專利名稱：肉鵝屠體性狀微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及家禽選擇技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及肉鵝屠體性狀的微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法。
背景技術(shù)：
肉鵝屠體性狀主要包括屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、腹脂率、胸肌率和腿肌率，是肉鵝生產(chǎn)中的重要經(jīng)濟性狀，在肉鵝育種中越來越受重視。由于屠體性狀是不能采用活體度量的經(jīng)濟性狀，傳統(tǒng)的肉鵝屠體性狀選擇方法主要為(I)根據(jù)系譜資料選擇，即將血緣優(yōu)良的選留作種用，血緣差的淘汰；(2)根據(jù)同胞成績選擇，即根據(jù)全同胞或半同胞的屠體 成績來估測種禽的屠體性狀；(3)根據(jù)后裔成績選擇，即根據(jù)后裔的屠體成績來選留親本。由此可見，上述方法都是根據(jù)屠體性狀的表型來進行選擇，而選擇的真正目的卻在于選出優(yōu)良的基因型。由于表型選擇是一個長期的積累過程，其影響因素又很多，如選擇強度、選擇性狀的數(shù)目、世代間距和環(huán)境條件等，都會對表型選擇發(fā)生作用，其變異呈連續(xù)性，加之性狀的表型與其基因型之間的關(guān)系復(fù)雜，在大多數(shù)情況下并不完全吻合，因而選擇往往難以準(zhǔn)確，只有多次重復(fù)同一方法，連續(xù)數(shù)代定向選擇才能取得顯著效果。為此，許多研究者正在不斷探索新的更為有效的肉鵝屠體性狀選擇技術(shù)，以改變傳統(tǒng)選擇方法的不足。家禽的屠體性狀屬于數(shù)量性狀。傳統(tǒng)的數(shù)量遺傳學(xué)認為，數(shù)量性狀優(yōu)勢是由微效多基因控制的，它對數(shù)量性狀有較大影響但又難以識別和分離，因而可以通過選擇與數(shù)量性狀相連鎖的分子遺傳標(biāo)記來實現(xiàn)對基因型的選擇，這已成為家禽育種過程中的一種重要手段和方法。分子遺傳標(biāo)記是以物種基因突變造成DNA片段長度多態(tài)性為基礎(chǔ)的，具有許多優(yōu)點(I)可以直接探測DNA水平的差異，不受時空的限制；(2)標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高；(3)共顯性標(biāo)識，可以區(qū)分純合子與雜合子；(4)可以解釋家系內(nèi)某些個體的遺傳變異；
(5)可以鑒定不同性別、不同年齡的個體；同時，采用標(biāo)記輔助選擇可以在家禽的生命早期開始而不必等待生產(chǎn)性狀完全表現(xiàn)出來；并在兩性中同時選擇任何生產(chǎn)性狀，突破了限性性狀只能從單種性狀選擇的局限；在選擇屠體性狀的過程中，不必做昂貴的屠宰試驗。由此可見，利用分子遺傳標(biāo)記改良家禽品種是一門較為理想的新型學(xué)科，可以縮短世代間隔，提高選擇強度，增加選擇的準(zhǔn)確性，從而加速家禽的遺傳進展。目前，國際上對于肉鵝屠體性狀的標(biāo)記輔助選擇還鮮有報道，也不曾提出肉鵝屠體性狀的有效評定選擇方法，在肉鵝屠體性狀的分子標(biāo)記選擇領(lǐng)域尚屬空白。因此建立一種評定肉鵝屠體性狀的有效分子標(biāo)記方法非常必要，同時也可為具有優(yōu)良屠體性狀的肉鵝品種選擇提供可靠的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是，針對傳統(tǒng)肉鵝屠體性狀表型選擇方法易受多種因素影響，表型與其基因型之間不完全吻合，因而選擇準(zhǔn)確性低、周期長等缺陷，提供一種在鵝的生命早期即可開始、準(zhǔn)確性高、選育周期短且不必做屠宰試驗的依據(jù)肉鵝微衛(wèi)星標(biāo)記的基因型進行肉鵝屠體性狀選擇的分子遺傳標(biāo)記選擇方法。
本發(fā)明所述的肉鵝屠體性狀微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法，是在完成下列基礎(chǔ)工作后取得的
O鵝微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選
根據(jù)生物素與鏈霉親和素的親和原理，應(yīng)用上海英俊生物技術(shù)有限公司合成的生物素-ATAGAATAT (CA) 12探針和Biolabs公司的鏈霉親和素磁珠，采用磁珠富集法構(gòu)建鵝基因組微衛(wèi)星富集文庫，以PCR檢驗從中篩選出陽性克隆，測序分析獲得197個微衛(wèi)星序列片段；
