專利名稱：微生物催化法制備2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及菌株的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，以及在生產(chǎn)過程中用到的新菌株。
(ニ)
背景技術(shù)：
2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺,英文名 2-amino_2，3_dimethylbutyamide,外觀為白色片狀晶體，熔點為84°C，能溶于水和大多數(shù)有機溶剤。是咪唑啉酮類超高效除草劑如咪唑 こ煙酸、咪唑喹啉酸和甲氧咪草煙等的通用中間體，市場需求廣闊。其中味唑こ煙酸和咪唑喹啉酸曾占據(jù)美國大豆除草劑市場主導地位達10年之久；而我國自從1990年大批量進ロ咪唑こ煙酸并在黑龍江省大面積應用以來，用量持續(xù)增加。特別是在國內(nèi)該除草劑產(chǎn)品問世以后，由于其價格低廉，除草效果良好，故而被大范圍使用，成為黑龍江與內(nèi)蒙古地區(qū)大豆田除草劑的主導品種。2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺目前主要通過化學法生產(chǎn)。其生產(chǎn)過程可分為兩個部分3_甲基-2-丁酮通過斯特雷克(Strecker)反應得到氨基腈，后者在酸或堿催化下水解
得到產(chǎn)物(見下式)。
NH2NH2O
NaCN 卜H2S°4 ‘ /T^axNH2
NH4ClNH4OH孫曉紅等(西北大學學報，1994，24 (3) :227_234)報道了該氨基腈的合成方法，先將氯化銨溶于水后，加入氰化鈉和氨水，攪拌均勻后，加少量芐基三こ基氯化銨，滴加甲基異丙基甲酮，攪拌回流4飛小時，用ニ氯甲烷提純后，得無色透明液體，純度為95%，收率為90%。Peter J.等(US 6339158)報道了由2_氨基_2，3_ ニ甲基丁腈制備2_氨基-2，3- ニ甲基酰胺的方法，首先加入29. 7ml濃硫酸，慢慢加入11. 8g2_氨基-2，3- ニ甲基丁腈，保證反應體系溫度不超過25°C，加熱至100°C并在該溫度下反應lh，反應結(jié)束后冷卻，加入85ml濃氨水，過程中控制體系溫度不超過75°C，然后用ニ氯甲烷萃取、結(jié)晶，最終得到11. 2g2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，收率為81.7%。呂曉東等(遼寧化工，2001，30 (10)455-456)報道將2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈在一定的溫度下滴加入95%的濃硫酸中，升溫，反應數(shù)小吋。反應完畢后，冷卻至室溫，滴加濃氨水中和至弱堿性，加萃取劑，攪拌一定時間，過濾，濾出物用萃取劑洗滌，并將洗液合并入濾液。濾液相分離，有機層蒸出萃取劑，釜底物加入石油醚，冷凍結(jié)晶，濾出的固體干燥后得到2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺，最終收率為95%，產(chǎn)物純度達到96%。由上可知，化學法生產(chǎn)2-氨基-2，3-ニ甲基酰胺的主要缺點是反應需要高溫、強酸等條件，能耗原料消耗高，產(chǎn)品易受副產(chǎn)物污染，提純步驟繁瑣，周期長，收率低，產(chǎn)生大量含腈污水，不符合環(huán)保要求等。腈水合酶(Nitrile Hydratase)是ー種在自然界中廣泛存在的微生物酶，它可催化多種腈化合物水解生成酰胺。微生物腈水合酶可廣泛地應用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成。1980 年，Asano 等(Agricultural and Biological Chemistry,1982,46(5) :1183-1189)首次發(fā)現(xiàn)微生物 Rhodocococcus sp. N-774 可降解有毒的 ZJ青，不久即被成功地應用于エ業(yè)生產(chǎn)丙烯酰胺。近年來，腈水合酶也被用于制備手性藥物，如Gilligan 等(Applied Microbiology and Biotechnology, 1993, 39:720-725)成功地用Rhodocococcus equi TG328腈水合酶和酰胺酶催化外消旋2_苯基丙腈立體選擇性水解,生成了非留體類抗炎藥S-(+)_2-苯基丙酸?，F(xiàn)有的研究表明，腈水合酶催化的反應具有高選擇性、高效性、條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產(chǎn)物光學純度高等優(yōu)點，符合原子經(jīng)濟和綠色化學的發(fā)展方向，有著化學方法無可比擬的優(yōu)越性，從而促進了精細化工產(chǎn)品和手性藥 物的研制和開發(fā)。因此利用腈水合酶的高效性、高選擇性和反應條件溫和等特點來催化生產(chǎn)2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，將可以提高產(chǎn)率和產(chǎn)品質(zhì)量、降低生產(chǎn)成本和減小環(huán)境污染。據(jù)報道，a -氨基腈在水溶液中極不穩(wěn)定，容易自發(fā)水解生產(chǎn)HCN和酮(醛)等物質(zhì)(Engineering in Life Sciences, 2004. 4:547-556)。這些副產(chǎn)物特別是 HCN 是臆水合酶的強烈抑制劑，它通過與腈水合酶活性中心的金屬離子Fe2+或Co2+絡合而使腈水合酶失活。Nagasawa 等(European Journal of Biochemistry, 1991. 196:581-589)報道，作為生產(chǎn)丙烯酰胺的高效催化劑Rhodococcus rhodochrous Jl生產(chǎn)的腈水合酶,在氰離子濃度為0. OlmM時即酶活損失62%。因此篩選得到耐受氰離子的腈水合酶，將有利于實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺，提高產(chǎn)物濃度。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述化學合成法的缺陷，本發(fā)明提供了ー種微生物催化水合2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制備2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺(ADBA)的方法，及制備過程中所用的新菌株。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈為底物，以慶筌紅球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050發(fā)酵產(chǎn)生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。所述腈水合酶存在于菌體細胞中，具體制備時，可直接將發(fā)酵獲得的含菌體細胞的發(fā)酵液作為催化劑參與反應，也可以將菌體細胞分離后，作為催化劑參與反應，所述腈水合酶用于催化2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈制備2-氨基-2，3- ニ甲基酰胺的反應原理如下列
