專利名稱：一種雞傳染性支氣管炎病毒ha抗原的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種抗原的制備方法，具體涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法。屬于生物工程領域，
背景技術：
雞傳染性支氣管炎(IB)是由雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)引起的一種急性高度接觸性傳染病。表現為咳嗽、噴嚏、氣管羅音等癥狀。產蛋雞產蛋下降，產畸形蛋，幼雞表現特別嚴重。某些毒株引起腎臟和腸道疾病。雞傳染性支氣管炎給世界養禽業帶來了嚴重的經濟損失。由于IBV具有高度的變異性，故其血清型眾多，各種血清型間的交叉保護反應較低，疫苗免疫常常失去預期的效果。多數IBV表面沒有凝集原，對動物紅細胞無自然血凝特性，病毒必須濃縮后經酶處理方能表現出血球凝集(HA)活性，并且這種HA活性能被特異性IBV抗血清所抑制。根據這一特性，國內外學者建立了檢測IBV抗體血凝抑制(HI)試驗的方法。該方法快速、簡便、特異性強，目前已應用于IBV診斷及抗體檢測。目前HA抗原液的制作方法大多仍是超速離心濃縮，采用磷脂酶C處理，滅活常用滅活劑來滅活，穩定劑加入殼聚糖等，原有這種方法主要存在的問題有(1)由于磷脂酶C價格高，提高了 HA抗原液的成本。(2)抗原液經滅活劑滅活后降低了抗原液的血凝價。(3)殼聚糖不溶于水。(4)超速離心抗原效價低。

發明內容
本發明的目的是為了解決上述生產實際中存在的問題，提供一種低成本、效價高且穩定、安全性好的雞傳染性支氣管炎病毒HA穩定抗原的制備方法。為了實現上述目的，本發明的一種雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法是按下述步驟進行的(1)病毒增殖將病毒株用無菌生理鹽水按體積比1 50倍稀釋后，經尿囊腔接種11日齡SPF 雞胚，每胚0. ImL,置37°C繼續孵育，棄去24h前死胚，3 !后取出所有胚放入4°C冰箱過夜， 收集尿囊液，4°C保存備用；(2)病毒液濃縮與A型產氣莢膜梭菌培養液處理將收集的尿囊液以3000-5000rpm高速冷凍離心30min，取上清液以 20000-25000rpm高速冷凍離心50-60min后，棄去上清液，沉淀用支氣管尿囊液充分懸浮， 支氣管尿囊液的添加量是第一次離心后所取上清液體積的1/200-1/100，懸浮液用透析袋進行濃縮；然后按濃縮后液體體積的10% -50%加入產氣莢膜梭菌培養液，充分混合后置 37°C水浴作用2-3h，每隔20min震蕩一次，作用完畢后取出病毒液置4°C保存備用；(3)抗原的滅活(4)抗原的穩定按病毒液與穩定劑體積比3-10 1的比例加入穩定劑，震蕩混勻后利用冷凍干燥技術凍干后即得到雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原；(5)使用雞紅細胞懸液進行抗原測定，并于4°C中判定。在本發明的具體實施例中，本發明所用的病毒株為雞腎型傳染性支氣管炎病毒 M41株，購自中國獸藥監察所。在本發明的具體實施例中，所述的產氣莢膜梭菌培養液按以下方法制備將產氣莢膜梭菌菌株以3%的接種量接種于厭氣肉肝湯培養基后，放入37°C溫箱中培養M小時。 培養液以5000r/min離心30分，取上清液經0. 22 μ m微孔濾器過濾后分裝即得，_20°C保存。在本發明的具體實施例中，所述的病毒經上述步驟( 處理后4°C要放置7天。在本發明的具體實施例中，所述的滅活是將病毒液置56°C水浴滅活30min。在本發明的具體實施例中，所述的雞紅細胞懸液濃度為0. 5%。在本發明的具體實施例中，所述的穩定劑為N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖。N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖可按現有常規方法制備，作為參考，在本發明的具體實施例中，N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖是按以下方法制備得到的(1)殼聚糖的脫乙酰化處理將脫乙酰度為80%殼聚糖50g分散在質量分數為20% NaOH的溶液中，110°C，壓力0. 2Mpa條件下回流攪拌反應池，傾去上清液，去離子水洗至中性。(2)殼聚糖的浸泡處理將2g脫乙酰處理的殼聚糖溶于體積分數為乙酸溶液中，攪拌溶解，真空抽濾， 濾去不溶物。在500 lOOOr/min攪拌條件下逐滴加入0. Imol/L NaOH溶液，調節殼聚糖溶液PH 9，逐漸有白色沉淀析出，浸泡他，抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分；最后，向濾餅中加入15mL異丙醇，攪拌30min分散均勻，倒入三口燒瓶。(3)殼聚糖與2，3-環氧丙基三甲基氯化銨開環反應在N2保護條件下，將三口燒瓶升溫至80°C，將2，3-環氧丙基三甲基氯化銨的異丙醇溶液分三次加入，每隔2小時加入一次，每次滴定時間控制在30min。