對于肉鵝微衛(wèi)星分子標(biāo)記的篩選，首先根據(jù)上述197個微衛(wèi)星序列片段兩端的保守序列分別設(shè)計引物(RY001-RY197);然后對每個肉鵝群體中的100-200只肉鵝個體血樣基因組DNA分別進行PCR擴增反應(yīng)；最后將擴增產(chǎn)物進行PAGE電泳檢測，從中選擇有明顯擴增產(chǎn)物的引物進行微衛(wèi)星多態(tài)性分析；所采用的PCR擴增反應(yīng)體系為IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1 dNTPs I. 0-3. 0 μ L, 5. OU· μ U1Bx Taq酶 O. 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 O. 4-0. 6 μ L，10 μ mol/L 下游引物 O. 4-0. 6 μ L，50ng. μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ;PCR 擴增反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 4min ；28-35 個循環(huán)(94°C 40 S, 50-60°C 30 S，72°C 30s ) ;72°C延伸 5min ;4°C保存；運用 genemapper version 3. 5軟件分析確定微衛(wèi)星片斷長度和識別微衛(wèi)星基因型；
2)肉鵝屠體性狀測定
肉鵝屠體性狀的指標(biāo)有屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率，參照《畜禽遺傳資源調(diào)查技術(shù)手冊》(陳偉生，2006)操作；
3)屠宰性狀與微衛(wèi)星標(biāo)記的關(guān)聯(lián)性分析
采用SPSS 11. 5軟件包中廣義線性模型(General Linear Model，GLM)進行最小二乘法分析不同微衛(wèi)星位點基因型與肉鵝屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RY36位點的AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9種基因型肉鵝個體的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率差異明顯，其中AC基因型個體的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率顯著高于其他基因型的個體，而基因型AD個體的屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率最低，表明AC基因型個體的屠體性狀最優(yōu)；
在取得以上肉鵝屠體性狀相關(guān)分子標(biāo)記的基礎(chǔ)上，本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。肉鵝屠體性狀微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法，該方法按以下步驟進行
(O設(shè)計鵝RY36位點的特異性引物根據(jù)鵝微衛(wèi)星位點RY36兩端的側(cè)翼序列設(shè)計一對特異性引物，
其上游引物序列為 RYF: 5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ ；
其下游引物序列為 RYR:5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’ ；
(2)肉鵝屠體性狀測定肉鵝屠體性狀測定的指標(biāo)有屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率，參照陳偉生，2006《畜禽遺傳資源調(diào)查技術(shù)手冊》操作；
(3)PCR擴增反應(yīng)在每個肉鵝群體隨機選擇100-200只肉鵝個體，翅靜脈采集血液，按常規(guī)酚-氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進行PCR擴增反應(yīng),所采用的反應(yīng)體系為 10X Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1dNTPs I. 0-3. 0μ L,5. 0U· μ U1Bx Taq 酶 0· 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0· 4_0· 6 μ L，10μ mol/L 下游引物 O. 4-0. 6 μ L，50 ng· μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ；PCR 擴增反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 4min，按 94°C 40 S、50_60°C 30 S、72°C 30S 28-35 個循環(huán)，72 °C延伸5min，4°C保存；
(4)PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析先配制6%的變性聚丙烯酸胺凝膠用于PAGE電泳檢測，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至60 ml后備用；取PCR產(chǎn)物5 μ I與等體積的6 X loading buffer混合，加樣到6%的變性聚丙烯酞胺凝膠上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)為分子量標(biāo)記，300 V電壓電泳2. 5 h ;電泳結(jié)束后立即進行銀染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去離子水清洗3次，每次2 min,再用已加入終濃度為I. 5 ml/L甲醛的O. I %AgN03染色30 min ;去離子水快速沖洗10 s ;再使用已加入終濃度為3 ml/L甲醒的3 %碳酸鈉顯影；最后再用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5軟件分析微衛(wèi)星位點RY36的基因型，篩選出AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9種基因型肉鵝個體；