反應式所示
權(quán)利要求
1.ー種微生物催化法制備2-氨基-2，3-ニ甲基丁酰胺的方法，所述方法包括在以2-氨基-2，3_ ニ甲基丁腈為底物，以慶筌紅球菌(Rhodococcus qingshengii) CCTCC No:M2010050發(fā)酵產(chǎn)生的腈水合酶為催化劑的反應體系中，于pH6. (TlO. 0、2(T40°C下進行催化水合反應，制得所述的2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
2.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述反應在水或pH6.(TlO. O的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中進行。
3.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述反應體系中底物初始濃度為0.03、. 3M。
4.如權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述腈水合酶來自慶笙紅球菌CCTCCNo:M2010050經(jīng)發(fā)酵獲得的含酶菌體細胞，所述含酶菌體細胞在反應體系中添加量以含酶細胞濕重計為5 50g/L。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述含酶菌體細胞由如下方法制備得到 (1)將經(jīng)斜面活化的慶笙紅球菌CCTCCNo :M2010050接入種子培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)24 48h，獲得種子液；所述種子培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖5 20. Og/L，酵母浸出粉 2 8. Og/L，蛋白胨 I 4. Og/L, KH2PO4O. 5 I. 5g/L, K2HPO4O. 5 I. 5g/L, NaClO. 5 3. Og/L,己內(nèi)酰胺 0. 5 2. Og/L, MgSO4O. 05 0. 2g/L, CoCl2O. 01 0. 05g/L, FeSO4O. 01 0. 05g/L,溶劑為水，pH6. 0 8. 0 ； (2)將種子液以1 10%體積比接入產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于2(T40°C下培養(yǎng)48 96h，培養(yǎng)得到的發(fā)酵液經(jīng)離心或膜分離，得所述含酶菌體細胞；所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基終濃度組成如下蔗糖5. (TlO. 0g/L,檸檬酸鈉2. 0 5. 0g/L,牛肉膏2. 0 8. 0g/L,酵母粉2. 0 8. 0g/L,氯化鈉0. 5 2. 0g/L,磷酸ニ氫鉀0. 5 2. 5g/L，氯化鈷0. 005 0. 01g/L,氯化鐵0. 005 0. 01g/L,氯化錳0. 005 0. 01g/L，誘導劑I. 0 3. 0g/L，溶劑為水，pH6. 0 8. 0 ;所述誘導劑為下列之一:谷氨酸鈉、2，2-ニ甲基環(huán)丙甲酰胺、己內(nèi)酰胺、丙烯酰胺、こ酰胺或尿素。
6.如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于所述方法如下將所述含酶菌體細胞用生理鹽水洗滌后，懸浮于水或pH6. (TlO. 0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、磷酸鹽緩沖液、Tris-HCl緩沖液或甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液中，加入底物2-氨基-2，3-ニ甲基丁腈至底物濃度為0. 03^0. 3M，于15 40°C、10(T200rpm下反應l(T60min ;反應結(jié)束后，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化得到所述2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述分離純化方法如下反應結(jié)束后，取轉(zhuǎn)化液12000rpm離心IOmin,收集上清液；加入粉末活性炭，加熱攪拌脫色30min后轉(zhuǎn)入真空抽濾裝置抽濾，得到脫色清液；脫色清液轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，在真空度-0. IMpa，水浴加熱溫度4(T60°C、轉(zhuǎn)速6(Tl00rpm條件下減壓蒸發(fā)除去底物2-氨基-2，3- ニ甲基丁腈和水，冷卻得到2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品；將2-氨基-2，3- ニ甲基丁酰胺粗品溶于2(T65°C的こ酸こ酷，加入體積為こ酸こ酯體積10%鹽析劑正己燒，于0 4°C保溫結(jié)晶；過濾，取濾渣用正己燒洗漆，干燥得到2-氨基_2，3- ニ甲基丁酰胺晶體。
8.慶筌紅球菌(Rhodococcusqingshengii)ZJB_09153,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國，武漢，武漢大學，430072，保藏編號CCTCC No :M2010050，保藏日期2010年3月10日。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物法生產(chǎn)咪唑啉酮類超高效除草劑中間體2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺的方法及其過程中所用的菌株。本方法以2-氨基-2,3-二甲基丁腈為原料，以通過發(fā)酵培養(yǎng)微生物慶笙紅球菌(Rhodococcus qingshengii)CCTCC NoM2010050生產(chǎn)的腈水合酶為催化劑生產(chǎn)2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺。本方法反應條件溫和，廢水排放少，環(huán)境友好；產(chǎn)率高，轉(zhuǎn)化時間短，成本低，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P13/02GK102776253SQ20121023954
公開日2012年11月14日 申請日期2010年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月21日
發(fā)明者林志堅, 沈寅初, 鄭仁朝, 鄭裕國 申請人:浙江工業(yè)大學