專利名稱：一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種海蚯蚓纖溶酶，具體地說是一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列，屬于醫藥生物工程領域。
背景技術：
血栓性疾病嚴重威脅著人類健康，臨床上迫切需要尋找安全高效低毒的新型溶栓齊U。纖溶酶(Fibrinolytic enzyme),大多屬于絲氨酸蛋白酶家族,該家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近含高度保守序列⑶SGGP，主要裂解纖維蛋白和纖維蛋白原中Lys或Arg羧 基端的肽鍵使其被降解成許多具有抗凝作用的可溶性小肽；有的纖溶酶還作為纖溶酶原激活劑，間接發揮溶栓作用。臨床上已正式批準使用的纖溶酶有尿激酶、鏈激酶、葡激酶以及從蚯蚓體內提取的天然溶栓藥物蚓激酶等。海蟲丘蝴(Arenicola cristata),屬于海洋環節動物門多毛綱小頭蟲目沙纟屬科,形似蚯蚓，生活于潮間帶多沙地帶，營管居生活，故名海蚯蚓。主要分布于我國渤海、黃海沿岸。海蚯蚓始載于《中國藥用動物志》，用于癰瘡腫毒，有清熱解毒之功效。目前對海蚯蚓的研究方向主要集中在其形態結構、生理代謝、營養成分分析等方面。關于海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列、氨基酸序列及其功能在國內外尚無研究和報道。

發明內容
本發明提供一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列。為了實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案
以來自海蚯蚓消化道上皮細胞的mRNA為模板，采用同源序列克隆法，通過3' RACE、5' RACE技術，獲得了一種編碼具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列。將該序列表達活性肽的部分克隆到表達載體上，在原核表達系統(如大腸桿菌)或真核表達系統(如酵母、動物細胞等)生產具有溶栓活性的重組海蚯蚓纖溶酶。重組海蚯蚓纖溶酶具有纖維蛋白酶原激活活性，可作為新型的基因工程藥物。海蚯蚓纖溶酶cDNA序列的克隆
(O設計引物根據絲氨酸蛋白酶家族的蛋白酶催化活性中心Ser附近所含的高度保守序列GDSGGP設計引物。(2)目的基因cDNA 3'端序列擴增及測序由步驟(I)得到引物，和來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，通過3' RACE (cDNA3'末端快速擴增技術)擴增海蚯蚓纖溶酶的基因cDNA 3'端序列。PCR產物膠回收后分別連TA克隆載體，轉化細菌E. coli DH5 α，測序。(3)目的基因cDNA 5'端序列擴增及測序根據獲得的目的基因cDNA 3'端序列設計兩對特異性引物，以來自海蚯蚓消化道組織的總cDNA為模板，采用5' RACECcDNA 5'末端快速擴增技術)，進行套式PCR，擴增海蚯蚓纖溶酶基因cDNA 5'端序列。PCR產物膠回收后分別連TA克隆載體，轉化細菌E. coli DH5a，測序。(4)拼接應用contigexpress軟件對步驟(2)和(3)得到的目的基因cDNA 3'端和5'端序列進行拼接，獲得本發明的海蚯蚓纖溶酶編碼基因的DNA (mRNA)序列。(5)根據上述步驟(4)得到的DNA (mRNA)序列，使用DNAMAN軟件，獲得該海蚯蚓纖溶酶cDNA編碼的氨基酸序列。一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的編碼基因序列，該序列如下
IATCCCAGATC ATCAGTGACC CGGACAACCA ACCTCAACCC ATGAAGTTCC TTCTGCTGTC
61TGCCCTCGTG GCCCTGGCCT CTGCTGCCCC TAGCTTCAAG GCTCCTGCAC CMGCCTCAT
121 TTTCTCCAAT GATGGCTACA TTGTTGGTGG CGATGAGGCT GCTGTAGGCC AGTTTCCCTT 181 CCAGGCTGTT CTGCTGTCCT CTACCAGCCC TGGTGGCAGT CTGACCTGTG GAGGTGTCTA 241 CATTGGTGCC AATAGTGGTG GAAATCATTG GCTTTTGAAC GCTGCTCACT GCACCCAGTC 301 CAGTGCCCGT AGCACATGGT TGGGCCTCCA CAGACGCAGT GACACTAGCG ATGGACAGCA 361 CTTCACCTTC GTCCGTATTG TGAACCATCC CAACTATGGC TCTGGAGCTG GTGCTTTCCC 421 CMTGACATC AGCTTGTGTG AGATCMTGG CGTTGTTGAC ACCAGTGGCA ATGTTGGTGC 481 TGCTGTCTTG GCTGAGGGAG ATAATGACTA TGCTGGAGTA AGCGCTATCA TTTCTGGATG 541 GGGAAGAACT TGTGGAGGCT GTGCCCTGCC AGATGAACTG CGGTTTGTTC AGACCACTGT 601 CCTCCCCAAC TATGGAGCTA ACTCTTGCCA GACTGACTGG GGCAGCMTG TCAATGATGG 661 ACACATCTGT GTCAAGTCTG AMACCAGGA CTCTGGAGCT TGCAATGGTG ACAGTGGTGG 721 CCCCATGTCC ATTGGAAACA CAGTTATTGG AGTGACATCC TGGGGAGCCT CTGGATGTCT 781 GACCTCCTAC CCATCTGCCT ACTCCAGGGT CTCCTTCTTC CGTGACTGGA TCAGAGAGGT 841 GTCTGACATC TMAGCMTC AGCTGTTATG ACTGCTTTGT AATAATACCA GAGCATCAAT 901 AAAAATTGCA AACAAAATTA TAAAAAAAAA AAAAAAA 序列中劃線標示的ATG為起始密碼子，劃線標示的的TAA為終止密碼子。