專利名稱：沙門氏菌腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌pcr焦磷酸法的檢測引物試劑盒和檢測方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測引物、試劑盒和檢測方法。
背景技術：
沙門氏菌(Salmonella，Sa.)是重要的食源性致病菌之一，在世界各國細菌性食物中毒病例中，Sa引起的食物中毒案例常列榜首或第二位。隨著分子生物學的發展，已有針對沙門氏菌 invA、16s rRNA、SpvC、invB、fimA、agfA、SEF14、sefA、sdf、ssaQ、fimY 等基因為目標基因，用普通PCR或熒光PCR檢測沙門氏菌的報道，雖然這些方法可達到快速、高通量的目的，但卻無法獲得分子診斷的黃金標準-基因序列，因此有出現假陽性的可能。 焦磷酸測序(pyrosequencing)技術是近年來發明的一項實時地進行短片段DNA測序技木，該技術在DNA序列分析時不需要電泳和熒光標記，直接測定引物后面的堿基序列，通過提供可靠的序列信息來確認PCR產物，同時由于主要分析PCR產物雙鏈中的一條鏈的序列，避免了由于DNA鏈的ニ級結構造成的人工假象，使測序結果更加準確，目前應用于基因表達病毒檢測、SNP分析、耐藥基因檢測、真菌鑒定、DNA甲基化分析等多個領域。焦磷酸測序是ー種基于合成的新型DNA測序技術，在特異引物的引導下，根據待測序列分別加入四種核苷酸，在延伸的過程中釋放焦磷酸，后者在ATP硫酸化酶和熒光酶的偶聯反應中釋放熒光，通過檢測器檢測相應的熒光強度，從而獲得檢測樣本中的核苷酸序列，是ー種非常實用的短序列實時檢測技術，定量準確、易于自動化、能實現高通量的大樣本的快速檢測，具有DNA測序法無法比擬的優勢，已應用于臨床微生物的分型鑒定及耐藥監測。李秀娟等以fimy為目的基因用PCR-焦磷酸測序法從屬的水平上檢測159株不同來源的沙門氏菌，但該方法不能區分不同血清型沙門氏菌，文章中也未說明檢測的159株沙門氏菌血清型，其特異性有待進ー步驗證(李秀娟，田會方)。

發明內容
本發明的目的是提供簡便、快捷、準確性高、特異性強的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測引物、試劑盒和檢測方法。本發明根據沙門氏菌aceA基因(GenBank:U43344. I)、腸炎沙門氏菌(SE)特異序列(GenBank:AF370707. I)、鼠傷寒沙門氏菌(ST)的STM4599序列(GenBank:AERVO1000023. I),分別設計擴增引物和測序引物，建立了結合PCR-焦磷酸測序從DNA序列水平上檢測沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的方法，從而實現了本發明的目的。本發明的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測引物，其特征在于包括PCR引物和測序引物針對沙門氏菌的PCR引物
5’ -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’ ；(如 SEQ ID NO. I 所示)5’ -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)測序引物5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示) 針對腸炎沙門氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)5，-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)測序引物5’-AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 6 所示)針對鼠傷寒沙門氏菌的PCR引物
5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 7 所示)5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3，；(如 SEQ ID NO. 8 所示)測序引物5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)。本發明的第二個目的是提供沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試齊U，PCR引物和測序引物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為針對沙門氏菌的PCR引物5，-TCACCGAAAGACCAACAGAA-3’ ；(如 SEQ ID NO. I 所示)5’ -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)測序引物5’-CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 3 所示)針對腸炎沙門氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 4 所示)5，-TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ；(如 SEQ ID NO. 5 所示)測序引物5’-AAAAAGGITTAGTAAATCAG-3’ ；(如 SEQ ID NO. 6 所示)針對鼠傷寒沙門氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3，；(如 SEQ ID NO. 7 所示)5，-GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3，；(如 SEQ ID NO. 8 所示)測序引物5’-AGTATTGATAAATAATGGTT-3’ ；(如 SEQ ID NO. 9 所示)。