米抗體”是指缺失輕鏈的重鏈抗體(如:來源于駱駝體內)，克隆其可變區得到的單域抗體，是最小的功能性抗原結合片段，相對分子質量(Mr)僅為15000。納米抗體具有Mr小、穩定性強、可溶性好、易表達，免疫原性低等特點。
[0065]如本文所用，所述的“雙抗夾心法”是酶聯免疫反應(ELISA)的一種，將包被抗體固定于載體，然后包被抗體與抗原反應，洗滌后再與帶標記的檢測抗體反應，洗滌，最后進行化學發光或酶聯顯色反應檢測信號。雙抗夾心法特別適用于具有兩個或兩個以上表位的抗原的檢測。
[0066]如本文所用，所述的“包被抗體”、“第一抗體”、“捕獲抗體”、與“一抗”可互換使用，都是指用于固定于固相載體上的、特異性抗胱抑素C的抗體。
[0067]如本文所用，所述的“檢測抗體”、“第二抗體”、“酶標(記)抗體”與“二抗”可互換使用，都是指特異性地抗胱抑素C且對應于所述試劑盒中相應的包被抗體的抗體。對于抗原胱抑素C而言，相應的包被抗體和檢測抗體是不同的，并且可同時結合于所述的胱抑素C的不同表位(抗原決定簇)。
[0068]如本文所用，所述的“可檢測標記物”是指位于檢測抗體上的，用于確定待檢測樣品中胱抑素C的存在與否以及存在的量的標志物。如:酶、熒光標記、核素、量子點、膠體金等。優選的，所述的標記物選自:辣根過氧化物酶(HRP)、堿性磷酸酯酶(AP)、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0069]如本文所用，所述的“與可檢測標記物相對應的底物”是指可被檢測抗體的標記物所催化顯色，用于顯示檢測抗 體與胱抑素C發生結合的識別信號。所述的底物比如:用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯憐酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP);等等。
[0070]胱抑素C
[0071]胱抑素C是一種已知的蛋白，其氨基酸序列和核苷酸序列都是本領域已知的。例如，其氨基酸序列如GenBank:AAHl3083.1所示。
[0072]生產胱抑素C的方法也是已知的。例如，通過常規的重組DNA技術(Science，1984 ；224:1431),可利用胱抑素C的多聚核苷酸序列來表達或生產重組的胱抑素C蛋白。一般來說有以下步驟:
[0073](I).用編碼人胱抑素C蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0074](2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；和
[0075](3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0076]上述獲得的重組胱抑素C蛋白可被加工成具有一定純度的蛋白，用于配制標準品O
[0077]抗胱抑素C蛋白的納米抗體
[0078]本發明提供了一種納米抗體，所述的納米抗體篩選自駝源性天然單域重鏈抗體庫。
[0079]本發明所述的納米抗體，能高親和力特異性與人胱抑素C結合；且骨架區含有共同特征氨基酸序列GGSLRL ;更佳地，在抗體超變區含有共同特征氨基酸序列:IT**GNT，其中*為隨機氨基酸。
[0080]較佳地，所述的納米抗體具有SEQ ID NO: 1-10任一所示氨基酸序列。
[0081]本發明也包括所述的納米抗體的變異體、衍生物和類似物，只要它們保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT**GNT。如本文所用，術語“變異體”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的納米抗體相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽變異體、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(?)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽)。根據本文的定義這些變異體、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
[0082]本發明的“納米抗體”還包括保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT * * GNT結構、且具有特異性結合胱抑素C功能的、SEQ ID NO: 1-10任一所示氨基酸序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于):若干個(通常為1-20個，最佳地1-10個，還更佳如1-8個或1-5個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或減少一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。
