Ssx2ip在預防和治療腫瘤轉移中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了SSX2IP在預防和治療腫瘤轉移中的應用。具體地，本發明公開了SSX2IP抑制劑在制備抑制腫瘤轉移或抑制腫瘤細胞遷移的藥物中的用途。SSX2IP抑制劑可作為藥物有效成分抑制腫瘤轉移或抑制腫瘤細胞遷移，還可增加腫瘤細胞對化療藥物敏感性或降低腫瘤細胞對化療藥物耐藥性。此外，本發明的SSX2IP基因或蛋白及其激動劑可用于促進腫瘤細胞的增殖或遷移，用于制備腫瘤動物模型。
【專利說明】SSX21P在預防和治療腫瘤轉移中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及腫瘤學領域。更具體地，本發明涉及SSX2IP抑制劑在預防和治療腫瘤轉移、腫瘤細胞遷移以及化療耐藥性行方面的應用。本發明還涉及SSX2IP基因、蛋白或其激動劑在制備腫瘤模型中的應用。
【背景技術】
[0002]肝細胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，居全球(惡性腫瘤)發病率第五位，癌癥相關死因第三位，在中國其發病率僅次于肺癌，居第二位。
[0003]在肝癌的綜合治療中，手術切除和化療是治療的重要手段，但由于肝癌早期診斷困難，腫瘤轉 移速度快，且對化療藥物敏感度不高，導致各種治療效果不理想，轉移患者預后差。
[0004]此外在不同階段的肝癌患者中，個性化的治療方案尤其重要。但由于缺乏特異性肝癌轉移標志物，治療的時間窗往往在肝癌轉移后才開啟，延誤了預防腫瘤轉移的良好時機。
[0005]因此，本領域迫切需要開發能夠抑制腫瘤轉移、降低化療耐藥性的治療藥物，以及能夠預測或診斷腫瘤轉移尤其是肝癌轉移的特異性標志物，從而能夠預測肝癌轉移，進而為更好地預防或治療腫瘤轉移提供基礎。

【發明內容】

[0006]本發明提供了一種能夠預防和治療腫瘤轉移、腫瘤細胞遷移并能夠提高化療敏感性的SSX2IP抑制劑；本發明還提供了一種對腫瘤轉移或腫瘤耐藥有預防或治療作用藥物的篩選方法。此外，本發明還提供了一種預測或診斷腫瘤是否轉移的試劑盒。
[0007]本發明的第一方面，提供了一種SSX2IP(滑膜肉瘤X斷裂點基因2相互作用蛋白，Synovial Sarcoma X brearkpoint2interacting Protein)抑制劑的用途，用于制備抑制腫瘤轉移或抑制腫瘤細胞遷移的藥物。
[0008]在另一優選例中，所述的SSX2IP蛋白來源于哺乳動物；較佳地，來源于人、小鼠或大鼠；更佳地，來源于人。
[0009]在另一優選例中，所述的腫瘤包括肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0010]在另一優選例中，所述的腫瘤為肝癌。
[0011]在另一優選例中，所述的抑制劑包括:SSX2IP的抗體、SSX2IP核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制劑。
[0012]在另一優選例中，所述的藥物含有藥學上可接受的載體、SSX2IP抑制劑和任選的化療劑。
[0013]在另一優選例中，所述的藥物通過選自下組的用藥方式進行給藥:口服、靜脈注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直腸灌注、鼻腔噴霧、口腔噴霧、皮膚局部或全身經皮用藥。
[0014]在另一優選例中，所述的藥物的制劑選自下組:片劑、膠囊劑、注射劑、顆粒劑、噴霧劑。
[0015]在另一優選例中，所述的SSX2IP抑制劑以0.5_5mg/kg體重的劑量(每次或每天)施用于哺乳動物。
[0016]在另一優選例中，所述的哺乳動物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，為人。
[0017]在另一優選例中，所述的化療劑包括酰胺(CTX)、異環磷酰胺(IFO)、絲裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、長春花堿(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、順鉬(CDDP)、氟尿嘧啶(5-FU)、卡鉬(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)等。
[0018]本發明的第二方面，提供了一種SSX2IP抑制劑的用途，(a)用于制備促進化療或放療誘導的細胞凋亡的藥物組合物，或(b)用于制備促進化療或放療誘導的細胞凋亡的促進劑，或(C)用于制備使得癌細胞對化療或放療誘導的細胞凋亡更敏感的增敏劑。
[0019]在另一優選例中，所述的SSX2IP抑制劑用于癌癥治療的增敏劑或促進細胞凋亡的促進劑。
[0020]所述的SSX2IP蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0021]本發明的第三方面，提供了一種體外非治療性抑制癌細胞遷移的方法，包括步驟:在SSX2IP抑制劑存在下，培養癌細胞，從而抑制癌細胞遷移。
[0022]在另一優選例中，所述的方法包括向癌細胞的培養體系中添加SSX2IP抑制劑，從而抑制癌細胞遷移。
[0023]在另一優選例中，所述的癌細胞包括肝癌細胞、胃癌細胞、腸癌細胞、肺癌細胞、前列腺細胞、乳腺細胞、黑色素瘤細胞。
[0024]在另一優選例中，在所述方法中，所述的SSX2IP抑制劑的濃度為0.5_5mg/mL。
