專利名稱：禽傳染性支氣管炎病毒h120毒株的pcr檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及禽類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的PCR檢測弓I物及檢測方法。
背景技術(shù)：
禽傳染性支氣管炎(IB)是由禽傳染性支氣管炎病毒 (IBV)引起的ー種急性、高度接觸性傳染病。在規(guī)模化飼養(yǎng)條件下，禽傳染性支氣管炎感染率很高，該病的死亡率為1(Γ30%，毎年造成的經(jīng)濟損失超過十億元。Η120株是最早應(yīng)用于預防IB的弱毒疫苗，也是目前應(yīng)用最為廣泛的IBV弱毒疫苗之一，基因分型屬于IBV第V分支，其安全性好，毒カ穩(wěn)定。由于生產(chǎn)中常用的禽傳染性支氣管炎疫苗一般為新支ニ聯(lián)弱毒活苗，家禽體內(nèi)在一段時間內(nèi)都存在疫苗毒的活毒，因此臨床上分離到的IBV有可能是疫苗毒，也有可能是野毒株。現(xiàn)階段對于疫苗株和野生病毒株的區(qū)分方法是經(jīng)過RT-PCR，擴增所得產(chǎn)物直接測序或者經(jīng)過克隆之后測序，再經(jīng)過序列分析才能得出結(jié)果，通常需要3 7天的時間，給IBV的快速檢測帶來不便。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，提供可以快速區(qū)分IBV 120株與其他野生株的RT-PCR引物。本發(fā)明的另ー目的是提供ー種IBV 120株的RT-PCR檢測方法。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)上述目的
禽傳染性支氣管炎病毒Η120毒株的RT-PCR檢測引物，有兩對，引物的核苷酸序列分別為SEQ ID NO: I 2和SEQ ID Ν0:3 4。這兩對引物是根據(jù)IBV Η120毒株序列(Genbank :FJ888351)分別在SI基因和3’ -LTR基因設(shè)計的。一種禽傳染性支氣管炎病毒Η120毒株的RT-PCR檢測方法，是以待檢樣品RNA為模板，用權(quán)利要求I所述的兩對引物進行RT-PCR擴增，如果擴增產(chǎn)物片段分別為653bp和230bp，則待檢樣品中有禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株。上述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法中，PCR反應(yīng)體系含有一步法 PCR 混合酶(PrimeScipt I Step Enzyme Mix)、緩沖液(2X1 Step Buffer)、SEQ IDNO: I 4所示引物、樣品RNA和無RNA酶的水(RNase Free)。上述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法中，RT-PCR的反應(yīng)程序優(yōu)選為
(1)逆轉(zhuǎn)錄50°C30min ；
(2)預變性92°C 4min ；
(3)變性94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec ;共進行 30 個循環(huán)；(4)延伸72°C IOrnin0 (min表示分鐘，sec表示秒)。上述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法，擴增的653bp目的片段為SI基因，核苷酸序列為SEQ ID NO: 5 ;230bp的目的片段為3’UTR基因，核苷酸序列為SEQ ID NO:6。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果
本發(fā)明的引物特異性高，且片段小，整個RT-PCR過程可以在疒2. 5小時內(nèi)完成，不需要經(jīng)過測序公司測序就能快速鑒定出IBV的H120疫苗毒株，為臨床檢測節(jié)省大量時間。


圖I. RT-PCR檢測野生毒株和疫苗株電泳結(jié)果，其中D為大華農(nóng)新城疫、傳染性支氣管炎ニ聯(lián)活疫苗(購自廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司；生產(chǎn)批號201136) ；1 第五分支野毒；M DL2000 Marker。 圖2. RT-PCR特異性驗證電泳結(jié)果，其中1-4 :第一分支野毒；5_8 :第二分支野毒；
9-12 :第三分支野毒；13-16 :第四分支野毒；17-20 :第五分支野毒；M IOObp Marker ；D :大華農(nóng)新支ニ聯(lián)苗:哈獸研新支ニ聯(lián)苗；N :陰性對照。
具體實施例方式實施例I
I試驗材料
1.1主要試劑與儀器
AxyPrep 體液病毒 DNA/RNA 小量試劑盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250), TaKaRaPrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRa Code:DRRO55A), Thermo 高速低溫離心機，Thermo PCR 儀。I. 2 毒株
臨床分離到的各分支IBV野毒株，大華農(nóng)新城疫、傳染性支氣管炎ニ聯(lián)活疫苗(H120株+Lasota株；購自廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司；生產(chǎn)批號201136)，哈獸研大華農(nóng)新城疫、傳染性支氣管炎ニ聯(lián)活疫苗(商品名“新支匹克”;H120株+Lasota株；購自中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所；生產(chǎn)批號110514)。I. 3引物設(shè)計
