專利名稱：抑制cyp2c8基因表達的方法
技術領域：
本發明屬于蛋白質和基因領域，特別涉及CYP2C8基因的調控。
背景技術：
RORy高表達于肝臟脂肪組織、心臟和骨骼肌，在發育、免疫和代謝過程中發揮重要的作用。除了在脂類和類固醇等代謝途徑中起重要調節作用外，在肝臟RORy通過結合到CYP2C8啟動子上其特異性原件RORE上，進而激活CYP2C8基因的轉錄，并最終調控許多當前正在臨床使用藥物的代謝。細胞功能幾乎總是生物大分子在組裝和通路上協同作用的結果，而蛋白復合物是亂中有序的動態結構，能將生物信息變成細胞的功能。已經發現了一些內源性或合成的RORy 配體，比如 7-oxygenated sterol、SR1078、T0901317 和 24S-0HC，這些配體經證實都能調節ROR Y的轉錄活性；Mi-2 0是唯一與ROR Y相互作用進而發揮抑制作用的蛋白。是 否還存在其他相互作用蛋白且參與調控CYP2C8基因的表達至今未有報道，

發明內容
本發明的目的之一在于提供提供一種抑制CYP2C8基因表達的方法，以及RIP140基因和HSP90的新應用，該方法和新應用為臨床用藥的作用靶標提供了新的思路。為實現上述目的，本發明的技術方案為抑制CYP2C8基因表達的方法，將RIP140的siRNA轉染入靶細胞I中，所述RIP140的干擾片段如SEQID NO :1、SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3中任一所示。所述RIP140的核苷酸序列如 NCBI Reference Sequence NM 003489. 3進一步，將HSP90的siRNA轉染入靶細胞II中，所述RIP140的干擾片段如SEQID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中任一所示，所述HSP90的核苷酸序列如NCBIReference Sequence NP 031381. 2。進一步，所述靶細胞為IfepG2細胞。進一步，所述方法還包括陽性對照組，所述陽性對照組具體為將ROR Y的siRNA轉染入H印G2細胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO :7、SEQ IDNO :8或SEQ ID NO:
9中任一所示，所述 ROR y 的核苷酸序列如 NCBI Reference Sequence :NM_005060. 3。進一步,在轉染HepG2細胞后,還包括鑒定步驟,具體為I)提取未轉染siRNA的H印G2細胞中的總RNA，再逆轉錄成cDNA為模板；以CYP2C8基因特異Q-PCR引物，進行PCR擴增；同時以人管家基因GAPDH作為參照物，進行相對定量分析；2)用雙Delta法進行相對定量分析，其計算公式為
其中，對照組目的基因指未轉染的H印G2細胞樣品，實驗組目的基因指CYP2C8，管家基因指GAPDH基因。進一步，所述CYP2C8基因特異Q-PCR引物，其上游引物為5，-agatcagaattttctcaccc-3，，其下游弓I物為5，-aacttcgtgtaagagcaaca-3，。進一步，步驟I)中，PCR擴增條件為:95°C，5 秒；57. 5°C，15 秒；72°C，20 秒；80°C，5秒；40個循環。
RIP140基因和/或HSP90在制備CYP2C8基因的介導基因中的應用。本發明的有益效果在于本發明用免疫共沉淀方法鑒定了 TAP/MS策略獲得的7個候選蛋白中只有RIP140和HSP90蛋白是真正的RORy相互作用蛋白，并進一步通過RNA干擾證實1 1 140和肥 90蛋白能上調1 ( ￥介導的CYP2C8基因的表達。這些結果支持了RORy與其相互作用蛋白結合形成復合體，進而發揮轉錄下游靶基因的作用。HSP90可能作為分子伴侶通過結合到RORY蛋白上，幫助RORy蛋白在肝臟代謝和其他生物活動中執行調節作用，而1 1 140在11印62細胞中則可能充當1 ( ￥蛋白的轉錄輔活化因子。在某些病理條件下，對獲得的RORy相互作用蛋白進行干擾或過表達，有可能成為臨床用藥的作用靶標，具有良好的推廣應用價值。


