專利名稱：嗜熱脂環芽孢桿菌來源的羧酸酯酶D-1CarE5及其基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體地說是一種嗜熱脂環芽孢桿菌來源的羧酸酯酶D-lCarE5及其基因。
背景技術：
羧酸酯酶(Carboxylesterases, E C3. I. I. I)是一類能夠催化水解羧酸酯生成羧酸和醇的非特異性酯酶，與脂肪酶同屬于a/3水解酶家族成員，其氨基酸序列含有Ser-Asp -His三聯體結構，Ser, Asp, His構成了羧酸脂酶的催化活性中心(Nardini, M, etal., Current Opinion in Structural Biology. 1999, 9 (6):732-737.)。羧酸脂酶廣泛存在于動物、植物、微生物中(Melloney J.，et al.，journal ofMolecular Catalysis B: Enzymatic. 2005, 32:261-270.),其中微生物來源的羧酸酯酶是一種重要的工業酶類，在催化酯水解、酯合成、酯交換等上有重要應用價值，具有良好的區域選擇性和立體選擇性(Ramos Tombo, et al. , Agricultural and BiologicalChemistry. 1987，51:1833-1838.)。這些獨特性質使羧酸酯酶在食品、化工、制藥、能源開發和環境保護等領域具有廣闊的應用前景(Jaeger K. E.，et al.，Trends inBiotechnology. 1998, 16 (9):396-403.)。羧酸酯酶是一種重要的農藥降解酶，然而天然菌株產酶低、難以大量生產，生產成本高，限制了其推廣應用。利用分子生物學手段構建高效生物反應器，可以提高農藥降解酶的表達量，實現其大規模工業化生產。本文從嗜熱脂環酸芽孢桿菌D-I基因組中克隆羧酸脂酶基因故與表達載體pET28a(+)連接后，轉化到大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導表達并對羧酸酯酶酶學性質進行了初步研究，為進一步研究羧酸酯酶對農藥的降解奠定了理論基礎。

發明內容
本發明的目的是提供一種羧酸酯酶。本發明的再一目的是提供編碼上述羧酸酯酶的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發明所述羧酸酯酶D_lCarE5可得自嗜熱脂環芽孢桿菌(thermophilic
AlieyelobaciIlus tengchongensisstrain CGMCC1504)。D_lCarE5 的氨基酸序列如SEQ ID NO. I 所示。本發明的羧酸酯酶D-lCarE5總共含有513個氨基酸，理論分子量為58. 65kDa。以a -乙酸萘酯為底物最適溫度40°C ;最適pH7. 38 ;終濃度I mM的金屬離子Mn2+和Zn2+對酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有較強的抑制作用；在溫度35 1以下保溫50 min基本保持穩定；經1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38和pH8. 04緩沖液下處理80 min，分別保持40%,90%和45%以上的活性；在pH7. 38及40 °C下，該酶對0. 6 mol/L a -乙酸萘酯的比活力為108.65±0.01 U/mg ;在pH7. O及60 °〇下，該酶對0.6 mol/L P -乙酸萘酯的比活力為14. 78±0. 01 U/mg。本發明提供了編碼上述羧酸酯酶的基因故，該基因序列如SEQ ID NO. 2。本發明通過PCR的方法克隆了羧酸酯酶D_lCarE5的編碼基因萬，其全長1542 bp,起始密碼為 ATG,終止密碼為 TGA。經 BLAST 在 GeneBank(http://www. ncbi. nlm.nih. gov)數據庫進行比對分析,該羧酸酯酶基因D-2編碼的氨基酸序列與GeneBank中Paenibacillus sp. JDR-2來源的潛在羧酸脂酶(YP_003012983. I)具有最高一致性，為&m^_Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703 來源潛在脂酶(YP_909165. I)具有最高一致性，為45%，說明羧酸酯酶是一種新的羧酸酯酶。
