專利名稱：利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基及方法
技術領域：
本發明屬于生物制造領域，更具體涉及一種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基及方法。
背景技術：
柑橘類果汁由于含有豐富的營養成分并具有保健功效，目前已成為消費量較大的果汁產品且在世界市場中占有67%左右的份額。當前國內生產的柑橘類水果用于加工的量僅為總量的5%，這使得國內果汁加工產業發展較為滯后。國際市場上銷售的橙汁主要來自、巴西和美國，其中美國主要集中葡萄柚汁的生產。葡萄柚(Grapefruit)又稱為西柚，起源于亞洲，主要產于亞、非和拉丁美洲等地。葡萄柚從植物分類學上與我國原產的柚十分相似，為蕓香科柑桔屬植物，與寬皮柑橘類、檸檬類、甜橙類構成世界柑橘四大類群。目前市場上主要的葡萄柚品種為Marsh、Duncan、Thompson三類。隨著人們對葡萄柚獨特風味和營養價值的認知，葡萄柚的消費量不斷上升。但柑橘類果實的海綿層和種籽在加工成果汁過程中，會產生大量的苦味物質。此夕卜，柑桔屬果實的果汁在靜置過程中會出現“后苦味”現象。目前認為苦味是由兩大類物質引起的一類是以柚皮苷(Naringin)為代表的黃酮類化合物，主要存在于葡萄柚等柚子果實中，在柚子皮以及果實囊衣中的柚皮苷含量可占到80%;另一大類是以檸檬苦素(Limonoids)為代表的三萜類衍生物，其中檸堿是產生“后苦味”現象的主要苦味物質?！昂罂辔丁钡男纬墒怯捎诠麑嵵写嬖跈帀A酸鹽A-環內酯，是一種非苦味物質的前體；在果汁加工過程中，果汁中的非苦味前體被相應的水解酶催化產生檸堿，而使得果汁變苦。當前去除柑桔類果汁苦味的方法主要為酶法脫苦，如利用柚苷酶和檸堿苦素酶脫苦；吸附脫苦法，如采用活性炭或醋酸纖維吸附柱；代謝脫苦法，如采用三乙胺衍生物或乙烯氣體處理果實與果樹。此外還有加熱脫苦法、β-環糊精脫苦以及超臨界CO2處理等。酶法脫苦技術是利用由微生物產生的不同的酶分別處理柚皮苷和檸堿，降低其在果汁中的含量，達到適宜的感官承受范圍。由假單胞菌屬和節桿菌屬產生的檸堿苦素酶主要用于降解檸堿；曲霉發酵產生的柚苷酶則主要用于柚皮苷的降解。柚苷酶是由鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶構成，可將柚皮苷最終降解為無苦味的柚配質。由于酶法脫苦較為溫和，節省能源，且克服了其它脫苦技術的缺點，保留了柑橘類果汁原有的風味和營養物質，因而成為當前果汁加工行業的研究熱點。國內外學者對檸堿苦素酶的代謝通路及其脫苦路徑的研究較為廣泛深入，而對柚苷酶的研究則較少。

發明內容
本發明提供了一種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基及方法，以提聞袖昔酶的廣量。本發明首先提供了一種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基，所述培養基為桔皮粉 2. 0-3. 0%,豆渣 O. 5-2. 5%,酵母膏 O. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 O. 1%，MgSO4- 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培養基初始ρΗ5· 0-6. O0所述桔皮粉的制作方法為收集新鮮的桔皮，烘干，粉碎后過3(Γ120目篩網，得到桔皮粉。本發明還提供了一種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的方法，以黑曲霉為出發菌株，對其進行發酵培養，采用的培養基為桔皮粉2. 0-3. 0%，豆渣O. 5-2. 5%，酵母膏 O. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 O. 1%，MgSO4 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 O. 5-1. OmmoI/L，CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培養基初始ρΗ5· 0-6. O ;培養條件為接種量5. 0-9. 0%，培養溫度30-33°C，裝液量 30-50mL/250mL，搖床轉速 180 r/min。本發明實施例中具體以黑曲霉S-05菌株(參考文獻談小芳等，黑曲霉S-05產柚苷酶的純化與分離.食品與發酵工業，2010，36 (8):59-63.)為生產菌株，對其產酶培養基和發酵條件進行優化。優化后的產酶條件為桔皮粉(30目^120目)27g，豆渣5g，酵母骨 2g, KH2PO4 10g, Na2HPO4 lg, MgSO4 7H20 I. Ommol/L, FeCl3 I. Ommol/L, CaCl2 I. Ommol/L,蒸餾水lOOOmL，培養基初始pH5. 