(5)優(yōu)勝肉鵝親本個體的選擇選留AC基因型的個體作為肉鵝選擇親本，淘汰AD、BD、 CC、CD、CG、DD、DE和EF基因型的個體。本發(fā)明的有益效果是
所提出的肉鵝屠體性狀相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記在應(yīng)用于肉鵝屠體性狀的選擇工作中，具有以下的有益效果
第一，本發(fā)明是根據(jù)基因型進行肉鵝屠體性狀選擇，精確度高，操作簡單，費用低，選擇成本約為O. 3元/只，并可以進行自動化規(guī)模檢測；
第二，利用本發(fā)明的微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法可以在肉鵝的生命早期(出生后I周內(nèi))即開始選擇屠體性狀，而不必做昂貴的成年肉鵝屠宰試驗，可以縮短世代間隔，提高選擇強度，能夠較早地選擇出優(yōu)良的種鵝親本，從而加速肉鵝的育種進程，與傳統(tǒng)的屠宰試驗選擇方法比較每代可縮短選擇時間3個月左右；
第三，利用本發(fā)明的微衛(wèi)星分子標(biāo)記方法對肉鵝屠體性狀進行選擇，不僅可為肉鵝育種工作中標(biāo)記輔助選擇提供一個更為有效、簡便易行的分子標(biāo)記方法，同時可以克服常規(guī)屠體性狀選擇方法工作量大、易受環(huán)境影響和育種周期長等缺點，為肉鵝屠體性狀改良提供一種有效的分子標(biāo)記育種手段，從而加速肉鵝的遺傳進展。
具體實施例方式通過以下實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但應(yīng)當(dāng)理解本發(fā)明并不受以下內(nèi)容所限止。以下實施例所米用的」& Taq, dNTPs, 10 X Ex Taq Buffer, 6 X loading buffer和100 bp ladder molecular size standard均購自寶生物工程(大連)有限公司。實施例I :(太湖鵝屠體性狀的選擇)
(1)設(shè)計鵝RY36位點的特異性引物根據(jù)鵝微衛(wèi)星位點RY36兩端的側(cè)翼序列設(shè)計一對特異性引物 RYF :5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ 和 RYR :5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’；
(2)太湖鵝屠體性狀測定太湖鵝屠體性狀測定的指標(biāo)有屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率，參照陳偉生，2006《畜禽遺傳資源調(diào)查技術(shù)手冊》操作；
(3)PCR擴增反應(yīng)在太湖鵝群體選擇150只預(yù)留種個體，翅靜脈采集血液，按常規(guī)酚-氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進行PCR擴增反應(yīng)，所采用的反應(yīng)體系為 IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1 dNTPs3· 0 μ L，5. OU. μ Taq 酶 O. 25 μ L, 10 μ mol/L 上游引物 O. 4 μ L, 10 μ mol/L 下游引物
O.4 μ L，50 ng. μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 95 μ L ；PCR 擴增反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性4min;28 個循環(huán)(94°C 40 S,60°C 30 S，72°C 30s )，72°C延伸 5min，4°C保存；
(4)PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析先配制6%的變性聚丙烯酸胺凝膠用于PAGE電泳檢測，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至60 ml后備用；取PCR產(chǎn)物5 μ I與等體積的6 X loading buffer混合，加樣到6%的變性聚丙烯酞胺凝膠上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)為分子量標(biāo)記，300 V電壓電泳2. 5 h ;電泳結(jié)束后立即進行銀染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去離子水清洗3次，每次2 min,再用已加入終濃度為I. 5 ml/L甲醛的0. I %AgN03染色30 min ;去離子水快速沖洗10 s ;再使用已加入終濃度為3 ml/L甲醒的3 %碳酸鈉顯影；最后用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5軟件分析微衛(wèi)星位點RY36的基因型，篩選出AC、AD、BD、CC、⑶、CG、DD、DE和EF 9種基因型的肉鵝個體；最小二乘法 分析獲得150只預(yù)留種個體不同基因型與屠體性狀的相關(guān)性；