以上序列為編碼海蚯蚓纖溶酶的原始cDNA序列，通過基因工程的方法可對其結構進行改造，得到海蚯蚓纖溶酶cDNA序列的衍生序列。該衍生序列包括新分離的具有與以上所述結構同樣基本結構的基因序列以及使用體外DNA操作技術通過堿基的置換、插入、缺失獲得的該基因序列的各種突變體。根據海蚯蚓纖溶酶的原始cDNA序列，得到一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列。該序列如下
IMKFLLLSALV ALASAAPSFK APAPSLIFSN DGYIVGGDEA AVGQFPFQAV LLSSTSPGGS
61LTCGGVYIGA NSGGNHWLLN AAHCTQSSAR STffLGLHRRS DTSDGQHFTF VRIVNHPNYG
121 SGAGAFPNDI SLCEINGVVD TSGNVGAAVL AE⑶NDYAGV SAIISGffGRT CGGCALPDEL 181 RFVQTTVLPN YGANSCQTDff GSNVNDGHIC VKSENQDSGA CNGDSGGPMS IGNTVIGVTS 241 WGASGCLTSY PSAYSRVSFF RDffIREVSDI
劃線標示部分(MKFLLLSALV ALASA)為該蛋白酶的信號肽序列。黑體⑶SGGP為絲氨酸蛋白酶家族的聞度保守序列。該序列為海蚯蚓纖溶酶的原始氨基酸序列，通過改構可得到一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列的衍生序列，包括在原始氨基酸序列基礎上進行單個或多個氨基酸的置換、插入、缺失等形成的各種變構體。本發明的有益效果是根據本發明的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓消化道組織總cDNA中克隆該酶的編碼基因。通過基因重組技術，使該酶的編碼基因在原核表達系統(如大腸桿菌)或真核表達系統(如酵母細胞或動物細胞)中表達。重組海蚯蚓纖溶酶具有纖維蛋白酶原激活活性，可作為潛在的新型溶栓藥物。


圖I為海Φ丘蚓纖溶酶全長cDNA序列克隆的實驗 步驟流程 圖2為海蚯蚓纖溶酶重組蛋白表達純化及活性測定的實驗步驟流程 圖3為海蚯蚓纖溶酶編碼序列在大腸桿菌中表達的SDS-PAGE分析 圖4為純化的重組海蚯蚓纖溶酶的SDS-PAGE分析 圖5為重組海蚯蚓纖溶酶的纖維蛋白酶原激活活性測定圖。
具體實施例方式以下對本發明的優選實施例進行說明，應當理解，此處所描述的優選實施例僅用于說明和解釋本發明，并不用于限定本發明。實施例I
海蚯蚓纖溶酶全長cDNA的克隆及序列測定。實驗材料
1.海蚯蚓，采自煙臺市近海；
2.Trizol試劑、3 ^ RACE試劑盒、5 ^ RACE試劑盒(北京吉百特)，反轉錄試劑盒(fermentas 公司)，T-A Easy 試劑盒、Wizard 純化 DNA 試劑盒、DNase、RNase H (Promega公司)，高保真Taq酶(大連寶生物)。實驗方法如圖I所示，包括以下步驟
I.設計引物序列
權利要求
1.一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的編碼基因序列，為序列表中SEQ ID No. I所示的核苷酸序列。
2.一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列，為序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3.一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的編碼基因序列的衍生序列，其特征在于該衍生序列為權利要求I所述的基因序列的一個或幾個堿基的置換、插入或缺失獲得的該基因序列的變構體。
4.一種具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的氨基酸序列的衍生序列，其特征在于該衍生序列為權利要求3所述的具有溶栓活性的海蚯蚓纖溶酶的編碼基因序列的衍生序列相對應，為在相應蛋白質的氨基酸序列基礎上經過一個或幾個氨基酸的置換、插入或缺失形成的變構體。
全文摘要
本發明公開了一種編碼海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列及其氨基酸序列，分別如序列表中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2所示，屬于醫藥生物工程領域。本發明的有益效果是根據本發明的海蚯蚓纖溶酶的cDNA序列，可以從海蚯蚓的消化道組織中克隆該纖溶酶的編碼基因。該編碼基因通過基因重組技術，可以在原核表達系統或真核表達系統中獲得表達。重組海蚯蚓纖溶酶具有纖維蛋白酶原激活活性，可作為新的基因工程溶栓藥物。
文檔編號C12N9/68GK102757973SQ20121023622
公開日2012年10月31日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者于文靜, 初金鑫, 趙春玲, 連波, 陳麗梅, 鞠吉雨 申請人:濰坊醫學院