本發明的第三個目的是提供一種非診斷目的的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板；(2)分別使用上述PCR引物分別進行PCR反應，回收PCR產物，制備單鏈模版，然后應用上述測序引物對相應的PCR產物進行焦磷酸測序，自測序引物3\端后的第一個堿基開始測序，當前30個堿基序列為GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT時，判斷樣品中含有沙門氏菌，當前30個堿基序列為CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC時，判斷樣品中含有腸炎沙門氏菌，當前30個堿基序列為TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC時，判斷樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌。所述的樣品可以為食品，肉制品，如豬肉，和海鮮，如售賣的對蝦。優選，所述的PCR反應，其擴增體系為50 μ L，PCR Mix Buffer 25 μ 1，Taq酶5 μ 1，MgCl2 I μ I, 10 μ M上、下游引物各2 μ I,DNA模板I μ I,去離子水14 μ I,PCR反應條件為預變性 95°C 5min ；95°C 15s，65°C 30s, ,72°C 30s，45 個循環；72°C 12min。
本發明根據沙門氏菌(Sa)aceA基因、腸炎沙門氏菌(SE)特異序列、鼠傷寒沙門氏菌(ST)的STM4599序列中的保守區域，分別設計擴增引物和測序引物，建立了 PCR-焦磷酸測序，從DNA堿基序列水平上檢測Sa、SE和ST的方法。本發明先對目標片段進行PCR擴增，保證擴增片段的特異性，再用擴增產物制備單鏈模板，在測序引物的引導下進行焦磷酸測序。檢測的所得堿基序列與已知序列比對判斷結果，即測序引物后前30個堿基序列為GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT,判斷樣品中含有沙門氏菌,測序引物后前30個堿基序列為為 CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC 和 TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC，則分別判斷含有腸炎沙門氏菌(SE)和鼠傷寒沙門氏菌(ST)。PCR擴增實驗結果，aceA、SE和ST擴增引物具有較好的特異性，24株不同血清型Sa、16株SE和6株ST分別擴增出大小81bp、176bp和131bp的DNA片段，而其他對照菌株未擴增出DNA條帶。焦磷酸測序結果顯示，24株Sa、16株SE和6株ST的測序有效DNA堿基數分別為31bp-36bp、31bp-39bp、34bp_36bp，均超過需檢測的30bp DNA喊基序列，而其他對照囷株未測出DNA喊基序列。I旲擬樣品檢測結果，焦磷酸測序法與傳統檢測方法一致，但在檢測周期上，傳統方法需要培養、劃線分離、生化鑒定、血清分型等，需要5d-6d，而焦磷酸測序方法BP第一次增菌10h，TTB第二次增菌18h，核酸提取、PCR擴增和焦磷酸測序3h，整個試驗31h完成，簡便快捷，而且可通過DNA堿基序列從屬的水平上檢測沙門氏菌的同時可對其分型，判定所檢測Sa是否為SE和ST血清 型，避免了單純PCR擴增檢測易污染造成的假陽性結果，準確性高。因此本發明具有較好的應用前景。


圖I 是 24 株 Sa 的 aceA 擴增產物電泳圖，其中 M :50bp marker, I SE ATCC13076,
2ST ATCC14028,3-24 :Sal_Sa22 ；圖2是Sa的aceA特異性實驗擴增產物電泳圖，其中M 50bp maker, I SEATCC13076，2 ST ATCC14028，3 :阪崎腸桿菌 ATCC29544，4 :大腸桿菌 ATCC25922，5 :小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221，6 :金黃色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志賀氏菌NICPBP51252，8 :單增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去離子水；圖3 是 SE 的擴增產物電泳圖，其中 M 50bpmaker, I SE ATCC13076，2-16 SE1-SE15，17 :去離子水；圖4是SE特異性實驗擴增產物電泳圖，其中M 50bp maker, I SE ATCC13076，2 ST ATCC14028，3 :阪崎腸桿菌ATCC29544，4 :大腸桿菌ATCC25922，5 :小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221，6 :金黃色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志賀氏菌NICPBP51252，8 :單增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10:去離子水；圖5是SE特異性實驗擴增產物電泳圖，其中M 50bp maker, I SE ATCC13076,2-23 Sal-Sa22,24 :去離子水；圖6 是 ST 擴增產物電泳圖，其中 M 50bp maker, I ST ATCC14028，2-6 :ST1_ST5，7 :去離子水；圖7是ST特異性實驗擴增產物電泳圖，其中M 50bp maker, I ST ATCC14028，2 SE ATCC13076，3 :阪崎腸桿菌ATCC29544，4 :大腸桿菌ATCC25922，5 :小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221，6 :金黃色葡萄球菌ATCC6538，7 :痢疾志賀氏菌NICPBP51252，8 :單增李斯特菌ATCC19115，9 :肺炎克雷伯氏菌CMCC46102，10 :副溶血性弧菌ATCC33847, 11 :去離子水；圖8是ST特異性實驗擴增產物電泳圖，其中M 50bp maker, I ST ATCC14028,2-23 Sal-Sa22,24 :去離子水；圖9是Sa3焦磷酸測序結果圖；圖10是陰性對照(單增李斯特氏菌)焦磷酸測序結果圖；圖11是SE2焦磷酸測序結果圖；圖12是ST2焦磷酸測序結果具體實施例方式以下實施例是對本發明的進ー步說明，而不是對本發明的限制。 實施例I :I、材料和方法I. I菌株來源24種不同血清型沙門氏菌44株，其中SE、ST標準菌株各I株，不同食品中分離的非SE、非ST不同血清型Sa25株，SE分離株15株，ST分離株5株，菌株信息見表I。陰性對照菌株8株，分別為單增李斯特菌ATCC19115、金黃色葡萄球菌ATCC6538、阪崎腸桿菌ATCC29544、大腸桿菌ATCC25922、痢疾志賀氏菌NICPBP51252、小腸結腸炎耶爾森氏菌CMCC52221、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、副溶血性弧菌ATCC33847。上述菌株來自中國普通微生物菌種保藏管理中心、廣東省疾病預防控制中心、中國檢驗檢疫科學研究院、廣東出入境檢驗檢疫局技術中心。所有菌株均經VITEK2和API試劑條以及血清學實驗進行確證。表I :沙門氏菌(Sa)菌株信息