圖I為質譜測得的RIP140(上)和HSP90 ( T )蛋白m/z圖譜。圖2為co-IP對候選ROR y相互作用蛋白的驗證。圖3為針對ROR y、RIP140和HSP90基因各設計3個siRNA分子，轉染H印G2細胞后通過蛋白印跡分析檢測的各siRNA分子對靶基因ROR Y、RIP140和HSP90的抑制情況，C :HepG2 細胞(-);NC :irrelevant siRNA as negtive control ;#1, #2,和 #3 :分別代表ROR y、RIP140和HSP90基因對應的3個siRNA雙鏈；tubulin :為核蛋白表達內參對照。圖4為當RIP140或/和HSP90的表達被抑制后，對CYP2C8基因mRNA水平的表達影響的分析圖。
具體實施例方式試劑配制I. 5X 裂解緩沖液(200ml) :250mM Tris pH7. 5，25 %甘油，I % NP40，7. 5mM 氯化鎂，625mM氯化鈉，125mM氟化鈉，5mM釩酸鈉。先在71ml超純水中溶解氟化鈉和釩酸鈉，然后再溶解除了甘油外的其他試劑。然后每支50ml容量的塑料試管盛裝IOml該緩沖液置于-80°C保存。使用前，加超純水到50ml，加入蛋白酶抑制劑，ImM DTT02. 10XTEV酶切緩沖液100mM Tris pH7. 5，IM氯化鈉，I % NP40，5mM EDTA。過濾，保存于4°C冰箱。使用前，加ImM DTT0大規模擴增細胞第I天，細胞復蘇后培養于2只IOOmm培養皿中；第3天，培養的細胞更換新鮮完全培養基。在換液過程中，首先洗棄舊培養，接著用滴管吸取預孵熱的PBS輕輕沖刷細胞表面，去掉結合不牢的細胞及其他殘渣，最后加入新鮮的完全培養基;第4天，將2只100_培養皿中的細胞傳代至8只IOOmm培養皿中；第6天，8只培養皿中的細胞換液。同樣用PBS沖刷殘渣；第7天，將8只IOOmm培養皿中的細胞傳代至32只IOOmm培養皿中；第10天準備收獲細胞，可以獲得總量6 X IO8個細胞。
裂解細胞I)準備細胞裂解液融解5X裂解緩沖液，加4倍體積的超純水使裂解液稀釋成IX裂解緩沖液。加入終濃度為ImM DTT到IX裂解緩沖液中，同時加入蛋白酶抑制劑藥片，4°C旋轉混勻；2)經過大規模擴增并收獲的細胞，每2X IO8個細胞給予IOml I X裂解緩沖液，用滴管吹吸輕柔混勻；3)冰上孵育30min,間或用滴管吹吸輕柔混勻；4)20000g離心20min ；5)上清即為裂解的總蛋白，冰上小心吸取上清到干凈的50ml EP管中。如不立刻使用，液氮或_80°C中凍存，直到用TAP方法操作前取出。串聯親和純化I)預冷下列試劑、材料和儀器到4°C :超速離心機，低溫旋轉孵育儀，足夠用來洗滌IgG珠子量的5X裂解緩沖液，超純水，超速離心管；準備4X SDS和2X SDS上樣緩沖液；2)室溫融解液氮中取出的細胞總蛋白，當融解到僅存少量冰凍狀態的總蛋白時，將整個總蛋白置于冰上繼續解凍；3)融解完全的總蛋白倒入一只30ml的超速離心管中，4°C 120000g超速離心40min ；4)在15ml離心管中用含ImM DTT和ImM EDTA的IX裂解緩沖液洗IgG珠子，X3次；5)離心的總蛋白加到200 u I IgG瓊脂糖珠子(用裂解緩沖液配成50%懸漿)中，4°C旋轉結合2hr ；6) 300g離心3min,吸取100 U I上清做后續WesternBlotting分析；7)將IgG瓊脂糖珠子轉移到一個小的過濾柱里。取下柱子上端塞子，接上一只IOml的注射器。往里加IOml裂解緩沖液，然后取下下端塞子，依靠重力流動排掉柱子里的緩沖液；8)用5ml的酶切緩沖液洗IgG瓊脂糖珠子；9)當酶切緩沖液依靠重力流動從過濾柱中排盡后，重新合上柱子下端塞子。用400 ill含有IOOunits TEV蛋白酶的酶切緩沖液重懸IgG瓊脂糖珠子。合上柱子上端的塞子，于16°C旋轉結合Ihr ；10)在15ml離心管中用含ImM DTT的I XTAE緩沖液洗Streptavi din珠子，X3次；11)收集通過重力流動洗脫下的柱子里的液體；12)用400 ill的裂解緩沖液重懸IgG瓊脂糖珠子。4°C，300g離心柱子3分鐘。吸取上清，和先前洗脫的液體混合。取其中20 Ul做后續分析；13)向上一步所得混合洗脫液中加A 50 u I 洗過的 Streptavidin 珠子,4°C旋轉孵育 2hr ；14)用 IOml 含 ImM DTT 的 IXTAE緩沖液洗Sti^ptavidin珠子，X3次；15)產物用在SDS上樣緩沖液中水煮洗脫。蛋白印跡(WesternBlot)I)胞漿蛋白和核蛋白的提?、僖让赶囵B的HepG2細胞，計數按細胞數加入預冷的CERI (含蛋白酶抑制劑)，輕柔混勻，冰浴IOmin 往上步反應液中加入11 預冷的CER II，渦旋5sec，冰浴Imin ’④禍旋5sec, 16000g離心5min !⑤將上清(衆蛋白)迅速轉移至干凈的預冷的EP管中，冰浴待用或分裝_80°C凍存；⑥用100 u I預冷的NER重懸沉淀，渦旋15sec充分重懸沉淀，冰浴40min。每IOmin潤旋反應液15sec ’⑦16000g離心IOmin 上清為核蛋白，轉移至預冷的EP管中，冰浴待用或分裝_80°C凍存；⑨蛋白濃度檢測。2)蛋白質凝膠電泳
