專利名稱：一種基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法
技術領域：
本發明涉及將微流控芯片技術應用到實時監測的細胞生物學研究的技術領域，具體涉及一種基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法。
背景技術：
細胞生物學發展至今,主要的培養和研究依賴于是孔板和商品化的transwell小室，集中觀察單一或者多種因素刺激下細胞形態變化、生長過程、遷移和增值行為等。而在眾多的細胞行為研究中，細胞遷移作為生物體發育和形態建成等重要生命過程的基礎，而備受關注。細胞遷移一般起始于細胞對其微環境刺激的感應，微環境刺激通過細胞表面受體激活一系列的胞內信號轉導通路與基因轉錄，并進而通過細胞極性的改變、細胞的粘附及去粘附、細胞骨架的重排等多個環節，最終完成細胞形態和位置的改變。對于腫瘤細胞而言，其遷移過程與腫瘤轉移密切相關，腫瘤轉移是一個多步驟連續性很強的主動過程，可分 為以下幾個步驟，即局部浸潤、滲入血管、隨血液循環系統轉移并在其中存活、腫瘤細胞外滲移出血管、在新的部位定居并增殖。腫瘤細胞遷移涉及到腫瘤細胞從二維的血管微環境進入周圍三維微組織的過程，也是腫瘤轉移發生過程決速步的過程?？装寤蛘遲ranswell小室很難在體外構建二維平面到三維空間的界面轉換，所以想模擬和重現上述腫瘤細胞遷移過程是比較困難的。微流控芯片技術作為一門迅速發展起來的科學技術，已經在生物醫學領域展現了其獨特的優勢，更因其同細胞尺寸匹配、環境同生理環境相近、在時間和空間維度上能夠提供更為精確的操控，易于通過靈活設計實現多種細胞功能研究等特點而成為新一代細胞研究的重要平臺。它對于實驗結果能夠實時追蹤，不僅能夠獲得最終結果，也可以得到細胞遷移過程中出現的暫時性信息，為腫瘤細胞遷移過程提供常規分析中有可能缺失的重要生物學信息。而目前，利用微流控芯片進行腫瘤細胞遷移動力學過程監測，尤其是腫瘤細胞從二維平面遷移運動到三維基質過程的研究分析還處于空白階段。

發明內容
本發明的目的是提供一種基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，特別針對腫瘤細胞從二維平面遷移運動到三維基質中的過程，該方法具有對細胞運動實時追蹤的特點，同時能夠實現對細胞運動之初的準確定位。本發明提供了一種微流控芯片，該微流控芯片主要由細胞入口池(1)，膠原入口池(2 )，廢液池(3 )，細胞培養室(4 )，細胞遷移室(5 )組成；細胞培養室(5 )上連細胞入口池(I )，細胞培養室(5)下連廢液池(3)，一個細胞培養室橫向與三個細胞遷移室相連。本發明提供的微流控芯片，所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。本發明提供的微流控芯片，所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45S進行封接。
本發明提供的微流控芯片，所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成(I)、(3)、(4)高度約為(2)和(5)高度的三倍；其中，(I)、(3)、(4)高度為210 iim，(2)和(5)高度為70 u m0本發明還提供了一種基于所述的微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，方法過程如下(I)芯片膠原灌注用移液器將配制好的膠原工作液加入膠原入口池，每孔0. 4 i! L ;加ImLPBS緩沖液于培養皿中，將固定芯片的培養皿放入培養箱中孵育30min，促使膠原由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠過程結束后，從細胞入口池、膠原入口池分別順序加入新鮮的細胞培養液；(2)芯片細胞接種及培養
細胞消化后，調整細胞密度為I X 106/mL,取10 ii L細胞懸液加入細胞入口池，并迅速從廢液池吸走0. 5 ii L細胞培養液，促使細胞在重力流的作用下快速、均勻地進入細胞培養室；當在光學顯微鏡下觀察到已經有部分細胞流入廢液池，而細胞培養室中的細胞也均勻分布時，立即將芯片豎立，并移入37°C培養箱中放置。豎立方向為細胞培養室朝上，而細胞遷移室朝下；豎立放置IOmin后，取出觀察，如果細胞緊貼在細胞培養室與遷移室的交匯處，說明細胞接種比較成功；將芯片放平移入37°C培養箱中繼續培養、每隔24h換液一次，并拍照記錄腫瘤細胞所在位置；(3)芯片細胞遷移實時監測采用活細胞工作站CO2顯微載物臺培養箱進行細胞長期觀察，開啟儀器，同時打開空氣、二氧化碳氣瓶，調節閥門，保持氣體保持在刻度值0. 8，0. 