權利要求
1.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測引物，其特征在于包括PCR引物和測序引物 針對沙門氏菌的PCR引物5， -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3，；5， -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3，； 測序引物5 ’ -CGAAAGACCAACAGAAG-3，； 針對腸炎沙門氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；5’ -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ； 測序引物5 ’ -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3，； 針對鼠傷寒沙門氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’ ； 測序引物5 ’ -AGTATTGATAAATAATGGTT-3，。
2.一種沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR-焦磷酸法的檢測試劑盒，包括DNA提取試劑，PCR反應試劑，單鏈模板制備試劑，焦磷酸測序試劑，PCR引物和測序弓I物，其特征在于，所述的PCR引物和測序引物為 針對沙門氏菌的PCR引物5， -TCACCGAAAGACCAACAGAA-3，；5， -GGTGGAACTCGCTGAAATGA-3，； 測序引物5’ -CGAAAGACCAACAGAAG-3’ ； 針對腸炎沙門氏菌的PCR引物5’ -GCATGTTCTGGAAAGCCTCTTTAT-3’ ；5’ -TCGTTCTTCTGGTACTTACGATGA-3’ ； 測序引物5’ -AAAAAGGTTTAGTAAATCAG-3’ ； 針對鼠傷寒沙門氏菌的PCR引物5’ -AAGCTAAGTGTGGGGGCTAGTAT-3’ ；5’ -GGGTTTGTTTTTGATGATACAGG-3’ ； 測序引物5’ -AGTATTGATAAATAATGGTT-3’。
3.一種非診斷目的的沙門氏菌、腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)對樣品進行增菌培養，提取增菌液中菌體的基因組DNA作為模板； (2)分別使用權利要求I所述的PCR引物分別進行PCR反應，回收PCR產物，制備單鏈模版，然后應用權利要求I所述的測序引物對相應的PCR產物進行焦磷酸測序，自測序引物3 \端后的第一個堿基開始測序，當前3 O個堿基序列為GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT時，判斷樣品中含有沙門氏菌，當前30個堿基序列為CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC時，判斷樣品中含有腸炎沙門氏菌，當前30個堿基序列為TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC時，判斷樣品中含有鼠傷寒沙門氏菌。
4.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的樣品為食品或海鮮。
5.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述的食品為肉制品。
6.根據權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述的肉制品為豬肉。
7.根據權利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述的海鮮為售賣的對蝦。
8.根據權利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述的PCR反應，其擴增體系為.50 μ L,PCR Mix Buffer 25 μ l，Taq 酶 5μ IjMgCl2 I μ 1，10 μ M 上、下游引物各 2 μ 1，DNA 模板 I μ I，去離子水 14μ 1，PCR 反應條件為預變性 95°C 5min ；95°C 15s，65。。30s，，72。。30s，.45 個循環-JTC 12min。
全文摘要
本發明公開了一種沙門氏菌腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌PCR焦磷酸法的檢測引物試劑盒和檢測方法。本發明根據沙門氏菌aceA基因、腸炎沙門氏菌特異序列、鼠傷寒沙門氏菌的STM4599序列中的保守區域，分別設計擴增引物和測序引物，對目標片段進行PCR擴增，再用擴增產物制備單鏈模板，進行焦磷酸測序，測序引物后前30個堿基序列為GCCTGTGGGTACTTCTCCTGCCAGTATAAT判斷樣品中含有沙門氏菌，測序引物后前30個堿基序列為CCTGTTGTCTGCTCACCATTCGCCAGCCAC和TACAACCGGAGTGCACATTAATCCCGCAGC則分別判斷含有腸炎沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌。
文檔編號C12Q1/10GK102851361SQ20121023794
公開日2013年1月2日 申請日期2012年7月10日 優先權日2012年7月10日
發明者許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 相大鵬, 唐勤 申請人:許龍巖, 袁慕云, 曹際娟, 相大鵬, 唐勤