①電泳凝膠為NuPAGE4Novex 4-12% Bis-Tris Gel ;②在樣品蛋白中加入上樣緩沖液，水煮IOmin -’③12000g離心5min,取上清蛋白在凝膠加樣孔中按實驗分組要求加上蛋白樣品和預染分子量標準蛋白電泳。條件為恒壓200V，I小時；⑥電泳結束，卸下凝膠，用鑷子撬開塑料夾板，取出凝膠；3)電轉膜①取出的凝膠置于電轉緩沖液中平衡15min ;②PVDF膜依次處理甲醇，浸泡15sec ;超純水，漂洗3min ;電轉緩沖液中平衡15min ;③電轉“三明治”由正極向負極依次疊放順序為濾紙一凝膠一PVDF膜一濾紙；④電轉條件30V，Ihr ;⑤電轉結束，取出PVDF膜，甲醇短暫漂洗后再在超純水中漂洗Imin去掉電轉緩沖液。 4)封閉PVDF膜放入塑料封閉袋中，加入封閉液(含0. 05% Tween 20的BlockingBuffer)，室溫搖床上緩慢孵育I. 5-2hr或4°C過夜；5)孵一抗用封閉液按最適比例稀釋一抗后，在封閉袋中對PVDF膜進行一抗結合孵育，室溫2hr或或4°C過夜；6)洗一抗取出PVDF膜，于平皿中用TBST (含0. 05% Tween20的TBS)洗滌6min/次X5次；7)孵二抗用封閉液按I : 20000比例稀釋二抗后，在封閉袋中對PVDF膜進行二抗結合孵育，室溫Ihr ；8)洗二抗取出PVDF膜，于平皿中用TBST (含0. 05% Tween20的TBS)洗滌6min/次X5次；9)顯色將結合有一抗二抗的PVDF膜置于顯色底物ECL發光液中，避光孵育5min ；10)曝光擠除發光液，在暗室內用X光片曝光。一般曝光時間點設為8sec，30sec，lmin，5min等，具體曝光時間隨條帶的熒光強度改變；11)顯影定影曝光過的X光片于首先置于顯影液中顯影2min，經過自來水充分漂洗，最后置于定影液中定影2min。自來水漂洗后，掛于通風處晾干，掃描膠片結果。銀染I)固定50%甲醇、5%乙酸固定20min;2)洗滌50%甲醇洗滌lOmin，然后超純水洗滌2h或0. N. ；3)致敏0. 02%硫代硫酸鈉致敏Imin ；4)洗滌超純水洗滌2 X Imin ；5)銀染:0. 1% AgN03(冰硝酸銀溶液)4°C染色20min ；6)洗滌:超純水洗滌2 X Imin (第二次水洗前換盤)；7)顯色0.04<%甲醛、2%似20)3顯色；顯色過程中顯色液變渾濁后更換I次顯色液以降低背景；8)終止5%乙酸終止顯色，中途更換液體一次。最終的捕獲產物為蛋白復合物，利用SDS-PAGE對其進行分離，電泳過程中盡可能擴大這些復合物蛋白中的各蛋白成分在凝膠上的間距。對分離后的蛋白，用銀染方法在凝膠中將差異顯著的蛋白條帶顯示出來。結果如圖2-2顯示，通過TAP方法捕獲到HepG2細胞中8個差異顯著的候選ROR Y相互作用蛋白條帶。免疫共沉淀I)正常培養的HepG2細胞用胰酶消化后，計數取5X IO6個細胞；2)配置RIPA裂解液往裂解液中加入蛋白酶抑制劑和憐fe酶抑制劑，使抑制劑在裂解液中完全溶解；3)冰上裂解細胞，30min，間或渦旋混勻；4)細胞裂解物4°C，IOOOOg離心20min，取上清即為提取的總蛋白；5)BCA方法進行總蛋白定量；6)取2X500 iig蛋白總量(其中一個為同型IgG對照組)，用加了各種蛋白酶抑制劑的裂解液或PBS補足到500 iil，使總蛋白濃度為Iii g/U I ；7)結合RORy抗體的ProteinA/G瓊脂糖珠的準備7. IProteinA/G 瓊脂糖珠洗漆①取ProteinA/G瓊脂糖珠50 ii I (50%懸衆)X 2,用于預清除蛋白樣品；②取該瓊脂糖珠90 ill X 2，用于結合一抗；③每樣用Iml預冷PBS洗瓊脂糖珠3次4°C旋轉混合IOmin/次,3000g離心2min。
最后一次凈棄上清；7. 2結合ROR y抗體ProteinA/G瓊脂糖珠的制備 ①加500 U I預冷PBS和5 ii I ROR y抗體(濃度為0. 2 ii g/ ii I,每管一抗總量約