[0025]本發明的第四方面，提供了一種SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激動劑的用途，用于制備促進腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的組合物(或促進劑)，或用作促進腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的促進劑。
[0026]在另一優選例中，所述的SSX2IP基因或蛋白來源于哺乳動物；較佳地，來源于人、小鼠或大鼠；更佳地，來源于人。
[0027]在另一優選例中，所述的SSX2IP基因或蛋白是重組人SSX2IP基因或蛋白或來自人血液或血清中的人SSX2IP基因或蛋白。
[0028]在另一優選例中，所述的促進腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的藥物用于建立腫瘤模型。
[0029]在另一優選例中，所述的腫瘤為肝癌。
[0030]在另一優選例中，所述的SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激動劑的用途還包括:在SSX2IP蛋白或其激動劑存在下，培養癌細胞，從而促進癌細胞生長或增殖。
[0031 ] 本發明的第五方面，提供了一種篩選用于抑制腫瘤細胞遷移或用于提高癌細胞藥物敏感性的候選化合物的方法，所述方法包括步驟:
[0032] (a)測試組中，在細胞的培養體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細胞中SSX2IP的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細胞中SSX2IP的表達量和/或活性；[0033]其中，如果測試組中細胞的SSX2IP的表達量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對SSX2IP的表達和/或活性有抑制作用的治療腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移或能夠提高化療藥物敏感性的化合物；和
[0034](b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，任選地測試所述候選化合物對癌細胞轉移或遷移的抑制作用或所述候選化合物對癌細胞藥物敏感性的影響作用。
[0035]在另一優選例中，所述的腫瘤包括肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0036]在另一優選例中，在步驟(b)中包括步驟:測試組中，癌細胞的培養體系中添加測試化合物，并觀察癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；在對照組中，在癌細胞的培養體系中不添加測試化合物，并觀察癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；其中，如果測試組中癌細胞的遷移距離或侵襲數量顯著小于對照組，就表明該測試化合物是對腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移有抑制作用的或能夠提高化療藥物敏感性的化合物。
[0037]本發明第六方面，提供了一種SSX2IP基因或SSX2IP蛋白的用途，用于制備檢測腫瘤轉移的試劑或試劑盒。
[0038]在另一優選例中，所述的SSX2IP蛋白來源于哺乳動物；較佳地，來源于人、小鼠或大鼠；更佳地，來源于人。
[0039]在另一優選例中，所述的SSX2IP蛋白來源于人，其全長氨基酸序列如SEQ IDN0.:1所示。
[0040]在另一優選例中，所述的SSX2IP基因核苷酸序列如SEQ ID N0.:2所示。
[0041]在另一優選例中，所述的腫瘤包括:肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
[0042]在另一優選例中，所述的試劑包括SSX2IP特異性引物、特異性抗體、探針和/或芯片。
[0043]在另一優選例中，所述的檢測包括酶聯免疫反應法(ELISA法)檢測或時間分辨免疫熒光法(TRFDWi)檢測。
[0044]在另一優選例中，所述的SSX2IP蛋白或其特異性抗體偶聯有或帶有可檢測標記。
[0045]在另一優選例中，所述可檢測標記選自下組:生色團、化學發光基團、熒光團、同位素或酶。
[0046]在另一優選例中，所述SSX2IP的特異性抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。
[0047]在另一優選例中，所述檢測是測定組織樣品、血液樣品、血清樣品或體液樣品。
[0048]在另一優選例中，所述的組織樣品包括癌組織和癌旁組織。
[0049]本發明的第七方面，提供了一種用于檢測腫瘤轉移的診斷試劑盒，所述的試劑盒含有一容器，所述容器中含有檢測SSX2IP蛋白或mRNA的檢測試劑；以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于檢測腫瘤轉移。
[0050]在另一優選例中，所述的檢測腫瘤轉移指判斷腫瘤轉移是否發生，和/或判斷發生腫瘤轉移的可能性(易感性)大小。
[0051 ] 在另一優選例中，所述判斷包括預先判斷。 [0052]在另一優選例中，所述的檢測SSX2IP蛋白或mRNA的檢測試劑包括:
[0053](a).抗SSX2IP蛋白的特異性抗體；和/或[0054](b).特異性擴增SSX2IP的mRNA或cDNA的特異性引物。
[0055]在另一優選例中，所述的標簽或說明書中注明以下內容:
[0056]當檢測對象的腫瘤組織SSX2IP表達量與癌旁組織的SSX2IP表達量之比≥2，則提示該檢測對象腫瘤轉移的幾率高于普通人群。
[0057]在另一優選例中，所述的表達量是相對于對照基因(如β -肌動蛋白)的相對表達量。
[0058]在另一優選例中，所述的試劑盒還用于預測腫瘤患者生存時間。
[0059]在另一優選例中，當檢測對象是腫瘤患者時，如果檢測對象腫瘤組織中的SSX2IP表達量Yl顯著高于同類癌癥患者腫瘤組織中SSX2IP的表達量Υ2，則提示該檢測對象生存時間的低于同類癌癥患者的平均生存時間；
[0060]如果檢測對象腫瘤組織中的SSX2IP表達量Yl顯著低于同類癌癥患者腫瘤組織中SSX2IP的表達量Υ2，則提示該檢測對象生存時間的高于同類癌癥患者的平均生存時間。
[0061]在另一優選例中，所述的顯著高于是指Υ1/Υ2≥2。
[0062]在另一優選例中，所述的顯著低于是指Υ1/Υ2 ≤ 0.5。
[0063]本發明的第八方面，提供了一種SSX2IP基因或蛋白的用途，作為檢測腫瘤轉移的特異性標志物用于制備檢測試劑；或用作檢測腫瘤轉移的特異性標志物。
[0064]在另一優選例中，所述的腫瘤包括肝癌。
[0065]本發明提供了一種預測或診斷腫瘤轉移的方法，包括步驟:
[0066](a).準備受試者測試樣品；
[0067](b).檢測測試樣品中SSX2IP相對肌動蛋白的mRNA表達量并與參比值相比，當其比值> 2則提示該檢測對象腫瘤轉移的幾率高于普通人群。
[0068]在另一優選例中，所述測試樣品為組織樣品、血液樣品、血清樣品或體液樣品。
[0069]在另一優選例中，所述參比值為非腫瘤樣品中SSX2IP的表達量。
[0070]在另一優選例中，所述檢測步驟b包括檢測SSX2IP mRNA的量，或SSX2IPcDNA的量；和/或檢測SSX2IP蛋白的量。
[0071]在另一優選例中，所述檢測步驟b包括通過RT-PCR或PCR方法進行檢測。
[0072]在另一優選例中，所述的檢測步驟b包括使用抗SSX2IP蛋白的抗體進行檢測。
[0073]此外，本發明還包括一種抑制腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的方法，包括步驟:給需要治療的對象(哺乳動物)施用安全有效量的SSX2IP蛋白或其激動劑。
[0074]應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0075]圖1顯示了 Kaplan-Meier分析SSX2IP在51例肝癌病人中表達與生存期的關系，其中，SSX2IP高表達病人組(31例)其生存期顯著低于SSX2IP低表達病人組(20)(P=0.004)。
[0076]圖2顯示了過表達SSX2IP與肝癌細胞的腹腔擴散和肝轉移能力的關系:其中，圖2A顯示了.B拍照記錄肝癌細胞在腹腔內的擴散情況。B.統計發現過表達SSX2IP的肝癌細胞其在裸鼠腹腔中擴散并形成腫瘤的能力顯著高于轉染空載細胞組和未處理細胞組(6.2±0.84，2.6±0.89，2.4±1.14，**P < 0.001)。C.BEL-7402, BEL-7402Vector,BEL-7402SSX2IP三類細胞分別通過尾靜脈注射入裸鼠體內，10周后，處死并解剖，拍照記錄裸鼠肝的情況。D.統計發現，過表達SSX2IP的肝癌細胞在裸鼠體內發生肝轉移的比率顯著高于空載對照和空白對照組，轉移比率分別為7/10，2/10和1/10，P = 0.023.[0077]圖3顯示了 SSX2IP能夠促進肝癌細胞的劃痕愈合能力。其中，劃痕愈合實驗反應了肝癌細胞的移動能力。
[0078]圖3A 顯示了通過劃痕愈合實驗檢測 SMMC-7721, SMMC-772Ivector, SMMC-772Issx2ip三類細胞的移動能力，發現過表達SSX2IP的肝癌細胞細胞SMMC-772Issx2ip,其移動能力顯著高于空載細胞組合空白對照細胞組，48小時后的平均間隙距離為:170.83±36.96 μ m,516.67±25.57m, 525.00±31.92 μ m,林P < 0.001。
[0079]圖3Β 顯示了通過劃痕愈合實驗檢測 BEL-7402, BEL-7402Vector, BEL_7402SSX2IP 三類細胞的移動能力，發現過表達SSX2IP的肝癌細胞細胞BEL-7402SSX2IP，其移動能力顯著高于空載細胞組合空白對照細胞組，48小時后的平均間隙距離為:183.33 ± 49.07m，312.50±25.00m, 329.17±15.96 μ m,林P < 0.001。
[0080]圖4.SSX2IP能夠促進肝癌細胞的侵襲和遷移能力 [0081]圖4Α顯示了 SSX2IP對肝癌細胞SMMC-7721侵襲遷移能力的促進結果:
[0082]圖4B顯示了統計結果表明過表達SSX2IP肝癌細胞SMMC_7721SSX2IP，其侵襲和遷移的能力顯著增強。遷移實驗中，過表達SSX2IP組對比對照組的數量統計為:123.33±9.45，59.67±4.73,51.33±6.03 ;侵襲實驗中，過表達SSX2IP組對比對照組的數量統計為:92.00±7.00,43.67±4.16,38.00±3.61，**P < 0.001。