反應1 把燒瓶冷卻至室溫，加入150mL冷藏處理的無水乙醇，浸泡0.證，抽濾，冷凍干燥Mh。(4)N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的精制將干燥后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于去離子水，應用3G砂芯漏斗過濾，除去不溶物，在真空條件下蒸餾出一半水，然后在在5倍體積冷藏處理的丙酮中浸泡沉淀；真空抽濾，濾餅分散后冷凍干燥Mh ；分裝，充入N2密封室溫保存。本發明方法中所使用的穩定劑為N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖能溶于水，解決了原有穩定劑殼聚糖不溶于水的問題。所用的滅活方法為水浴56°C滅活30min，解決了加滅活劑后會降低效價的問題。所用的雞紅細胞懸液為0. 5%，使判定結果更穩定，解決了判定結果不準確的問題。由于采用A型產氣莢膜梭菌培養液處理病毒液，解決了原有制備抗原成本高的問題。由于采用透析袋濃縮，解決了抗原效價低的問題。
具體實施例方式下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的范圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和范圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護范圍內。本發明實施例中所涉及的試劑和材料材料11日齡SPF雞胚由本公司生產一部提供、5%紅細胞懸液由本公司研發中心提供、透析袋規格MD77購買自北京索寶萊科技有限公司、0. 22 μ m微孔濾器購買自美國 PALL公司。菌株:A型產氣莢膜梭菌購買自中國獸藥監察所、雞腎型傳染性支氣管炎病毒M41 株，購自中國獸藥監察所。試劑殼聚糖購買自美國Sigma公司、2，3_環氧丙基三甲基氯化銨購買自山東東營國豐化學制品有限公司；肉肝湯培養基的制備成分牛肉200g ；牛肝50g ；胃蛋白酶3_4g ；鹽酸IO-Ilml ； 蛋白胨IOg ；糊精IOg ；蒸餾水1000ml。在65°C左右溫水內加入鹽酸和絞碎的牛肉、肝，充分攪均，再加入胃蛋白酶充分攪拌，混合后的溫度應在56-58°C。置53-55°C消化22- 小時。 前10小時每小時充分攪拌1次。提取上清液，加熱至80°C，然后加入蛋白胨煮開，調pH至 7.6-7.8。煮沸10分鐘，濾過后取上清液，按量加入糊精溶解后分裝。116°C滅菌40分鐘。實施例1N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的制備方法(1)殼聚糖的脫乙酰化處理將殼聚糖50g分散在質量分數為20% NaOH的溶液中，110°C，壓力0. 2Mpa條件下回流攪拌反應池，傾去上清液，去離子水洗至中性；(2)殼聚糖的浸泡處理將2g脫乙酰處理的殼聚糖溶于體積分數為1 %乙酸溶液中，攪拌溶解，真空抽濾，濾去不溶物。在800r/min攪拌條件下逐滴加入0. Imol/LNaOH溶液，調節殼聚糖溶液 PH 9，逐漸有白色沉淀析出，浸泡8h，抽濾，去離子水洗至濾液呈中性，抽干水分；最后，向濾餅中加入15mL異丙醇，攪拌30min分散均勻，倒入三口燒瓶；(3)殼聚糖與2，3-環氧丙基三甲基氯化銨開環反應在N2保護條件下，將三口燒瓶升溫至80°C，將2，3_環氧丙基三甲基氯化銨的異丙醇溶液分三次加入，每隔2小時加入一次，每次滴定時間控制在30min。反應1 把燒瓶冷卻至室溫，加入150mL冷藏處理的無水乙醇，浸泡0.釙，抽濾，冷凍干燥Mh ；(4)N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖的精制將干燥后的N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖溶于去離子水，應用3G砂芯漏斗過濾，除去不溶物，在真空條件下蒸餾出一半水，然后在在5倍體積冷藏處理的丙酮中浸泡沉淀；真空抽濾，濾餅分散后冷凍干燥Mh ；分裝，充入N2密封室溫保存。實施例2雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法(1)病毒增殖將雞腎型傳染性支氣管炎病毒M41株用無菌生理鹽水按體積比1 50倍稀釋后， 經尿囊腔接種11日齡SPF雞胚，每胚0. lmL，置37°C繼續孵育，棄去24h前死胚，3 !后取出所有胚放入4 0C冰箱過夜，收集尿囊液，4 °C保存備用。