0 6. 0 ;接種量5. 0%，培養溫度30°C，裝液量30mL/250mL，搖床轉速180 r/min。在上述條件下發酵，產酶水平可達到114. 68U/mL。本發明的顯著優點雖然利用酶法脫苦已成為柑橘類果汁加工中的新興研究方向，但國內尚未出現商品化的柚苷酶，主要還是依靠向美國、巴西等國家進口商品柚苷酶。國內學者為提高柚苷酶的活力做了一些研究，如產酶菌株的獲取、產酶特性研究等方面，但獲得的菌株產酶能力相對較弱。本發明通過建立了黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的工藝條件，以此來提高柚苷酶的產量，為柚苷酶的生產和應用打下基礎；而且以桔皮粉和豆渣等農業廢棄物為生產原料，變廢為寶，實現了農副產品的高值化利用，減少了環境污染，具有重要的社會經濟和環保生態效益。


圖I各種碳源對產酶能力的影響。
圖2桔皮粉添加量對產酶能力的影響。圖3各種氮源對產酶能力的影響；其中SP:大豆蛋白；BP:豆餅粉；SR:豆渣；UR:尿素；CA:干酪素；SO:豆柏粉；PE:蛋白胨；PP:花生餅粉；AN: NH4NO3 ;AS:(NH4)2SO4 ;SN:NaNO3。圖4豆洛添加量對產酶能力的影響。圖5各種金屬離子對產酶能力的影響。圖6不同培養基初始pH對產酶能力的影響。圖7接種量對產酶能力的影響。圖8發酵溫度對產酶能力的影響。圖9裝液量對產酶能力的影響。圖10黑曲霉S-05菌株的pH和產酶曲線。
具體實施例方式以下采用黑曲霉S-05菌株(參考文獻談小芳等，黑曲霉S-05產柚苷酶的純化與分離.食品與發酵工業，2010，36 (8):59-63.)為生產菌株，對其產酶培養基和發酵條件進行優化。I柚苷酶活力的測定方法
采用Davis法(改良法)測定酶活力。取2. OmL O. 2mol/L的醋酸緩沖液(pH4. O)與
2.O mL 400 μ g/mL的柚皮苷標準溶液混合,4(TC保溫5 min ;加入I. O mL經適當稀釋的粗酶液(將經液體發酵得到的發酵液于4°C、8000 r/min離心10 min，收集上清液作為粗酶液)，40°C水浴反應30 min;取O. 5 mL反應液與2. 5 mL柚皮苷顯色液(90%—縮二乙二醇lmol/L NaOH溶液=5:1)混合后30°C水浴20 min，在420 nm處測定吸光值?？瞻捉M以I. O mL的蒸餾水代替。柚苷酶活力單位⑶定義在400C、pH4. O條件下，每min每mL酶液所能降解的
柚皮苷含量。酶活力(U/mL)=(NXaX5) / (TX0.5)
其中，N—酶液稀釋倍數；a—柚皮苷降解量(μ g/mL) ；T一反應時間。2產酶培養基的優化
優化前的培養基組成(g/1000 mL蒸餾水)柚皮苷1.0 g，(NH4)2SO4 1.0 g, MgSO4 7H20
I.O g, KH2PO4 I. O g，Na2HPO4 O. I g，KCl 0.5 g, NaCl 0.2 g, CaCl2 0. I g，酵母膏 2.0 g,pH 5. 0 6· 0。2. I碳源種類對產酶的影響
以優化前的培養基為基礎培養基，分別以2. 5%(w/v)的麩皮、葡萄糖、蜂蜜、玉米淀粉、桔皮粉、可溶性淀粉、果糖、小麥面粉、蔗糖、紅糖和柚皮苷作為碳源配制成液體產酶培養基(裝液量70mL/250mL)。每瓶按10% (v/v)的接種量接入單孢子懸液(OD6tltl=O. 4)，30°C、180r/min培養4d,測定各發酵液酶活，以確定最佳碳源。各種碳源種類對黑曲霉S-05菌株產柚苷酶能力的影響結果如圖I所示，以最高酶活力(柚皮苷為碳源發酵得到的柚苷酶活力)為100%，其余與之相比得到相對酶活力。由圖I可直觀看出以桔皮粉、柚皮苷作為碳源對黑曲霉S-05菌株產酶能力有顯著影響，其中柚皮苷尤為顯著，此時所產酶的活力最大；以桔皮粉為碳源時，菌株所產酶的相對活力也可維持在85. 9%。柚皮苷作為碳源誘導黑曲霉S-05菌株產柚苷酶效果雖顯著，但使用成本較為昂貴；而桔皮粉獲得相對簡易且成本低廉，產酶能力與柚皮苷誘導相近，從降低生產成本角度出發，選擇桔皮粉作為最佳碳源。2. 2碳源添加量對產酶的影響
確定最優碳源以后，選擇桔皮粉的添加量范圍為O. 3%-5. 4%(間隔為O. 3%) (w/v)，每瓶70mL/250mL，按 10%(v/v)的接種量接入單孢子懸液(OD6tltl=O. 4)，30°C、180 r/min 培養 4d，測定各發酵液酶活，以確定最佳碳源添加量。以最高酶活力(2. 7%桔皮粉作為碳源發酵得到的柚苷酶活力)為100%，其余與之相比得到相對酶活力。從圖2可確定桔皮粉的最適添加量為2.7%。當桔皮粉添加量低于2. 7%時產酶能力較低，可能是由于黑曲霉S-05菌株缺乏充足的碳源使得生長受到限制；當桔皮粉濃度超過2. 7%時培養基較為粘稠，這可能使得整個培養過程中溶氧量受到限制，從而影響菌體生長，進而使產酶能力下降。、
2. 3氮源種類對產酶的影響