[0083]圖4C顯示了 SSX2IP對肝癌細胞BEL-7402侵襲遷移能力的促進結果
[0084]圖4D顯示了統計結果，表明過表達SSX2IP肝癌細胞BEL-7402SSX2IP，其侵襲和遷移的能力顯著增強
[0085]遷移實驗中，過表達SSX2IP組對比對照組的數量統計為:154.67 土 14.05，103.67 ±10.70，109.00 ±7.55 ;*P < 0.01。侵襲實驗中，過表達SSX2IP組對比對照組的數量統計為:113.00±6.56,63.33±11.50,60.67±11.02，*P < 0.01。
[0086]圖5.SSX2IP能夠降低肝癌細胞對化療藥物的敏感度，增加耐藥性
[0087]圖 5A 顯示了 SMMC-7721, SMMC-772 IVector 和 SMMC-7721SSX2IP 對化療藥物 5_Fu的劑量反應曲線和IC5tl值，結果顯示SMMC-7721SSX2IP對5-FU的IC5tl值顯著高于對照組(24.68± 1.17 μ Μ, 14.59±0.77Μ, 13.60±0.88 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0088]圖 5Β 顯示了 BEL-7402, BEL_7402Vector 和 BEL-7402SSX2IP 對化療藥物 5_Fu的劑量反應曲線和IC5tl值，結果顯示BEL-7402SSX2IP對5-FU的IC5tl值顯著高于對照組(28.52±0.65 μ Μ, 12.73± 1.81 μ Μ, 14.16± 1.20 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0089]圖 5C 顯示了 BEL-7402, SMMC-772IVector 和 SMMC-7721SSX2IP 對化療藥物 CDDP的劑量反應曲線和IC5tl值，結果顯示SMMC-7721SSX2IP對⑶DP的IC5tl值顯著高于對照組(11.38± 1.42 μ Μ, 5.72±0.75 μ Μ, 6.18±0.81 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
[0090]圖 ? 顯示了 BEL-7402, BEL_7402Vector 和 BEL-7402SSX2IP 對化療藥物 CDDP的劑量反應曲線和IC5tl值，結果顯示BEL-7402SSX2IP對CDDP的IC5tl值顯著高于對照組(9.86±1.24 μ Μ, 6.13±0.24 μ Μ, 5.90±0.47 μ Μ, **Ρ〈0.001)。
【具體實施方式】
[0091]本發明人通過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，本發明人通過廣泛而深入的研究，首次意外地發現，SSX2IP抑制劑可以用作預防或治療腫瘤轉移、腫瘤細胞遷移，并能提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性；本發明人還發現了 SSX2IP基因或蛋白可以用于制備提高腫瘤對化療藥物敏感性、篩選抑制腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的藥物；此外，本發明人還發現了 SSX2IP基因或蛋白及其激動劑可以用作促進腫瘤轉移、腫瘤細胞遷移，并增強腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，可以用于動物耐藥、轉移模型的制備。
[0092]此外，本發明人通過研究還發現，SSX2IP的高表達與腫瘤轉移有很強的相關性，實驗證明，SSX2IP可以作為預測或診斷腫瘤轉移的特異性標志物，從而制備預測腫瘤是否可能或診斷腫瘤是否已經發生轉移的檢測試劑盒。此外，本發明人還發現了 SSX2IP可以用于預測腫瘤患者的生存時間。在此基礎上，完成了本發明。
[0093]SSX2IP蛋白和多核苷酸
[0094]在本發明中，“本發明蛋白”、“本發明多肽”、“SSX2IP蛋白”可互換使用，指滑膜肉瘤X斷裂點2相互作用蛋白(簡稱為SSX2IP)。應理解，所述術語還包括SSX2IP的活性片段和衍生物。
[0095]在本發明中，“本發明基因”、“本發明多核苷酸”指編碼SSX2IP蛋白或其活性片段和衍生物的核苷酸序 列，包括正義和反義核酸。SSSX2IP定位于Chr0m0S0melp22.3，基因全長46kb,其中包含14個外顯子。
[0096]在本發明中，術語“SSX2IP蛋白”或“SSX2IP多肽”可互換使用，都指具有人蛋白SSX2IP氨基酸序列的蛋白或多肽。目前SSX2IP已被確定為急性髓性白血病的相關抗原，是一個潛在的白血病免疫治療的靶點。
[0097]可用于本發明的SSX2IP基因核苷酸序列的5種mRNA轉錄本的Genbank登錄號為NM001166293.1;NM001166294.1;NM001166295.1;NM001166417.1;NM014021.3。
[0098]一種優選的SSX2IP基因核苷酸序列如SEQ ID N0.:1所示，Gene ID: 117178，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0.:2所示，登錄號為NP001159889.1。
[0099]如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