[0083]本發明還提供保留有氨基酸序列GGSLRL和/或IT * * GNT的、納米抗體的類似物。這些類似物與天然納米抗體的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類似物。
[0084]此外，在所述的納米抗體的氨基端或羧基端還可添加其它基本上不影響本發明所述的納米抗體的活性、表達量和穩定性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利于表達(如信號肽)，有利于純化(如6XHis序列)，或其它可促進所述的納米抗體的活性、表達量或穩定性的序列。
[0085]本發明還包括編碼本發明的納米抗體或其變異體、衍生物的DNA分子。所述的DNA分子可以全部人工合成，也可用PCR擴增的方法獲得 。
[0086]為了進一步提高宿主細胞的表達量，可以對本發明的納米抗體的編碼序列進行改造，例如采用宿主細胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉錄及翻譯的序列。
[0087]在獲得了編碼本發明新納米抗體或其變異體、衍生物的DNA序列之后，將其克隆入合適的表達載體，再轉入合適的宿主細胞。最后，培養轉化后的宿主細胞，通過分離純化得到本發明的新的納米抗體。
[0088]如本文所用，術語“載體”包括質粒、表達載體、克隆載體、病毒載體等。可選用本領域已知的各種載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發明新納米抗體的核苷酸序列可操作地連于表達調控序列，可以形成表達載體。
[0089]在本發明中，術語“宿主細胞”包括原核細胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。用于表達納米抗體的宿主細胞包括大腸桿菌、酵母細胞、昆蟲細胞、COS細胞、CHO細胞等。較佳地，該宿主細胞是原核細胞，更佳地是大腸桿菌細胞。
[0090]在獲得轉化的宿主細胞后，可在適合表達本發明納米抗體的條件下培養該細胞，從而表達出納米抗體；然后再分離出表達的納米抗體。
[0091]抗胱抑素C蛋白的單克隆抗體
[0092]用于本發明的單克隆抗體是對人胱抑素C具有特異性的單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人胱抑素C蛋白或其片段。更特別地，指那些能與人胱抑素C蛋白或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。
[0093]本發明利用針對胱抑素C不同表位的高特異性納米抗體和單克隆抗體，根據雙抗夾心法原理，制備了可方便、快速且準確地檢測胱抑素C的試劑盒。本發明中涉及的2種高特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞系代號以及保藏號對應如下:
[0094]雜交瘤細胞系5F2，保藏號為:CCTCC N0:C201239 ；
[0095]雜交瘤細胞系1E11，保藏號為:CCTCC N0:C201253。
[0096]上述的單克隆抗體的抗體亞型均為IgGp
[0097]本發明的單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256 ; 495,1975 ; Kohler 等 Α? Eur.J.1mmunol.6:511,1976; Kohler 等 Α? Eur.J.Tmmunol.6:292,1976;Hammerling 等人，In Monoclonal Antibodies and TCellHybridomas,Elsevier,N.Y., 198`1)。本發明的單克隆抗體可以利用人胱抑素C基因產物或片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。此外，還可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。
[0098]本領域人員均了解，在得到了所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系或通過測序等手段得知所述的單克隆抗體后，本領域人員可以采用多種方法方便地獲得所述的抗體。
[0099]在本發明的一個實例中，所述的單克隆抗體可以由下列制備方法所制備，所述方法包括步驟:(I)提供佐劑預處理的小鼠；(2)在小鼠腹腔內接種所述的雜交瘤細胞并分泌單克隆抗體；(3)抽取腹水，分離獲得所述的單克隆抗體。作為一種優選方式，從腹水中分離單克隆抗體的方法是:收集腹水，用經硫酸銨、辛酸沉淀，接著用Protein G預裝層析柱純化，獲得高純度的胱抑素C單克隆抗體。
[0100]此外，也可按照常規的動物細胞培養方法，體外培養擴增所述的雜交瘤細胞，從而使之分泌所述的單克隆抗體。
[0101]試劑盒
[0102]本領域技術人員均了解，一種抗原可能含有多個表位(抗原決定簇)，因此，針對同一個抗原可以獲得不止一個抗體，這些抗體對抗原的結合特性(如特異性等)均可能是不同的。因此，針對同一個抗原，本領域人員需要進行比較和篩選，才能找到適合于特異性結合的、效果優異的抗體。