本發明還提供了包含上述羧酸酯酶基因的重組載體，優選為m_D-lCarE5。將本發明的羧酸酯酶基因插入到表達載體合適的限制性內切酶位點之間，使其核苷酸序列與表達調控序列相連接。作為本發明的一個最優選的實施方案，將本發明的羧酸酯酶基因插入到質粒pET-28a(+)上的及I和通o I限制性酶切位點之間，得到重組大腸桿菌表達質粒m-D_lCarE5。本發明還提供了包含上述羧酸酯酶基因的重組菌株，優選所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優選為重組菌株(DE3)/ D-lCarE5。本發明制備羧酸酯酶D_lCarE5的方法按以下步驟進行
1)用上述的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株；
2)培養重組菌株，誘導重組羧酸酯酶表達；
3)回收并純化所表達的羧酸酯酶D-lCarE5。其中，優選所述宿主細胞為大腸桿菌細胞，優選將重組大腸桿菌表達質粒轉化大腸桿菌細胞BL21 (DE3)，得到重組菌株現之2 (DE3)/ D_lCarE5。本發明提供了一個新的羧酸酯酶基因，其編碼的羧酸酯酶以a-乙酸萘酯為底物最適溫度40°C ;最適pH7. 38 ;終濃度I mM的金屬離子Mn2+和Zn2+對酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有較強的抑制作用；在溫度35 V以下保溫50 min基本保持穩定；經 1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38 和 pH8. 04 緩沖液下處理 80 min,分別保持 40%,90% 和 45%以上的活性；同時也能夠水解￠-乙酸萘酯；可應用于農藥殘留或農藥污染治理方面。


圖I :在大腸桿菌中表達的重組羧酸酯酶D_lCarE5的SDS-PAGE分析，其中，M :低分子量蛋白質Marker ；1 :純化的重組羧酸酯酶D_lCarE5。圖2 :重組羧酸酯酶D_lCarE5的最適溫度。圖3 :重組羧酸酯酶D_lCarE5的熱穩定性。圖4 :重組羧酸酯酶D_lCarE5的最適pH。圖5 :重組羧酸酯酶D_lCarE5的pH穩定性。圖6 :不同金屬離子及化學試劑對重組羧酸酯酶D_lCarE5活性的影響。圖7 :重組羧酸酯酶D_lCarE5 1/[S]與1/V的關系。
具體實施方式
實驗材料和試劑
I、菌株及載體嗜熱脂環酸芽孢桿菌(thermophilic Alicyclobacillustengchongensisstrain CGMCC1504)為實驗室篩選菌株；大腸桿coli BL21(DE3)和表達載體pET_28a ( + )可購于Novagen公司。2、酶類及其它生化試劑限制性內切酶、DNA聚合酶和dNTP購自TaKaRa公司；T4連接酶購自Promega公司；堅固藍B購自Sigma公司；其它試劑均購自國藥集團。3、培養基
LB培養基蛋白胨1%，酵母粉0. 5%，氯化鈉1%，pH自然(約為7. O)。固體培養基在此基礎上加2. 0% (w/v)瓊脂。說明以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行。實施例I :羧酸酯酶基因D-lCarE5的克隆
嗜熱脂環酸芽孢桿菌D-I基因組DNA =CTAB裂解法，具體步驟為將液體培養12 h的新鮮菌液離心取菌體，加入800 UL溶液I ( 20 mM Tris, pH8. 0, 2 mM Na2-EDTA,終濃度20 mg/mL溶菌酶)，37 °C保溫30 min，加100 u L 10% SDS上下顛倒混勻，再加10 u L10 mg/mL 的蛋白酶 K，37 °C保溫 30 min，加 150 u L 5 M NaCl 和 150 u L 10% CTAB 溶液上下顛倒混勻，65 °C保溫20 min，加入等體積的酚/氯仿/異丙醇(體積比25 :24:1)進行抽提，在4 °〇下12000 rpm離心10 min，取上清于氯仿/異丙醇(體積比24 :1)中再次抽提除去雜蛋白，4 1下12000 rpm離心10 min，再取上清并加入2倍體積無水乙醇和1/10體積的pH5. 2 3M NaAc,_70°C沉淀Ih, 4。(^下13500 rpm離心20 min,棄上清，再用70%的乙醇洗滌兩次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20 °C備用。根據嗜熱脂環酸芽孢桿菌D-I全基因組測序及基因注釋分析羧酸酯酶基因D~lCarE5并設計表達引物CarF和CarR
