一種細(xì)菌生物膜研究模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于：由包埋有細(xì)菌的海藻酸鹽-聚陽離子絡(luò)合微膠囊形成，并培養(yǎng)得到，微膠囊內(nèi)菌體增殖后即表現(xiàn)出細(xì)菌生物膜特點。該模型可用于細(xì)菌生物膜的形成過程、細(xì)胞生物膜的特異基因表達(dá)及相關(guān)信號系統(tǒng)的研究。
【專利說明】一種細(xì)菌生物膜研究模型
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)菌生物膜研究模型，具體地說是一種具有細(xì)菌生物膜功能，并可研究細(xì)菌生物膜生長特性的模型。
【背景技術(shù)】
[0002]在自然界、某些工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境以及人和動物的體內(nèi)外，絕大多數(shù)細(xì)菌是附著在有生命或無生命物體的表面，以生物膜(biofilm)的方式生長[CostertonJ.ff., LewandowskiZ., CaldwelI D.E., KorberD.R., Lappin-Scott H.M., Microbialbiofilms, Annual Review ofMicrobiology, 1995, 49:711-745.] ? 細(xì)菌生物膜是指附著于生命或無生命物體表面被細(xì)菌胞外大分子包裹的有組織的細(xì)菌群體[O’TooleG.A.,Kaplan H.B., Kolter R., Biofilm formation asmicrobialdevelopment, AnnualReview of Microbiology, 2000，54:49-79]。生物膜中水分含量可高達(dá) 97 %,除了水和細(xì)菌外，生物膜還含有細(xì)菌分泌的大分子多聚物、吸附的營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物及細(xì)菌裂解產(chǎn)物等。生物膜的形成會使各種管道發(fā)生嚴(yán)重腐蝕，水質(zhì)變差；致病菌在硬組織和醫(yī)療器械表面形成的生物膜往往導(dǎo)致感染，而感染增強了細(xì)菌的耐藥性和對宿主免疫應(yīng)答的抵御[Jesaitis AJ, Franklin MJ, Berglund D, et al, Compromisedhost defense on Pseudomonasaeruginosa biofilms:characterization of neutrophil andbiofilm interactions, J.1mmunol, 2003, 171(8):4329-4339];形成生物膜的細(xì)菌對高溫、高滲、強酸等脅迫環(huán)境的抗性也明顯提高[Latha Sabikhi, R.Babu,D.K.Thompkinson,Suman Kapila,Resistance of Mi croencapsulatedLactobacillus acidophil us LAlto Processing Treatments and Simulated GutConditions, FoodBioprocess Technol, 2010, 3:586-593]。研究發(fā)現(xiàn)，與浮游狀態(tài)同一細(xì)菌相比，生物膜細(xì)菌的基因表達(dá)、信號傳導(dǎo)和代謝特點均會有明顯不同[An D, Parsek MR, Thepromise and peril oftranscriptional profiling in biofilm communities, CurrOpinMicrobiol, 2007, 10(3):292-6]。所以，如何在體外環(huán)境模擬生物膜狀態(tài)及制備生物膜成為了生物膜研究的一個重要方向。
[0003]目前體外構(gòu)建生物膜的方法多數(shù)是采用將菌懸液涂于載玻片上，或細(xì)胞培養(yǎng)板中靜置培養(yǎng)得到生物膜。此種方法得到的生物膜不易控制，制備量少，不能滿足大量使用的需求。此外，細(xì)菌在生物膜內(nèi)的生長呈現(xiàn)三維生長模式，而目前方法不能完全模擬細(xì)菌在生物膜內(nèi)的這種生長方式。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]針對上述問題，本發(fā)明提出一種生物膜模型。其優(yōu)點是可按需要作不同菌株組合，模型內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過生長繁殖，形成生物膜，細(xì)胞密度高，細(xì)胞狀態(tài)與天然生物膜中細(xì)胞狀態(tài)相似。微囊膜主要成分為多糖類物質(zhì)，與生物膜成分相近。
[0005]技術(shù)方案:[0006]本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種用于體外研究細(xì)菌生物膜的三維模型，其特征在于，具體步驟為:
[0007]A:按106_108CFU/mL海藻酸鈉的初始接種量將微生物細(xì)胞混懸在海藻酸鈉溶液(0.l_50g/L)中，制備海藻酸鹽微球，稱之為A微球。其中，海藻酸鹽微球的制備方法包括靜電液滴法、銳孔擠出法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內(nèi)部凝膠化法或膜乳化法；
[0008]B:將上述水凝膠微球浸入聚陽離子溶液中，微球與聚陽離子溶液體積比為1:1~1:40,反應(yīng)1-60分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊。取出用生理鹽水洗滌2-3次，稱之為B微球；
[0009]C:將第二步中的B微球浸入金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠。參與液化反應(yīng)的有機金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA。微膠囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1-1:40，反應(yīng)1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊，稱之為C微球；