[0103]通常情況下，若是采用一種抗體來結合胱抑素C，可能在測定過程中不可避免地發生非特異性結合；而基于雙抗夾心法原理來制備檢測試劑盒，采用的是結合于胱抑素C抗原不同表位的雙抗體，這種情況下出現非特異性結合的幾率大大降低，因此結果的準確性和精密度大大提高。并且，采用兩種特異性非常高的抗體來將目標抗原胱抑素C吸附及定位，其定位和放大效果更好，從而使得特異性和精密度更高。且測定時僅需要很少的樣品量即可。
[0104]因此，本發明提供一種檢測胱抑素C的試劑盒，所述的試劑盒可用于胱抑素C的特異性檢測，所述的試劑盒含有:本發明所述的納米抗體或納米抗體噬菌體(噬菌粒)。更佳地，所述的試劑盒中還包括人胱抑素C特異的單克隆抗體；所述的單克隆抗體與所述的納米抗體結合人胱抑素C蛋白的不同表位。
[0105]作為本發明的優選方式，所述的試劑盒中包括:
[0106](a)單克隆抗體5F2,和(b)納米抗體3-2 ;或
[0107](a)單克隆抗體5F2,和(b)納米抗體4-5 ;或
[0108](a)單克隆抗體IElUP (b)納米抗體3-2 ;或
[0109](a)單克隆抗體IElUP (b)納米抗體4-5 ;或
[0110](a)單克隆抗體5F2，和(b)納米抗體噬菌體P-3-2 ;或
[0111](a)單克隆抗體5F2，和(b)納米抗體噬菌體P-4-5 ;或
[0112](a)單克隆抗體1Ell，和(b)納米抗體噬菌體P-3-2 ;或
[0113](a)單克隆抗體1Ell， 和(b)納米抗體噬菌體P-4-5 ;或
[0114](a)納米抗體3-2，和(b)納米抗體噬菌體P-5-10 ;或
[0115](a)納米抗體3-2,和(b)納米抗體曬菌體P-6-l ;或
[0116](a)納米抗體3-2，和(b)納米抗體噬菌體P-7-4。
[0117]本發明人出乎意料地發現，這樣的一種組合能夠產生最好的胱抑素C檢測效果，其檢測靈敏度非常高。
[0118]在確定了本發明的試劑盒所采用的包被抗體和檢測抗體后，可以采用本領域常規可用于與檢測抗體結合來進行檢測的各種標記物。本發明對所采用的標記物沒有特別的限制，只要是能夠與所述的檢測抗體結合，且在適當處理后能夠準確地指示待檢測樣品中胱抑素C的存在與否以及存在量的標記物均是可用的。例如，所述的標記物可以選自(但不限于):辣根過氧化物酶、堿性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。例如，所述的檢測抗體采用辣根過氧化物酶(HRP)標記。抗體標記的方法在本領域是公知的，例如用簡易過碘酸鈉法或者戊二醛二步法進行HRP標記抗體。
[0119]當采用如上所示的一些酶標記物時，還需要采用一些與相應的酶結合的底物，從而可通過顯色等方式來報導標記物的存在情況或者存在量。所述的底物例如(但不限于):用于辣根過氧化物酶的鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對硝基苯憐酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)。
[0120]為了消除假陽性和假陰性，宜在檢測過程中設置質控(對照)。所述的質控品例如采用胱抑素C標準品。此外，為了獲得定量結果，可以在檢測過程中設置含已知濃度的多個胱抑素C的標準品。對于標準品的設置方法可采用常規的方法。利用所述的標準品，標準曲線如下設置:用標準品的OD值檢測結果為縱坐標(Y軸)，標準品濃度為橫坐標(X軸)繪制成胱抑素C試劑盒的定量標準曲線。從而，根據待測樣品檢測獲得的OD值，利用標準曲線可計算出待測樣品中胱抑素C的濃度。
[0121]此外，為了使本發明的試劑盒在檢測時更方便，所述的試劑盒中優選的還包含其它一些輔助試劑，所述的輔助試劑是酶聯免疫試驗中常規使用的一些試劑，這些試劑的特性以及它們的配制方法均是本領域技術人員所熟知的。所述的試劑例如(但不限于):顯色劑、洗滌液、終止液，增敏稀釋液。
[0122]所述的包被抗體被包被在固相載體上。本發明對所采用的固相載體沒有特別的限制，只要其能夠與包被抗體相偶聯(連接)即可。例如，所述的固相載體選自:微量滴定板(又稱為多孔板，如96孔板)或微球。
[0123]在本發明的一個實例中，采用的固相載體是微量滴定板(酶標板)，所述的微量滴定板是一種聚苯乙烯板，規格是12X8可拆卸條板。
[0124]由于本發明的試劑盒采用的納米抗體配合單克隆抗體對于胱抑素C具有極其優異的結合特性(高特異性)。按照上述方法，只要設置已知濃度的抗原對照，制作濃度標準曲線，通過比照濃度標準曲線就可以得出待測樣品中的胱抑素C含量。
[0125]本發明的主要優點在于:
[0126](I)首次將納米抗體用于胱抑素C的檢測，使得胱抑素C檢測用的配對抗體的制備變得容易，所制備的試劑盒成本更低，且更易于儲藏和運輸。
[0127](2)由于本發明的試劑盒采用對胱抑素C具有高親和力，且高特異性識別胱抑素C不同表位的納米抗體和單克隆抗體，靈敏度和準確性非常高。其中尤以單抗5F2包被，納米抗體噬菌粒3-2檢測的效果最佳，其線性范圍值為0.5-31.3ng/ml，檢測的準確度為94.8%。