04，兩種空氣在此比例下，可以保證載物臺培養箱內5%的CO2濃度，調節其溫度在37°C，儀器穩定30min左右，將固定芯片的培養皿放入載物臺培養箱，調節焦距及拍攝參數，每隔60min拍照一張，實時記錄細胞運動位置及形態改變；細胞遷移入13父原后蛋白表達檢測腫瘤細胞接種到芯片上，培養3天后，進行細胞免疫熒光染色，具體步驟如下多聚甲醛固定，緩沖液沖洗；致孔劑作用，緩沖液沖洗；封閉血清作用，一抗4°C過夜孵育，緩沖液沖洗；二抗常溫孵育，緩沖液沖洗后，加入細胞核標記染料，熒光顯微鏡下拍照，記錄細胞內檢測蛋白的表達情況。本發明提供的基于微流控芯片技術的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，所述膠原為I型鼠尾膠原，常溫下它是呈粘稠狀的液體，當pH=7，溫度達到37°C的情況下，孵育30min，即可呈現果凍狀的凝膠。本發明提供的基于微流控芯片技術的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，可采用生物學上常用的細胞檢測手段對遷移運動到膠原中的細胞進行檢測，包括細胞死活標記染色、細胞免疫熒光染色、PCR檢測、蛋白質檢測等。


圖I本發明微流控芯片整體結構示意圖；其中，黑色區域的芯片高度為65i!m，灰色區域的芯片高度為200 iim;圖2微流控芯片膠原加入后形成的二維平面與三維基質的清晰界面；
圖3芯片細胞接種后豎立IOmin時的細胞貼附情況；圖4不同濃度的膠原在37 °C培養箱中孵育30min后的凝結情況；圖5 HepG-2細胞在不同濃度膠原中遷移面積與培養時間的關系圖；圖6 HepG-2細胞遷移進入2. 5mg/mL濃度的膠原前后形態變化，Ca) 二維平面培養；(b)三維2. 5mg/mL濃 度的膠原中；圖7 HepG-2細胞遷移進入膠原前后細胞比例的統計分析；圖8 SMMC-7721細胞加入芯片后24h開始的實時監測分析；圖9 SMMC-7721細胞遷移面積與培養時間的關系；圖10加入松弛素D后SMMC-7721細胞遷移行為變化情況；圖11加入松弛素D后SMMC-7721細胞遷移面積與培養時間的關系；圖12 SMMC-7721細胞內F-actin表達情況，(a)明場對照圖片，與下面熒光圖片相對應；(b) 二維平面培養；(c)三維2. 5mg/mL濃度的膠原中。箭頭標識處顯示F-actin的清晰表達。
具體實施例方式下面的實施例將對本發明予以進一步的說明，但并不因此而限制本發明。實施例IHepG-2細胞在不同濃度的膠原中的細胞遷移運動情況配制三種不同濃度的膠原工作液，濃度分別為lmg/mL,2. 5mg/mL, 5mg/mL,不同濃度膠原的膠絲分布如圖4所示。利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片，構型如圖I所示。將膠原灌注到芯片孵育30min后，可以看到膠原與二維平面的清晰界面(圖2)。從細胞入口池加入10 ii LI X 106/mL HepG-2細胞懸液，豎立芯片lOmin，使細胞貼附在膠原一側，如圖3所示。拍照記錄細胞初始位置,每隔24h換液一次,并拍照記錄細胞移動情況。統計HepG-2細胞遷移進入膠原中的面積，可以發現隨著膠原濃度的升高，HepG-2細胞侵入膠原的面積逐漸減小，其結果如圖5所示。同時H印G-2細胞的形態在2. 5mg/mL膠原中發生明顯改變，細胞由鋪路石樣逐漸變為細長的間質樣形態，結果如圖6所示。細胞比例的數據統計分析見圖7所示。實施例2SMMC-7721在2. 5mg/mL膠原中遷移運動實時監測利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片，構型如圖I所示。將2. 5mg/mL的膠原灌注到芯片凝結后，采用與實例I相同的細胞接種和培養方式。細胞接種到芯片24h后，將固定芯片的培養皿放入載物臺培養箱。調節焦距及拍攝參數，每隔60min拍照一張，顯微鏡拍照實時記錄細胞運動位置及形態改變，共拍攝19h,拍攝結果如圖8所示。實施例3加入松弛素D后，SMMC-7721在2. 5mg/mL膠原中遷移運動分析。利用實驗室自行設計并制作的微流控芯片，構型如圖I所示。將2.5mg/mL的膠原灌注到芯片凝結后，采用與實例I相同的細胞接種和培養方式。SMMC-7721細胞遷移到膠原中的面積與培養時間的關系見圖9所示。當細胞接種到芯片24h后，培養液中加入I ii g/mL松弛素D刺激細胞,記錄細胞在松弛素D作用24h的形態變化及遷移行為，結果如圖10所示，SMMC-7721細胞遷移面積與培養時間的關系見圖11所示。實施例4SMMC-7721細胞遷移入膠原后F-actin的表達檢測SMMC-7721細胞接種到芯片上，培養3天后，進行細胞免疫熒光染色，監測蛋白為肌動蛋白F-actin。方法如下4%多聚甲醛進行細胞固定，PBS緩沖液沖洗三次，每次IOmin ；0. 1% triton X-100致孔劑作用lOmin, PBS緩沖液沖洗三次，每次IOmin ;山羊封閉血清作用lh，一抗(兔抗人F-actin) I :100稀釋，4°C過夜孵育，PBS緩沖液沖洗三次，每次IOmin ;二抗(FITC標記的山羊抗兔IgG) 1:100稀釋，常溫孵育lh，PBS緩沖液沖洗三次，每次IOmin ;沖洗完畢后加入1:2000稀釋的DAPI工作液，熒光顯微鏡下拍照，記錄細胞內 F-actin的表達情況，結果如圖12所示。SMMC-7721遷移進入膠原后伴隨著F-actin表達的升高，說明其運動能力在一定程度上得到提高。