[0100]如本文所用，“分離的SSX2IP蛋白或多肽”是指SSX2IP蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化SSX2IP蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。在本發明中，SSX2IP蛋白包括融合蛋白和非融合蛋白。
[0101]本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
[0102]本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。
[0103]編碼SSX2IP的成熟多肽的多核苷酸包括:只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
[0104]本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼多肽的功能。
[0105]本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段，包括正義和反義的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼SSX2IP蛋白的多核苷酸。
[0106]本發明的人SSX2IP核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據已公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
[0107]一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0108]此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0109]應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法被優選用于獲得本發明的基因。用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
[0110]本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或SSX2IP蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
[0111]通過常規的重組DNA技術，可利用本發明的多核苷酸序列可用來表達或生產重組的SSX2IP蛋白。一般來說有以下步驟:
[0112](I).用本發明的編碼人SSX2IP蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；
[0113](2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；
[0114](3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
[0115]本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含人SSX2IP編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
[0116] 此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。[0117]包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
[0118]宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有:大腸桿菌，鏈霉菌屬的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CH0、COS、或293細胞的動物細胞等。
[0119]用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法:磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
[0120]獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。 [0121]在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于:常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結
口 ο
[0122]抑制劑
[0123]利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與SSX2IP蛋白發生相互作用的物質，尤其是抑制劑等。
[0124]本發明SSX2IP蛋白的抑制劑(包括抗體、反義核酸以及其他抑制劑)，當在治療上進行施用(給藥)時，可抑制SSX2IP蛋白的表達和/或活性，進而抑制腫瘤的轉移或腫瘤細胞的遷移。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于):瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0125]可用于本發明的抑制劑包括:SSX2IP的抗體、抑制性mRNA、SSX2IP核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制劑。其中，典型的SSX2IP抑制劑為抑制性miRNA、SiRNA0