上游引物 CarF: 5’ CGCGGATCCATGCAAAGCATGCTGCGG 3’(劃線部分為 I 酶切位
點)
下游引物CarR: 5’ CCGCTCGAGGAAAATGTACTGTTTTTGCTTAAAG 3’(劃線部分為ZAo I 酶切位點)
上游引物 17: 5 ’ TAATACGACTCACTATAGGG 3，
下游引物Hter: 5’TGCTAGTTAITGCTCAGCGG 3’為PCR檢測陽性克隆子引物。以嗜熱脂環酸芽孢桿菌基因組DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應參數為94 °C 預變性 5 min;然后 94 °C 變性 30 sec ；52 °C 退火 30 sec ；72 °C 延伸 I min30 sec ；30個循環后72 °C保溫5 min。PCR純化產物經漢I和沿o I雙酶切，回收目的片段，再與經過同樣酶切處理過的表達載體pET-28a(+)連接構建質粒pET-i -7ferf^，4 °C過夜。取 10 ii I 連接產物■轉化到 100 u I Escherichia coli BL21(DE3)感受態細胞中，涂布于含Kan的LB固體平板上，37 1溫箱培養13 h，從轉化板上挑取幾株單菌落，使用引物(T7，T7ter)進行菌落PCR擴增篩選陽性克隆子，從而獲得重組大腸桿菌菌株BL21 (DE3)/D-lCarE5。實施例2 :羧酸酯酶D_lCarE5的制備[a3]取含有重組質粒成l-D-lCarE5的Escherichia coli BL21 (DE3)菌株和只含有pET-28a (+)的空質粒coli BL21(DE3)菌株，以0. 1%的接種量接種于LB (含50 l^g/mL Kan)培養液中，37 1快速振蕩16 h。然后將此活化的菌液以1%接種量接種到新鮮的LB (含50 Pg/mL Kan)培養液中，快速振蕩培養約2-3 h (OD600達到0.6-1. 0)后，加入終濃度0. 7 mM的IPTG進行誘導，于20 1繼續振蕩培養約20 h或26 °C振蕩培養約8 h。12000 rpm離心5 min，收集菌體。用適量的pH7. 0 Tris-HCl緩沖液懸浮菌體后，于低溫水浴下超聲波破碎菌體。以上胞內濃縮的粗酶液經13，000 rpm離心10 min后,吸取上清并用Nickel-NTA Agarose純化目的蛋白。SDS-PAGE結果(圖I)表明，重組羧酸酯酶在大腸桿菌中得到了表達，經Nickel-NTA Agarose純化后為單一條帶。[a4]純化的重組羧酸酯酶D_lCarE5的性質測定
I、重組羧酸酯酶D-lCarE5的活性分析
2[a5]純化的重組羧酸酯酶D_lCarE5的活性測定方法采用a -萘酚法取三支10 ml 試管，分別編號1、2、3,1號和2號試管為實驗組,3號為對照組。分別向I號和2號試管中加入2. 5 ml l/15mol/L pH為7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液，向3號試管中加入3ml l/15mol/L pH為7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液。向三支試管中加入30 yl底物a-乙酸萘酯醇溶液，置于37 °C水浴鍋中預熱5 min，然后向I號和2號試管中加入0.5ml適當稀釋的酶液，反應5 min后，將三支試管取出，在冰浴條件下每支試管加入0.5 ml顯色劑(1%堅固藍B鹽水溶液和5% SDS使用前2 5混合)溶液，充分搖勻后，靜置5 min-10min后，在分光光度計595 nm下測定其吸光度值。I個酶活單位(U/mL)定義為一定條件下，每分鐘分解底物a -乙酸萘酯生成I UmoL a-萘酹所需要的酶量。以0 -乙酸萘酯為底物測定方法及酶活力計算同a-乙酸萘酯。2、重組羧酸酯酶D_lCarE5的最適溫度和熱穩定性的測定