權利要求
1.一種微流控芯片，其特征在于該微流控芯片主要由細胞入口池(1)，膠原入口池(2)，廢液池(3)，細胞培養室(4)，細胞遷移室(5)組成；細胞培養室(5)上連細胞入口池(I )，細胞培養室(5)下連廢液池(3)，一個細胞培養室橫向與三個細胞遷移室相連。
2.按照權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片由上下兩層不可逆封接而成，上層材料為可透光透氣的PDMS聚合物，下層材料為濃硫酸煮過的潔凈玻璃。
3.按照權利要求2所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片的上下兩層分別進行紫外過夜照射的滅菌處理，然后等離子體處理30-45S進行封接。
4.按照權利要求I所述的微流控芯片，其特征在于所述微流控芯片是由高度不同的兩部分組成，(I)、(3)、(4)高度約為(2)和(5)高度的三倍。
5.按照權利要求4所述的微流控芯片，其特征在于所述(1)、(3)、(4)高度為210i!m，(2)和(5)高度為70 Um0
6.一種基于權利要求I所述的微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，其特征在于方法過程如下 (1)芯片膠原灌注 用移液器將配制好的膠原工作液加入膠原入口池，將固定芯片的培養皿放入培養箱中孵育一段時間，促使膠原由粘稠狀液體變為果凍狀凝膠，凝膠過程結束后，從細胞入口池、膠原入口池分別順序加入新鮮的細胞培養液； (2)芯片細胞接種及培養 細胞消化后，調整合適的細胞密度，取10 ii L細胞懸液加入細胞入口池，并迅速從廢液池吸走0. 5-2 u L細胞培養液，促使細胞在重力流的作用下快速、均勻地進入細胞培養室；當在光學顯微鏡下觀察到已經有部分細胞流入廢液池，而細胞培養室中的細胞也均勻分布時，立即將芯片豎立，并移入二氧化碳培養箱中放置；豎立方向為細胞培養室朝上，而細胞遷移室朝下；豎立放置5-20min后，取出觀察，如果細胞緊貼在細胞培養室與遷移室的交匯處，說明細胞接種比較成功；將芯片放平移入培養箱中繼續培養、隔24h換液一次，并拍照記錄腫瘤細胞所在位置； (3)芯片細胞遷移實時監測 采用活細胞工作站CO2顯微載物臺培養箱進行細胞長期觀察，開啟儀器，同時打開空氣、二氧化碳氣瓶，調節閥門，保證載物臺培養箱內5%的CO2濃度，調節其溫度在37°C，儀器穩定后，將固定芯片的培養皿放入載物臺培養箱，調節焦距及拍攝參數，每隔一定時間拍照一張，實時記錄細胞運動位置及形態改變；細胞遷移入膠原后蛋白表達檢測。
7.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，其特征在于,芯片膠原灌注時,膠原工作液加入膠原入口池,每孔0.4 ii L ;之后再加ImL PBS緩沖液于培養皿中。
8.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，其特征在于，芯片細胞接種及培養時，所述細胞密度為lX106/mL。
9.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，其特征在于，芯片細胞遷移實時監測時，細胞實時監測每隔5-60min拍照一張，具體時間可依據細胞行為改變進行調整。
10.按照權利要求6所述的基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，其特征在于，所述的蛋白表達檢測的方 法為細胞死活標記染色、細胞免疫熒光染色、PCR檢測、蛋白質檢測。
全文摘要
一種基于微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法，特別針對腫瘤細胞從二維平面遷移運動到三維基質中的過程，該微流控芯片主要由細胞入口池(1)，膠原入口池(2)，廢液池(3)，細胞培養室(4)，細胞遷移室(5)組成；細胞培養室(5)上連細胞入口池(1)，細胞培養室(5)下連廢液池(3)，一個細胞培養室橫向與三個細胞遷移室相連；基于該微流控芯片的腫瘤細胞遷移動力學監測方法具有對細胞運動實時追蹤的特點，同時能夠實現對細胞運動之初的準確定位。
文檔編號C12M1/34GK102746986SQ201210243148
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月13日 優先權日2012年7月13日
發明者秦建華, 許慧, 馬慧朋, 高興華 申請人:中國科學院大連化學物理研究所