[0126]典型地，將SSX2IP基因作為制備預防或治療腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的藥物的靶點的技術方案包括以下方案:
[0127]1.化學合成雙鏈核糖核酸分子，其序列特異性針對SSX2IP基因序列，利用脂質體包裹遞送至腫瘤細胞內干擾SSX2IP基因的表達，觀察軟瓊脂克隆形成能力、細胞遷移能力等細胞生物學特性的改變。可利用本領域常規的方法來設計和合成特異性針對SSX2IP的核酸序列(如siRNA)。
[0128]2.利用各種載體，包括DNA載體、慢病毒載體來干擾SSX2IP基因的表達，達到體內干擾SSX2IP基因的效果，檢測它們對裸鼠瘤體腹腔擴散或肝轉移的治療效果，從而實現抑制腫瘤增殖的目的。
[0129]3.獲得能夠特異性抑制SSX2IP基因轉運活性的多肽、單克隆抗體，達到抑制SSX2IP活性的目的，從而現實抑制腫瘤細胞轉移或遷移的目的。
[0130]本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明SSX2IP抑制劑(如抗體、反義序列(如siRNA)、或抑制劑)以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于):鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約I微克-10毫克/千克體重。
[0131]抗體
[0132]本發明還包括對人SSX2IP蛋白具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于人SSX2IP基因產物或片段。較佳地，指那些能與人SSX2IP基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，將提純的人SSX2IP基因產物或它的抗原片段注射入動物體內以產生多克隆抗體。同樣，表達人SSX2IP蛋白或它的抗原的細胞也可以用來對動物致免疫而產生抗體。
[0133]本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab ) 2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體。
[0134]本發明的抗體包括可以抑制SSX2IP功能的抗體，也可以是不影響人SSX2IP功能的抗體。每一類抗體都可以通過對人SSX2IP基因產物的片段或功能域致免疫而產生，而人SSX2IP基因產物及其片段可以用重組方法產生或用多肽合成儀進行合成。與非修飾形式的SSX2IP基因產物結合的抗體，可以利用在原核細胞(如E.coli)中產生的基因產物來免疫動物而得到。與翻譯后修飾形式如糖基化或磷酸化SSX2IP蛋白或多肽結合的抗體，可以利用在真核細胞如酵母或昆蟲細胞中產生的基因產物來免疫動物而得到。
[0135]可用于本發明的SSX2IP抗體可以是抗人SSX2IP蛋白抗體。本發明的抗人SSX2IP蛋白抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的人SSX2IP蛋白。
[0136]藥物組合物和給藥方式
[0137]本發明提供了含有活性成分(a)SSX2IP抑制劑；(b)藥學上可接受的載體；以及任選的(C)化療劑的藥物組合物。
[0138]在本發明的藥物組合物中，SSX2IP抑制劑SSX2IP抑制劑的含量沒有特別限制，通常為 0.01-95wt%,較佳地為 0.l-90wt%o
[0139]本發明的藥物組合物可以是單方制劑，也可以是復方制劑。
[0140]在復方制劑中，除了含有SSX2IP抑制劑之外，還可包含其他抗腫瘤化合物，例如化療劑。代表性的化療劑包括(但并不限于):烷化劑、抗代謝物、葉酸類似物、嘧啶類似物、嘌呤類似物以及相關抑制劑、長春花堿類、epipodopyvllotoxins、抗生素、L 一天冬酞胺酶、拓撲異構酶抑制劑、干擾素、鉬配位復合物、大黃素取代的脲、甲基肼衍生物、腎上腺皮質抑制劑、腎上腺皮質類固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素以及促性腺激素-釋放激素類似物。優選的化療劑包括:5—氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氫葉酸、伊立替康、奧沙利鉬、卡培他濱、紫杉醇和多西紫衫醇。
[0141]本發明的藥物組合物的劑型和制備方法沒有特別限制，可用本領域常規通用的制法制成片劑、膠囊、顆粒劑、緩釋劑、注射劑等各種劑型。優選的劑型是口服制劑(如片劑)和注射劑。
[0142]在本發明中，SSX2IP抑制劑或含SSX2IP抑制劑的藥物制劑可用于預防和治療腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移。
[0143]適用于本發明的腫瘤包括(但并不限于):黑色素瘤、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、肺癌、肝癌、視網膜母細胞瘤、星形細胞瘤、成膠質細胞瘤、白細胞過多癥、成神經細胞瘤、鱗狀細胞癌、頭癌、頸癌、牙齦癌、舌癌、乳癌、前列腺癌、腎癌、骨癌、睪丸癌、卵巢癌、間皮瘤、肉瘤、宮頸癌、胃腸癌、淋巴瘤、腦瘤、結腸癌以及膀胱癌。