[0010]D:將B微球或C微球按照5-15%的體積接種到相應(yīng)于可用于細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間依據(jù)所選定的細(xì)菌細(xì)胞確定。培養(yǎng)至細(xì)菌細(xì)胞為
IX IO9-1 X IO12細(xì)胞/毫升微球時結(jié)束培養(yǎng)。
[0011]其中，培養(yǎng)的細(xì)胞是任何可以產(chǎn)生生物膜的一種或多種細(xì)菌。如大腸桿菌(Escherichia Coli)、綠胺桿菌(Pseudomonas aeruginosa)、乳酸桿菌(Lactobacilluslactis)、蘇云金芽抱桿菌(BaciIIusthuringiensis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、等相關(guān)細(xì)菌菌株。
[0012]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和效果: [0013]1.生物膜載體微膠囊的 囊膜為生物多糖類物質(zhì)，與天然生物膜成分相似，可以模擬生物膜。
[0014]2.微生物在微膠囊內(nèi)呈三維生長方式，與自然環(huán)境生物膜內(nèi)微生物的生長過程和生長狀態(tài)更接近，可以模擬微生物在生物膜中的生長狀態(tài)。
[0015]3.本發(fā)明產(chǎn)品的制備過程條件溫和，有利于細(xì)胞活性的保持。
[0016]4.模型制備工藝簡便，成本較低，可實現(xiàn)高通量大規(guī)模制備。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為海藻酸鹽-聚陽離子微膠囊體系中培養(yǎng)綠膿桿菌不同時間菌體在微膠囊內(nèi)生長過程圖；
[0018]圖2為微囊化培養(yǎng)綠膿桿菌經(jīng)模擬胃腸液處理后與游離菌體活率比較圖。
【具體實施方式】
[0019]以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0020]實施例1
[0021]一種高通量高活性細(xì)菌生物膜模型，具體步驟為:
[0022]第一步:將5X IO8個大腸桿菌細(xì)胞混懸在ImL海藻酸鈉溶液(8g/L)中，利用靜電液滴法使液滴噴射入1.0moI/L的CaCl2溶液，反應(yīng)30min，得到海藻酸鈣凝膠微球粒徑為300 μ m粒徑分布呈正態(tài)分布，具有良好的單分散性；[0023]第二步:將上述水凝膠微球浸入質(zhì)量濃度0.5%殼聚糖溶液中，微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，此時得到海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。取出用生理鹽水洗滌；
[0024]第三步:將第二步中的微膠囊浸入40-70mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠，反應(yīng)5分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊；
[0025]第四步:將第三步制備的微膠囊按照10%的體積接種到大腸桿菌LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為3 X IO11。
[0026]微囊化培養(yǎng)后的大腸桿菌在與細(xì)菌生物膜形成過程中菌體代謝相關(guān)的SdiA基因、tnaC基因、tnaA基因及tnaB基因表達(dá)與游離培養(yǎng)相比均上調(diào)5倍以上。(試驗方法參考文獻(xiàn):Jintae Lee, ToshinariMaeda et al, Reconfiguring the quorum-sensingregulator SdiAof Escherichia coli to control biofilm formation via indoleandN-acylhomoserine lactones, Applied and EnvironmentalMicrobiology, 2009, p.1703-1716)
[0027]實施例2
[0028]第一步:將5X108乳酸菌細(xì)胞混懸在ImL混合有0&0)3的海藻酸鈉溶液(8g/L)中，海藻酸鈉與油相體積比為1:5，表面活性劑添加量為0.5% (v/v),乳化20min，加入HAC引發(fā)凝膠化反應(yīng)。得到海藻酸鈣水凝膠微球；
[0029]第二步:將上述水凝膠微球浸入到質(zhì)量濃度0.3%殼聚糖溶液中，微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應(yīng)20分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊。取出用生理鹽水洗漆; [0030]第三步:將第二步中的微膠囊浸入40-70mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠，反應(yīng)5分鐘， 取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊；
[0031]第四步:將第三步制備的微膠囊按照20%的體積接種到乳酸菌MRS培養(yǎng)基中，37°CU70rpm厭氧培養(yǎng)48小時，培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為2X1011。
[0032]培養(yǎng)結(jié)束，微囊化乳酸菌經(jīng)培養(yǎng)后，與生物膜形成相關(guān)的IuxS基因表達(dá)與游離培養(yǎng)相比上調(diào)8倍，群體感應(yīng)的信號分子A1-2濃度隨培養(yǎng)時間延長也呈上升趨勢。(試驗方法參考文獻(xiàn):SaloomehMosleh1-Jenabian, Klaus Gori, Lene Jespersen, A1-2 signallingisinduced by acidic shock in probiotic strains ofLactobacillus spp., InternationalJournal of Food Microbiology, 2009, 135, 295-302.)