根據(jù)IBV H120毒株序列(Genbank FJ888351)分別在SI基因和3，-LTR基因各設(shè)計一對引物其中S1+S2為第一對引物，擴增部分SI基因，目的條帶預期大小為653bp ；S3+S4為第二對引物，擴增部分3’-UTR基因目的條帶預期大小為230bp。只有同時擴增出兩條目的產(chǎn)物時，才可判定為H120毒株。引物序列丨擴增片段"""目的條帶
序號大小
51TGGTGGTCGTGTTGTTAATG (SEQID NO:I)SI 基因 653bp
52TCTGGACACCACTAGGATTTG (SEQ IDH0:2)
53TTTCCAACTTAACATCATGGAC (SEQ ID N0:3)3:UTR.基因 230bp
54CTTCCTTGATTCTTATTGATACTCTA (SEQ ID N0:4)2試驗方法
2.I RNA模板制備
使用AxyPr印體液病毒DNA/RNA小量試劑盒(Cat No. AP-MN-BF-VNA-250)提取模板RNA，-70°C保存。2.2 PCR 反應(yīng)
反應(yīng)體系使用 TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit Ver. 2 (TaKaRaCode:DRR055A) PCR試劑盒，反應(yīng)體系為50 μ L體系，具體如下
序號I組分I體積
1PrimeSciptIStepEnzymeMix2 μ L
22 XIStepBuffer25 μ L
3Sl(IOuM)^luL
4S2(10uM):1μ
5S3(10u Μ)^luL
6S4(10uM):1μ
7模板 RNA: Γ3 μ L (約 500ng)
8RNaseFree補足到 50 μ L
反應(yīng)條件逆轉(zhuǎn)錄50°C 30min ;預變性92°C 4min ;擴增30個循環(huán)(包括變形94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec);最后延伸72°C IOmin0PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。3實驗結(jié)果
經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，PCR反應(yīng)獲得的目的條帶符合預期大小(圖1)，大華農(nóng)新支ニ聯(lián)苗可以擴增出653bp和230bp兩條帶，而臨床上分離到的第五分支野毒只出現(xiàn)230bp條帶。圖2顯示RT-PCR特異性驗證結(jié)果，顯示只有大華農(nóng)新支ニ聯(lián)苗和哈獸研新支ニ聯(lián)苗的擴增產(chǎn)物有兩條條帶，特異性高。
權(quán)利要求
1.禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測引物，其特征在于兩對引物核苷酸序列分別為SEQ ID NO: I 2和SEQ ID N0:3 4。
2.一種禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法，其特征在于以待檢樣品RNA為模板，用權(quán)利要求I所述的兩對引物進行RT-PCR擴增，如果同時擴增出653bp和.230bp兩個長度的目的片段，則說明待檢樣品中有禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系含有ー步法PCR混合酶、緩沖液、SEQ ID NO: Γ4所示引物、樣品RNA和無RNA酶的水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法，其特征在于RT-PCR的反應(yīng)程序為 (1)逆轉(zhuǎn)錄50°C30min ； (2)預變性92°C 4min ； (3)變性94°C30sec ;退火55°C 30sec ;延伸72°C 45sec ;共進行 30 個循環(huán)； (4)延伸72°CIOmin0
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的RT-PCR檢測方法，其特征在于擴增的653bp目的片段為SI基因，核苷酸序列為SEQ ID NO: 5 ;230bp的目的片段為.3，UTR基因，核苷酸序列為SEQ ID NO:6。
全文摘要
本發(fā)明公開了禽傳染性支氣管炎病毒H120毒株的PCR檢測引物及檢測方法，屬于禽類病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測引物為兩對，核苷酸序列分別為SEQIDNO:1~2和SEQIDNO:3~4。使用該兩對引物，用待檢樣品的RNA為模板進行RT-PCR擴增，如果同時擴增出653bp和230bp兩條目的產(chǎn)物，即可判定待檢樣品中含有IBVH120毒株。本發(fā)明的引物特異性高，且片段小，整個RT-PCR過程可以在2~2.5小時內(nèi)完成，不需要經(jīng)過測序公司測序就能快速鑒定出IBV的H120疫苗毒株，為臨床檢測節(jié)省大量時間。
文檔編號C12N15/11GK102719567SQ20121023131
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月5日
發(fā)明者王峰 申請人:廣東溫氏食品集團有限公司