這里以其中10只預(yù)留種個體為例說明，10只太湖鵝個體的基因型和測定得到的屠體性狀數(shù)值見表I。表I RY36位點不同基因型太湖鵝個體的屠宰性能
權(quán)利要求
1.肉鵝屠體性狀微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法，其特征在于按以下步驟進行 (O設(shè)計鵝RY36位點的特異性引物根據(jù)鵝微衛(wèi)星位點RY36兩端的側(cè)翼序列設(shè)計一對特異性引物， 其上游引物序列為 RYF: 5’ -TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’ ； 其下游引物序列為 RYR:5’ - GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’ ； (2)肉鵝屠體性狀測定肉鵝屠體性狀測定的指標(biāo)有屠宰率、半凈膛率、全凈膛率、胸肌率和腿肌率，參照陳偉生，2006《畜禽遺傳資源調(diào)查技術(shù)手冊》操作； (3)PCR擴增反應(yīng)在每個肉鵝群體隨機選擇100-200只肉鵝個體，翅靜脈采集血液，按常規(guī)酚-氯仿方法提取血液基因組DNA，并采用上述引物和基因組DNA模板進行PCR擴增反應(yīng),所采用的反應(yīng)體系為 IOX Ex Taq Buffer (Mg2+ Plus) 2. 5 μ L, 2. 5 mmol·!/1dNTPs I. 0-3. 0μ L,5. 0U· μ U1Bx Taq 酶 0· 15-0. 35 μ L，10 μ mol/L 上游引物 0· 4_0· 6 μ L，.1(^11101/1下游引物0.4-0.6 4 1^，50 ng· μ Γ1 模板 DNA O. 5 μ L, ddH20 17. 45-20. 05 μ L ；PCR 擴增反應(yīng)程序為 94°C預(yù)變性 4min，按 94°C 40 S,50-60°C 30 S、72°C 30S28-35 個循環(huán)，72 °C延伸5min，4°C保存； (4)PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析先配制6%的變性聚丙烯酸胺凝膠用于PAGE電泳檢測，其中聚丙烯 9ml，尿素 25. 29g，5XTBE12 ml, 10 % AP S600 μ I, TEMED 60 μ I 并加水至.60 ml后備用；取PCR產(chǎn)物5 μ I與等體積的6 X loading buffer混合，加樣到6%的變性聚丙烯酞胺凝膠上，并以100 bp ladder molecular size standard(Takara)為分子量標(biāo)記，.300 V電壓電泳2. 5 h ;電泳結(jié)束后立即進行銀染，首先用10 %冰醋酸固定加20 min，然后用去離子水清洗3次，每次2 min,再用已加入終濃度為I. 5 ml/L甲醛的0. I %AgN03染色.30 min ;去離子水快速沖洗10 s ;再使用已加入終濃度為3 ml/L甲醒的3 %碳酸鈉顯影；最后再用10 %的冰醋酸固定5 min;以gene mapper version 3· 5軟件分析微衛(wèi)星位點RY36的基因型，篩選出AC、AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF 9種基因型肉鵝個體； (5)優(yōu)勝肉鵝親本個體的選擇選留AC基因型的個體作為肉鵝選擇親本，淘汰AD、BD、CC、CD、CG、DD、DE和EF基因型的個體。
全文摘要
本發(fā)明公開了肉鵝屠體性狀微衛(wèi)星分子標(biāo)記選擇方法，屬于家禽選育技術(shù)領(lǐng)域。該方法包括(1)設(shè)計鵝RY36位點的特異性引物上游引物為5’-TCCCAGCTTCACTCCTTTTC-3’；下游引物為5’-GTGGTGTTCTTGCGGTGTAG-3’；(2)肉鵝屠體性狀測定；(3)PCR擴增反應(yīng)；(4)PCR擴增產(chǎn)物的多態(tài)性分析；(5)優(yōu)勝肉鵝親本個體的選擇等步驟工藝。本發(fā)明是依據(jù)基因型進行肉鵝屠體性狀選擇，精確度高，操作簡單；可以在肉鵝生命早期開始選擇屠體性狀，縮短世代間隔，加速肉鵝育種進程，每代可縮短選擇時間3個月左右；該方法可在家禽育種領(lǐng)域中推廣應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102719549SQ20121023664
公開日2012年10月10日 申請日期2012年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月10日
發(fā)明者盧立志, 徐堅, 李國勤, 李進軍, 沈軍達, 王德前, 田勇, 陳黎, 陶爭榮 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院