[0033]實施例3
[0034]第一步:將5X IO8鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞混懸在IOmL海藻酸鈉溶液(8g/L)中，海藻酸鈉與油相體積比為1:10，表面活性劑添加量為0.1 (v/v)乳化IOminJaA CaCl2引發(fā)凝膠化反應(yīng)。得到海藻酸鈣水凝膠微球；
[0035]第二步:將上述水凝膠微球浸入質(zhì)量濃度0.3%聚賴氨酸溶液中，微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)15分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊。取出用生理鹽水洗漆;
[0036]第三步:將第二步制備的微膠囊按照10%的體積接種到沙門氏菌屬BD培養(yǎng)基中，37°C、200rpm厭氧培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為3 X IO11。
[0037]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微囊化培養(yǎng)組中鼠傷寒沙門氏菌與生物膜形成相關(guān)的norB，norC和seo基因表達(dá)分別上調(diào)了 20、6、和7倍。(試驗方法參考文獻(xiàn)=Xinlong Heand Juhee Ahn, Differential geneexpression in planktonic and biofilm cellsof multipleantibiotic-resistant Salmonella Typhimurium andStaphy1coccusaureus, Fems Microbiology Letters, 2011, 325 (2):180-188.)
[0038]實施例4
[0039]第一步:將5X IO8假單胞菌細(xì)胞混懸在IOmL海藻酸鈉溶液(8g/L)中，海藻酸鈉與油相體積比為1:10,表面活性劑添加量為1% (v/v)乳化20min，加入CaCl2引發(fā)凝膠化反應(yīng)。得到海藻酸鈣水凝膠微球；
[0040]第二步:將上述水凝膠微球浸入質(zhì)量濃度I %聚賴氨酸溶液中，微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊。取出用生理鹽水洗漆;
[0041]第三步:將第二步制備的微膠囊按照5-15%的體積接種到假單胞菌LB培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為I X 1011。
[0042]結(jié)果發(fā)現(xiàn)，微囊化培養(yǎng)組中，假單胞菌菌株對工業(yè)污水中甲苯的去除率與游離菌體相比提高了 20%，說明微膠囊內(nèi)的菌株自身提高了對污水處理這種脅迫環(huán)境的抗性，模型培養(yǎng)過程菌體生物膜的形成過程也提高了菌體對甲苯的分解率。(試驗方法參考文獻(xiàn):Cao Mingfu, Zhu Xun et al., Biofilm formation of Membrane Bioreactors (MBR)for toluene removal, Chinese Journal of Applied andEnvironmentalBiology, 2011，17(5):731-735.)
[0043]實施例5
[0044]第一步:將5X IO8綠膿桿`菌細(xì)胞混懸在IOmL海藻酸鈉溶液(8g/L)中，海藻酸鈉與油相體積比為1:10，表面活性劑添加量為0.5% (v/v)乳化20min，加入CaCl2引發(fā)凝膠化反應(yīng)。得到海藻酸鈣水凝膠微球；
[0045]第二步:將上述水凝膠微球浸入質(zhì)量濃度0.7%聚賴氨酸溶液中，微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚賴氨酸微膠囊。取出用生理鹽水洗漆;
[0046]第三步:將第二步中的微膠囊浸入40-70mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠，反應(yīng)10分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊；
[0047]第四步:將第三步制備的微膠囊按照10%的體積接種到綠膿桿菌BD培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為2.1XlOll0
[0048]培養(yǎng)結(jié)束后，微囊化組中，產(chǎn)生生物膜綠膿桿菌對抗生素及高滲透壓的抗性分別提高了 3倍和4.5倍，為這種常見的病原菌的抗生素抗性機制和逆境高抗性機制提供了理論依據(jù)。(試驗方法參考文獻(xiàn):WiIIiams P, Camara M, Quorum sensing andenvironmentaladaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatorynetworksand multifunctional signal molecules, Curr OpinMicrobiolj 2009, 12 (2):182-191.)