[0128](3)由于采用的納米抗體和單克隆抗體對于胱抑素C具有極其優異的結合特性，因此本發明的試劑盒可以極其快速地檢測出血液中胱抑素C。
[0129](4)由于納米抗體的優點，本發明試劑盒還具有簡便、穩定等特點。
[0130]下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0131 ] 實施例1、胱抑素C重組表達
[0132]一、聚合酶鏈式反應(PCR)擴增胱抑素C的全長基因
[0133](一 )模板:人腎上皮細胞293T總RNA。
[0134]( 二)引物設計:以成熟胱抑素C的全長基因363bp，設計出用于擴增除去信號肽序列后的胱抑素C基因的引物，上下游引物分別帶有內切酶BamHI和XhoI的酶切位點序列。
[0135]h游引物:5’ GGATCCAGTCCCGGCAAGCCG-3’ (SEQ ID NO: 12)；
[0136]下游引物:5’-CCTCGAGCTAGGCGTCCTGACAGGT-3’ (SEQ ID NO: 13)；；
[0137](三)抽提細胞總1?應，使用引物01丨80((11')18和反轉錄酶，反轉錄為(^嫩。
[0138]RT-PCR獲得成熟胱抑素C的基因(363bp)，并連接到克隆載體(pEASY-Tlsimple[購自北京全式金生物技術有限公司])，菌落PCR驗證后，測序結果證明克隆到的基因序列100%與胱抑素C已知基因序列(GenBank:BC013083.1)相同。
[0139]二、原核表達質粒pET_32a_Cys C的構建
[0140](一 )胱抑素C(Cys C)天然蛋白結構的分析:除掉信號肽的胱抑素C是包含120個氨基酸殘基和2對二硫鍵的非糖基化多肽鏈。[0141](二)內切酶BamHI和XhoI雙酶切含有目的基因的克隆載體和原核表達載體pET-32a (Novagen)，膠回收目的片段后使用T4連接酶連接，轉化感受態細胞，涂抗生素瓊脂板，經測序證明，成功構建了 pET-32a-Cys C。
[0142]三、胱抑素C在大腸桿菌中的表達、蛋白純化以及濃度測定
[0143](一)載體pET_32a_CysC在Rosseta (DE3)菌種中誘導出了融合蛋白的理論序列是:
[0144]MSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFffAEffCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSSPGKPPRLVGGPMDASVEEEGVRRALDFAVGEYNKASNDMYHSRALQVVRARKQIVAGVNYFLDVELGRTTCTKTQPNLDNCPFHDQPHLKRKAFCSFQIYAVPWQGTMTLSKSTCQDA-(SEQ ID NO:14)；
[0145]RG是凝血酶酶切位點，KA是腸激酶酶切位點。
[0146]凝血酶酶切蛋白之后，目的蛋白大小為16984Da，帶有多余蛋白序列。
[0147]( 二)融合蛋白誘導表達的誘導條件是:
[0148]I)培養基:含有100 μ g/ml氨芐青霉素的LB液體培養基；
[0149]2)誘導溫度:30°C ;
[0150]3)1卩丁6濃度:0.51111;
[0151]4)誘導時間:4小時。
[0152](三)包涵體的復性
[0153]I)蛋白誘導表達4小時后，5000rpm離心,5min。
[0154]2)按照裂解緩沖液:原菌液=1:4的體積比例，用緩沖液重懸菌體，加PMSF至終濃度0.5mM，超聲破碎3s超、5s停，總共100循環。
[0155]3) 12，OOOrpm, IOmin,舍上清,沉淀,按照洗漆緩沖液:原菌液=1: 10的體積比例加入含有2M尿素的洗滌緩沖液，超聲洗滌10分鐘。
[0156]4)洗滌液倒入透析袋中，4°C透析過夜，融合蛋白包涵體的復性率高達90%以上。
[0157](四)Ni2+_瓊脂糖凝膠親和層析柱對透析液中的含有組氨酸標簽的融合蛋白進行大量純化，純化的融合蛋白使用截留分子量為IOKDa的Millipore超濾管對表達的融合蛋白進行濃縮，提高融合蛋白濃度，經過考馬斯亮藍結合法的檢測，重組蛋白濃度高達3mg/ml ο
[0158](五)標簽蛋白的切除
[0159]由于融合蛋白帶有融合標簽蛋白序列，為了確保免疫動物時，抗體的專一性和高效價，所以應該盡量切除多余的外源蛋白序列，于是使用腸激酶對融合蛋白進行酶切，但發現酶切效果不佳，在37°C酶切12小時后，大部分融合蛋白未被切開，可能的原因是腸激酶的酶切位點被遮蔽在蛋白的三維結構內部，而凝血酶的酶切效果卻十分顯著，將融合標簽與目的蛋白酶切后，再次過Ni2+-NTA親和層析柱，將融合標簽吸附，將其與目的蛋白片段分開，超濾管再次濃縮目的蛋白。
[0160](六)胱抑素C標準品以及重組胱抑素C的免疫比濁法測定
[0161]使用抗胱抑素C包被的顆粒與抗原反應，反應體系發生的濁度變化，在546nm波長處吸光度值與胱抑素C的濃度成比例，用標準品標準曲線便可測定胱抑素C的濃度。試驗參數:37°C，波長546nm，樣品:試劑=1:100 ;吸光度范圍0-2A。[0162]胱抑素C標準品購自Enzo life sciences公司，是從人類的尿液里面純化而來，純度大于95%。所使用的試劑盒為上海景源醫療器械有限公司的《胱抑素C檢測試劑盒(免疫比濁法)》，胱抑素C濃度的有效檢測范圍是0.4-7.5 μ g/ml。