在碳源和碳源添加量優化的基礎上，進一步考察有機氮源(大豆蛋白、蛋白胨、豆柏、豆餅粉、尿素、干酪素、花生餅粉、豆渣)、無機氮源(NH4N03、(NH4)2SO4^NaNO3)對黑曲霉S-05菌株產酶的影響，氮源添加量均為O. 5%(w/v)，結果如圖3所示。以豆渣為氮源發酵得到的柚苷酶的酶活力為100%，其余與之相比得到相對酶活力。SP:大豆蛋白；BP:豆餅粉；SR:豆渣；UR:尿素；CA:干酪素；SO:豆柏粉；PE:蛋白胨；PP:花生餅粉；AN: NH4NO3 ；AS: (NH4)2SO4 ;SN: NaNO3
從圖3可知，各種氮源對黑曲霉S-05菌株產酶能力影響各不相同。豆渣、(NH4)2SO4對產酶能力影響最為顯著，豆柏粉次之；蛋白胨、花生餅粉的效果較差。從考慮生產成本出發，選用豆渣作為最佳的氮源。2. 4豆渣添加量對產酶的影響
在確定以豆渣為最適氮源后，分別以O. 5 %、2·5 %、4·5 %、6·5 %、8· 5 %、10.5 %(w/v)的豆渣添加量進行實驗，確定最佳豆渣添加量，如圖4所示。以O. 5%豆渣作為氮源發酵得到的柚苷酶的活力為100%，其余與之相比得到相對酶活力。由圖4可知，當豆渣添加量維持在O. 5%-2. 5%時，黑曲霉S_05菌株產酶能力較高；當豆渣添加量超過2. 5%后，豆渣添加量的不斷增大使得培養基含水量越來越低，從而使得液體培養基的溶氧量急劇下降，影響菌體產酶。因此，確定豆渣的最適添加量為O. 5-2. 5%。2. 5金屬離子對產酶的影響
金屬離子主要以無機鹽的形式添加入培養基中。無機鹽提供微生物除碳源、氮源之外的其它所需離子。單因素實驗結果如圖5所示，以空白組(不添加金屬離子)酶活力為100%，其余與之相比得到相對酶活力。由圖5可知，Mg2+、Fe3+、Ca2+的添加可以促進黑曲霉S-05菌株合成柚苷酶。Mg2+最佳添加濃度為5mmol/L ;Fe3+添加量不超過lmmol/L ;而Ca2+添加濃度范圍為l 10mmol/L。因此選取Mg2+的添加濃度為l-5mmol/L，Fe3+的添加濃度為0-lmmol/L，Ca2+的添加濃度為1-lOmmol/L，設計正交表L9(34)優化三種金屬離子的配比。正交實驗因素表以及正交設計表，見表1、2、3 (以配方7發酵得到的柚苷酶的酶活力為100%，其余與之相比得到相對酶活力)。表I實驗因素和水平表
權利要求
1.ー種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基，其特征在于所述培養基為桔皮粉 2. 0-3. 0%，豆渣 0. 5-2. 5%，酵母膏 0. 2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 0. 1%，MgSO4. 7H20.1. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2 I. 0-5. OmmoI/L,培養基初始 pH5. 0-6. O。
2.根據權利要求I所述的利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基，其特征在于所述桔皮粉的制作方法為收集新鮮的桔皮，烘干，粉碎后過3(T120目篩網，得到桔皮粉。
3.ー種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的方法，其特征在干以黑曲霉為出發菌株，對其進行發酵培養，采用的培養基為桔皮粉2. 0-3. 0%，豆渣0. 5-2. 5%，酵母膏.0.2%, KH2PO4 I. 0%, Na2HPO4 0. 1%，MgSO4. 7H20 I. 0-2. 5mmol/L, FeCl3 0. 5-1. OmmoI/L, CaCl2.1.0-5. Ommol/L，培養基初始pH5. 0-6. 0 ;培養條件為接種量5. 0-9. 0%，培養溫度30_33°C，裝液量 30-50mL/250mL，搖床轉速 180 r/min。
全文摘要
本發明屬于生物制造領域，更具體涉及一種利用黑曲霉發酵桔皮粉和豆渣生產柚苷酶的培養基及方法。所述培養基為桔皮粉2.0-3.0%，豆渣0.5-2.5%，酵母膏0.2%，KH2PO41.0%，Na2HPO40.1%，MgSO4.7H2O1.0-2.5mmol/L，FeCl30.5-1.0mmol/L，CaCl21.0-5.0mmol/L，培養基初始pH5.0-6.0。培養條件為接種量5.0-9.0%，培養溫度30-33℃，裝液量30-50mL/250mL，搖床轉速180r/min。本發明提高了柚苷酶的產量，為柚苷酶的生產和應用打下基礎。
文檔編號C12N9/24GK102732491SQ20121023579
公開日2012年10月17日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者葉秀云, 楊捷, 林娟, 蔡梅華, 陳增 申請人:福州大學