[0144]在另一個優選例中，所述的腫瘤為肝癌。
[0145]在本發明中，給藥方式沒有特別限制，可以通過口服、靜脈內、肌內、腹腔內或皮下等途徑給藥。
[0146]本發明制劑可以每天服用或給藥一次或兩次、或多次，或者以緩釋方式給藥。優選的方式是每天服藥一次，因為這樣便于病人堅持，從而顯著提高病人服藥的順應性。
[0147]服用時，極大多數病例一般每天應用的總劑量為每人Img~200g，較佳地為IOmg ~100g0
[0148]激動劑
[0149]利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與SSX2IP蛋白發生相互作用的物質，尤其是激動劑等。
[0150]本發明SSX2IP蛋白的激動劑，當進行施用(給藥)時，可促進SSX2IP蛋白的表達和/或活性，進而促進癌細胞(包括肝癌)的轉移或遷移。通常，可將這些激動劑配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過體外或非體外的常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于):瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
[0151]本發明的SSX2IP基因、蛋白或其激動劑特別適用于體外腫瘤細胞的培養以及腫瘤動物模型的制備，尤其是肝癌細胞肝內轉移、遠處轉移或腹腔轉移動物模型建模。
[0152]篩選方法
[0153]本發明還提供了基于SSX2IP進行藥物篩選的方法。一種方法是先篩選影響(抑制)SSX2IP表達或活性的化合物，然后對篩選出的化合物進一步測試其對癌細胞的抑制作用。
[0154]其中，代表性的癌細胞包括肝癌細胞、胃癌細胞、腸癌細胞、肺癌細胞、前列腺細胞、乳腺細胞、黑色素瘤細胞。
[0155] 本發明提供的篩選預防或治療腫瘤轉移、腫瘤細胞遷移或提高化療藥物敏感性的候選化合物的方法，基于該化合物對SSX2IP的表達量和/或活性的影響，一種典型的篩選方法包括步驟:[0156](a)測試組中，在細胞的培養體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細胞中SSX2IP的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細胞中SSX2IP的表達量和/或活性；
[0157]其中，如果測試組中細胞的SSX2IP的表達量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對SSX2IP的表達和/或活性有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。和/或
[0158](b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，進一步測試其對肝癌細胞轉移或遷移的抑制作用。如，在測試組中，肝癌細胞的培養體系中添加測試化合物，并觀察肝癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；在對照組中，在肝癌細胞的培養體系中不添加測試化合物，并觀察肝癌細胞移動的距離的數量和/或侵襲情況；其中，如果測試組中肝癌細胞的遷移距離或侵襲數量顯著小于對照組，就表明該測試化合物是對肝癌轉移細胞或肝癌細胞遷移有抑制作用的治療肝癌的候選化合物。
[0159]檢測方法和試劑盒
[0160]本發明涉及定量和定位檢測人SSX2IP蛋白水平或mRNA水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的。試驗中所檢測的人SSX2IP蛋白水平，可以用于診斷腫瘤的轉移或腫瘤細胞的遷移。
[0161]一種檢測樣品中是否存在SSX2IP蛋白的方法是利用SSX2IP蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括:將樣品與SSX2IP蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在SSX2IP蛋白。
[0162]SSX2IP蛋白或其 多核苷酸可用于SSX2IP蛋白相關疾病的診斷和治療。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列或DNA芯片上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。抗SSX2IP的抗體可以固定在蛋白質芯片上，用于檢測樣品中的SSX2IP 蛋白。
[0163]本發明還提供了一種檢測肝癌的試劑盒，它含有特異性擴增SSX2IP的引物對和/或SSX2IP特異性抗體以及標簽或說明書。
[0164]其中，所述的標簽或說明書注明以下內容:當檢測對象的SSX2IP相對-肌動蛋白的mRNA表達量與癌旁組織的SSX2IP相對-肌動蛋白的mRNA表達量之比>2，則提示該檢測對象腫瘤轉移的幾率高于普通人群。
[0165]一種典型的本發明的試劑盒可用于檢測人肝組織樣品或血液樣品。
[0166]本發明還包括一種抑制腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的方法，包括步驟:給需要治療的對象(哺乳動物)施用安全有效量的SSX2IP抑制劑。
[0167]本發明的有益效果