0.5-2 V- g)到洗好的45 u I ProteinA/G瓊脂糖珠中，室溫旋轉結合Ihr ；②Iml預冷PBS洗珠子4次4°C旋轉混合IOmin/次,接著3000g離心2min。最后一次盡棄上清；8)總蛋白中非特異結合蛋白預清除①將500 ill濃度為liig/ill的總蛋白X 2，加入到約22. 5 ii L洗過的Protein A/G瓊脂糖珠X 2中，4°C旋轉結合I小時；②4°C，3000g離心2min，上清為預清除的總蛋白；9)經過預清除的總蛋白溶液加入到結合ROR Y抗體的ProteinA/G瓊脂糖珠中，4 °C旋轉結合過夜。10) Iml預冷PBS洗珠子4次4°C旋轉混合IOmin/次，接著3000g離心2min。11)用干凈的微量注射器徹底吸棄上清，瓊脂糖珠上結合的蛋白即為RORy抗體最終捕獲的產物。RNA 干擾I)干擾引物的設計上海英俊生物公司設計并合成ROR y、RIP140和HSP90小干擾RNA雙鏈，每個基因設計3個干擾片段，如下
權利要求
1.抑制CYP2C8基因表達的方法，其特征在于將RIP140的siRNA轉染入靶細胞I中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO USEQ ID NO 2和SEQ IDNO 3中任一所示。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于將HSP90的siRNA轉染入靶細胞II中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO :4、SEQ ID NO 5或SEQ ID NO 6中任一所示。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于所述靶細胞為HepG2細胞。
4.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法還包括陽性對照組，所述陽性對照組具體為將RORy的siRNA轉染入H印G2細胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ IDNO :7、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 中任一所示。
5.根據權利要求I所述的方法，其特征在于在轉染H印G2細胞后，還包括鑒定步驟，具體為 1)提取未轉染siRNA的HepG2細胞中的總RNA，再逆轉錄成cDNA為模板；以CYP2C8基因特異Q-PCR引物，進行PCR擴增；同時以人管家基因GAPDH作為參照物，進行相對定量分析； 2)用雙Delta法進行相對定量分析，其計算公式為
6.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述CYP2C8基因特異Q-PCR引物，其上游引物為 5’ -agatcagaattttctcaccc-3’，其下游引物為5’ _aacttcgtgtaagagcaaca_3’。
7.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟I)中，PCR擴增條件為95°C，5秒；57. 5°C, 15 秒；72°C, 20 秒；80°C，5 秒；40 個循環。
8.RIP140基因和/或HSP90在制備CYP2C8基因的介導基因中的應用。
全文摘要
本發明涉及基因領域，特別涉及抑制CYP2C8基因表達的方法，具體為將RIP140的siRNA轉染入靶細胞中，所述RIP140的干擾片段如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2和SEQ ID NO3中任一所示，所述RIP140的核苷酸序列如SEQ IDNO10所示；本發明證實RIP140和HSP90蛋白是真正的RORγ相互作用蛋白，進一步通過RNA干擾證實RIP140和HSP90蛋白能上調RORγ介導的CYP2C8基因的表達。這些結果支持了RORγ與其相互作用蛋白結合形成復合體，進而發揮轉錄下游靶基因的作用。
文檔編號C12N15/87GK102732562SQ20121021584
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月27日 優先權日2012年6月27日
發明者倪東京, 倪兵, 吳玉章, 唐艷, 張軼, 田志強, 田易, 黃澤民 申請人:中國人民解放軍第三軍醫大學