[0163]操作流程如下:
[0164]
【權利要求】
1.一種納米抗體，其特征在于，能高親和力特異性與人胱抑素C結合；且骨架區含有如SEQ ID NO: 11所示的共同特征氨基酸序列。
2.如權利要求1所述的納米抗體，其特征在于，在抗體超變區含有共同特征氨基酸序列:IT ~k -k GNT，其中代表一個隨機氨基酸。
3.權利要求1所述的納米抗體，其特征在于，具有SEQID NO: 1-10任一所示的氨基酸序列。
4.一種多核苷酸，其特征在于，其編碼權利要求1-3任一所述的納米抗體。
5.—種納米抗體曬菌體,其特征在于,其包括:曬菌體，以及展不于曬菌體表面的權利要求1-3任一所述的納米抗體。
6.一種特異性檢測人胱抑素C的試劑盒，其特征在于，包括: 權利要求1-3任一所述的納米抗體；或 權利要求5所述的任一納米抗體噬菌體。
7.如權利要求6所述試劑盒，其特征在于，還包括人胱抑素C特異的單克隆抗體。
8.如權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述的人胱抑素C特異的單克隆抗體選自: (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體；或` (b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
9.如權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒中包括: (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCC C201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體，和(b)表面展示有具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體，和(b)表面展示有具有SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體，和(b)表面展示有具有SEQ IDN0:8所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體；或 (a)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的納米抗體，和(b)表面展示有具有SEQ IDNO: 10所示的氨基酸序列的納米抗體的納米抗體噬菌體。
10.如權利要求6-9任一所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括固相載體，所述的納米抗體被固定于固相載體；或所述的單克隆抗體被固定于固相載體。
11.如權利要求6-9任一所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括: 能與所述的納米抗體或單克隆抗體連接的可檢測標記物，所述的可檢測標記物被連接于所述的納米抗體或單克隆抗體或分離地存在于試劑盒； 胱抑素C標準品；和/或 與可檢測標記物相對應的底物；和/或 酶聯免疫反應試劑；和/或 說明檢測人胱抑素C的方法的使用說明書。
12.—種單克隆抗體,其特征在于,所述的單克隆抗體選自: (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201239的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體；或 (b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201253的雜交瘤細胞株產生的單克隆抗體。
13.權利要求1-3任一所述的納米抗體或權利要求12所述的單克隆抗體的用途，用于制備特異性檢測人胱抑素C的檢測試劑盒。
14.產生特異性結合人胱抑素C的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該其特征在于，選自: (a)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201239的雜交瘤細胞株；或 (b)中國典型培養物保藏中心的保藏號為CCTCCC201253的雜交瘤細胞株。
15.一種檢測待測樣品中胱抑素C存在情況的方法，其特征在于，所述方法包括: 以權利要求9的試劑盒中(a)抗體作為包被抗體，(b)抗體作為檢測抗體，且在所述的檢測抗體上設置一可檢測標記物；通過雙抗夾心酶聯免疫反應法來檢測待測樣品中胱抑素C的存在情況。
【文檔編號】C12N5/20GK103509115SQ201210206704
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月21日 優先權日:2012年6月21日
【發明者】姚剛, 許超, 季軍捷 申請人:中國科學院上海生命科學研究院