(2)病毒液濃縮與A型產氣莢膜梭菌培養液處理產氣莢膜梭菌培養液按以下方法制備將產氣莢膜梭菌菌株以3%的接種量接種于厭氣肉肝湯培養基后，放入37°C溫箱中培養M小時。培養液以5000r/min離心30分，取上清液經0. 22 μ m微孔濾器過濾后分裝即得，-20°C保存。將收集的新鮮尿囊液以5000rpm高速冷凍離心30min，取上清液以25000rpm高速冷凍離心60min后，棄去上清液，沉淀用支氣管尿囊液充分懸浮，支氣管尿囊液的添加量是第一次離心后所取上清液體積的1/200，透析袋進行濃縮，濃縮到原體積的1/2 ；然后向懸浮液中加入20%產氣莢膜梭菌培養液，充分混合置37°C水浴作用池，每隔20min震蕩一次， 作用完畢后取出病毒液置4°C保存備用。(3)抗原的滅活將病毒液置56 °C水浴滅活30min。(4)抗原的穩定按病毒液與穩定劑體積比10 1的比例加入穩定劑N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖，震蕩混勻后利用冷凍真空干燥技術凍干后即得到雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原。(5)使用濃度為0. 5%的紅細胞懸液進行抗原凝集價測定，并于4°C中判定。實施例3抗原效力檢驗使用我公司所生產的雞傳染性支氣管炎活疫苗產品按常規免疫程序給雞群免疫后采集血清，使用按照實施例2的方法自制的三批抗原進行效力檢驗。采集雞血清5份，按常規方法用白陶土處理后，進行血凝抑制試驗進行抗體檢測。結果見下表1-表3所示表1抗原批號201100權利要求
1.一種雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于該方法是按下述步驟進行的(1)病毒增殖將病毒株用無菌生理鹽水按體積比1 50倍稀釋后，經尿囊腔接種11日齡SPF雞胚， 每胚0. ImL,置37°C繼續孵育，棄去24h前死胚，36h后取出所有胚放入4°C冰箱過夜，收集尿囊液，4°C保存備用；(2)病毒液濃縮與A型產氣莢膜梭菌培養液處理將收集的尿囊液以3000-5000rpm高速冷凍離心30min，取上清液以20000-25000rpm 高速冷凍離心50-60min后，棄去上清液，沉淀用支氣管尿囊液充分懸浮，支氣管尿囊液的添加量是第一次離心后所取上清液體積的1/200-1/100，懸浮液用透析袋進行濃縮；然后按濃縮后液體體積的10% -50%加入產氣莢膜梭菌培養液，充分混合后置37°C水浴作用 2-3h，每隔20min震蕩一次，作用完畢后取出病毒液置4°C保存備用；(3)抗原的滅活(4)抗原的穩定按病毒液與穩定劑體積比3-10 1的比例加入穩定劑，震蕩混勻后利用冷凍干燥技術凍干后即得到雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原；(5)使用雞紅細胞懸液進行抗原測定，并于4°C中判定。
2.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于所述的病毒毒株為M41。
3.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于產氣莢膜梭菌培養液按以下方法制備將產氣莢膜梭菌菌株以3%的接種量接種于厭氣肉肝湯培養基后，放入37°C溫箱中培養M小時培養液以5000r/min離心30分，取上清液經 0. 22 μ m微孔濾器過濾后分裝即得，-20°C保存。
4.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于所述的病毒經上述步驟( 處理后4°C要放置7天。
5.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于所述的滅活是將病毒液置56 °C水浴滅活30min。
6.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于所述的穩定劑為N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖。
7.根據權利要求1所述的雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，其特征在于所述的雞紅細胞懸液濃度為0. 5%。
全文摘要
本發明公開了一種雞傳染性支氣管炎病毒HA抗原的制備方法，本發明方法中采用A型產氣莢膜梭菌處理病毒液，解決了原有制備抗原成本高的問題。所使用的穩定劑為N-2羥丙基三甲基氯化氨殼聚糖能溶于水，解決了原有穩定劑殼聚糖不溶于水的問題。所用的滅活方法為水浴56℃滅活30min，解決了加滅活劑后會降低效價的問題。所用的雞紅細胞懸液為0.5％，使判定結果更穩定，解決了判定結果不準確的問題。由于采用透析袋濃縮，解決了抗原效價低的問題。因此，本發明提供了一種低成本、效價高且穩定、安全性好的雞傳染性支氣管炎病毒HA穩定抗原的制備方法。制備的IBV HA抗原可成功應用于雞群IBV疫苗免疫后血清HI抗體效價檢測。
文檔編號C07K14/165GK102391366SQ20111034974
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月8日 優先權日2011年11月8日
發明者丁國杰, 孫德君, 張揚, 王晶, 趙輝 申請人:哈藥集團生物疫苗有限公司