[0168]1.本發明SSX2IP抑制劑可以有效地抑制腫瘤，特別是肝癌的轉移或肝癌細胞的遷移，可作為預防或治療腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的藥物。
[0169]2.本發明SSX2IP抑制劑可以顯著降低腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性，從而提高對化療藥物的敏感度，以提高化療藥物的效果。
[0170]3.本發明的SSX2IP抑制劑還可以用作藥物的篩選，從而篩選出對能夠有效抑制腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的藥物，或對化療藥敏感的藥物。
[0171]4.本發明SSX2IP基因或蛋白及其激動劑可用于促進腫瘤的轉移或遷移，可用于離體癌細胞的培養或腫瘤動物模型的建模。[0172]5.本發明SSX2IP基因或蛋白可以用于作為診斷或預測腫瘤，尤其是肝癌轉移的特異性標志物，即SSX2IP高表達者腫瘤轉移的幾率更大。
[0173]6.本發明SSX2IP基因或蛋白還可以用于預測腫瘤患者的生存時間，即SSX2IP表達量越高，腫瘤患者的生存時間越短。
[0174]實施例1
[0175]制備預測或診斷腫瘤是否轉移/預測患者生存期的試劑盒
[0176]制備一用于組織學檢測預測或診斷腫瘤是否轉移/預測患者生存期的試劑盒，所述試劑盒包括:
[0177](a)容器，以及位于容器內的特異性針對SSX2IP的以下抗體:抗人SSX2IP的抗體(購自Abcam和Sigma公司);和
[0178](b)以及標簽或說明書，所述標簽或說明書注明所述試劑盒用于預測腫瘤是否轉移檢測或患者生存期。
[0179]實施例2SSX2IP蛋白表達與腫瘤癌栓形成和腫瘤包膜完整性的相關性
[0180]材料:53位肝癌病人樣本，均收集于復旦大學附屬中山醫院。獲得受試者的知情同意及醫院的倫理審查委員會的批準。 [0181]方法:采用實施例1制備的試劑盒，分組情況如表1所示；觀察指標:腫瘤大小、癌栓形成及腫瘤包膜完整性；測定腫瘤瘤體內SSX2IP的表達水平，并觀察其表達水平對于癌癥患者并發癥的發生有無意義。
[0182]結果:如表1所示:
[0183]表1
【權利要求】
1.一種滑膜肉瘤X斷裂點基因2相互作用蛋白即SSX2IP的抑制劑的用途，其特征在于，用于制備抑制腫瘤轉移或抑制腫瘤細胞遷移的藥物。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的SSX2IP蛋白來源于哺乳動物；較佳地，來源于人、小鼠或大鼠。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤包括肝癌、胃癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌、黑色素瘤。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的抑制劑包括:SSX2IP的抗體、SSX2IP核酸的反義RNA、siRNA、shRNA以及SSX2IP的活性抑制劑。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述的藥物含有藥學上可接受的載體、SSX2IP抑制劑和任選的化療劑。
6.如權利要求5所述的用途，其特征在于，所述的化療劑包括酰胺(CTX)、異環磷酰胺(IFO)、絲裂霉素(MMC)、阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、長春花堿(VBL)、依托泊甙(VP16)、威猛(Vumon)、順鉬(CDDP)、氟尿嘧啶(5-FU)、卡鉬(CBP)和甲氨蝶呤(MTX)。
7.—種SSX2IP抑制劑的用途，其特征在于，(a)用于制備促進化療或放療誘導的細胞凋亡的藥物組合物，或(b)用于制備促進化療或放療誘導的細胞凋亡的促進劑，或(C)用于制備使得癌細胞對 化療或放療誘導的細胞凋亡更敏感的增敏劑。
8.—種體外非治療性抑制癌細胞遷移的方法，其特征在于，包括步驟:在SSX2IP抑制劑存在下，培養癌細胞，從而抑制癌細胞遷移。
9.一種SSX2IP基因、SSX2IP蛋白或其激動劑的用途，其特征在于，用于制備促進腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移的組合物。
10.一種篩選用于抑制腫瘤細胞遷移或用于提高癌細胞藥物敏感性的候選化合物的方法，其特征在于，所述方法包括步驟: (a)測試組中，在細胞的培養體系中添加測試化合物，并觀察所述測試組的細胞中SSX2IP的表達量和/或活性；在對照組中，在相同細胞的培養體系中不添加測試化合物，并觀察對照組的所述細胞中SSX2IP的表達量和/或活性； 其中，如果測試組中細胞的SSX2IP的表達量和/或活性小于對照組，就表明該測試化合物是對SSX2IP的表達和/或活性有抑制作用的治療腫瘤轉移或腫瘤細胞遷移或能夠提高化療藥物敏感性的化合物；和 (b)對于步驟(a)中獲得的候選化合物，任選地測試所述候選化合物對癌細胞轉移或遷移的抑制作用或所述候選化合物對癌細胞藥物敏感性的影響作用。
【文檔編號】A61K39/395GK104001174SQ201310062585
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2013年2月27日 優先權日:2013年2月27日
【發明者】霍克克, 李璞 申請人:霍克克, 李璞