[0049]實施例6
[0050]第一步:將5 X IO8金黃色葡萄球菌細(xì)胞混懸在ImL海藻酸鈉溶液(8g/L)中，利用靜電液滴法使液滴噴射入1.0mol/L的CaCl2溶液，反應(yīng)30min，得到海藻酸鈣凝膠微球粒徑為300 μ m粒徑分布呈正態(tài)分布，具有良好的單分散性；
[0051]第二步:將上述水凝膠微球浸入質(zhì)量濃度0.4%殼聚糖溶液中，微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應(yīng)10分鐘，此時得到海藻酸鈉-殼聚糖微膠囊。取出用生理鹽水洗滌；
[0052]第三步:將第二步中的微膠囊浸入40-70mmol/L檸檬酸鈉溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠，微膠囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:10，反應(yīng)10分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊；
[0053]第四步:將第三步制備的微膠囊按照10%的體積接種到金黃色葡萄球菌BD培養(yǎng)基中，37°C、200rpm培養(yǎng)48小時。培養(yǎng)結(jié)束細(xì)菌細(xì)胞(細(xì)胞/毫升微膠囊)為2 X IO11。
[0054]培養(yǎng)結(jié)束，微囊化組中，金黃色葡萄球菌的致病基因rot和arl的表達(dá)與游離培養(yǎng)相比分別上調(diào)了 5倍和2倍。這些基因處于生物膜形成基因下游，受生物膜形成的控制，只有生物膜形成基因表達(dá)，才會啟動致病基因的表達(dá)。(試驗方法參考文獻(xiàn):Cotar, AL, Dinu, S，Chifiriuc, MC, et al, Molecular markers ofquorum-sensing andvirulence gene regulators in Staphylococcus aureusstrainsisolated from biofilm associated infections, RomanianBiotechnologicalLetters, 2008，13(3):3771-3778.)
【權(quán)利要求】
1.一種細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于: 由包埋有細(xì)菌的海藻酸鹽-聚陽離子絡(luò)合微膠囊形成，并培養(yǎng)得到，微膠囊內(nèi)細(xì)菌菌體增殖后即表現(xiàn)出細(xì)菌生物膜特點。
2.按照權(quán)利要求1所述的細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于:微膠囊內(nèi)包埋的細(xì)菌是任何可以產(chǎn)生生物膜的一種或二種以上細(xì)菌；其為大腸桿菌(Escherichia Coli)、綠胺桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、乳酸桿菌(Lactobacillus lactis)、蘇云金芽抱桿菌(Bacillus thuringiensis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等相關(guān)細(xì)菌菌株。
3.按照權(quán)利要求1或2所述細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于:該模型的制備方法如下: A:按106-108CFU/mL海藻酸鈉溶液的初始接種量將細(xì)菌細(xì)胞混懸在0.l_50g/L海藻酸鈉溶液中，制備包埋細(xì)菌細(xì)胞的海藻酸鹽微球，稱之為A微球； B:將上述A微球浸入質(zhì)量濃度0.1-10%殼聚糖或聚賴氨酸的聚陽離子溶液中，微球與聚陽離子溶液體積比為1:1-1:40，反應(yīng)1-60分鐘，此時得到海藻酸鈉-聚陽離子微膠囊；取出用生理鹽水洗滌2-3次，稱之為B微球； C:將B微球浸入有機金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內(nèi)部的海藻酸鹽凝膠；參與液化反應(yīng)的有機金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA溶液出微球與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1-1:40，反應(yīng)1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內(nèi)部液態(tài)核心的微膠囊，稱之為C微球； D:將B微球或C微球按照5-15%的體積接種到相應(yīng)于可用于細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至細(xì)菌細(xì)胞為IXIO9-1 X IO12細(xì)胞/毫升微球時結(jié)束培養(yǎng)。
4.按照權(quán)利要求3所述細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于: 所述聚陽離子溶液為質(zhì)量濃度0.1-10%殼聚糖溶液或質(zhì)量濃度0.1-10%聚賴氨酸溶液。
5.按照權(quán)利要求3所述細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于:包埋細(xì)菌細(xì)胞的海藻酸鹽微球的制備方法可采用靜電液滴法、銳孔擠出法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內(nèi)部凝膠化法或膜乳化法。
6.按照權(quán)利要求3所述細(xì)菌生物膜研究模型，其特征在于: 細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間依據(jù)所選定的細(xì)菌細(xì)胞確定。
7.—種權(quán)利要求1所述的生物膜模型，其特征在于:該模型可用于細(xì)菌生物膜的形成過程、細(xì)胞生物膜的特異基因表達(dá)及相關(guān)信號系統(tǒng)的研究。
【文檔編號】C12N11/10GK103509781SQ201210222025
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月29日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月29日
【發(fā)明者】馬小軍, 宋慧一, 于煒婷 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所