酶的最適溫度的測定將羧酸酯酶D-lCarE5在1/15 mol/L pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液條件下，分別在20 0C >30 0C >35 0C >40 °C >45 °C >50 °C >60 °〇下進行酶促反應。溫度穩定性的測定將羧酸酯酶D-lCarE5在1/15 mol/L pH7. 0的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液條件下，在20 °C、35 1和45 °C三個溫度下分別保溫10 min,20min、30 min、40 min和50 min后進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以a -乙酸萘酯為底物，反應5 min,測定純化羧酸酯酶D-lCarE5的酶學性質。結果表明D_lCarE5的最適溫度40°C (圖2);35 1以下保溫50 min基本保持穩定(圖3)。3、重組羧酸酯酶D_lCarE5的最適pH和pH穩定性的測定
酶的最適pH的測定將羧酸酯酶D-lCarE5在最適溫度40 °C,分別在1/15 mol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩沖液不同pH4. 92,5. 91,6. 47,6. 98,7. 38,8. 04和8. 67條件下酶促反應。PH穩定性的測定將羧酸酯酶D-lCarE5在最適溫度40°C，在pH5. 91、pH7. 38和pH8. 04下分別耐受20 min、40 min、60 min和80 min后進行酶促反應，以未處理的酶液作為對照。以a -乙酸萘酯為底物，反應5 min,測定純化羧酸酯酶D-lCarE5的酶學性質。結果表明D-lCarE5 的最適 pH7. 38 (圖 4);經 1/15 mol/L pH5. 91、pH7. 38 和 pH8. 04 緩沖液下處理80 min，分別保持40%、90%和45%以上的活性(圖5)。4、不同金屬離子及化學試劑對重組羧酸酯酶D_lCarE5活性的影響
在酶促反應體系中加入終濃度I mM的金屬離子及化學試劑，研究其對酶活性的影響。以a-乙酸萘酯為底物，在40 °C、pH7. 38條件下，反應5 min，測定純化羧酸酯酶D_lCarE5的酶活力。結果(圖6)表明，終濃度I mM的金屬離子Mn2+和Zn2+對酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有較強的抑制作用。5、重組羧酸酯酶D_lCarE5的動力學參數的測定
在40 °C、pH7. 38條件下，以0.6 M a -乙酸萘酯為底物，依次在酶促反應的1-30min內終止反應并測定酶活性，計算出酶活性與反應時間的比值，若在一定時間內該比值保持穩定，則此時間為一級反應時間。用0.005-0. 5 M a-乙酸萘酯為底物([S])，在40 V、pH7. 38和一級反應時間下測定酶活，計算出相應的反應速度(V)，如圖7，根據Lineweaver-Burk方法測定心 和fear。經測定,在40 °C、pH7. 38條件下，重組羧酸酯酶D-lCarE5對a -乙酸萘酯的命和Vmax分別為0. 948 mo I和534. 12U/mg。6、重組羧酸酯酶D_lCarE5對底物P -乙酸萘酯的水解
在60 °C、pH7.0條件下，重組羧酸酯酶D-lCarE5對0.6 mol/L ￠-乙酸萘酯的比活力為 14. 78±0. 01 U/mg。
權利要求
1.一種羧酸酯酶D-lCarE5，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示。
2.—種編碼權利要求I所述的羧酸酯酶D-lCarE5的羧酸酯酶基因其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
3.一種包含權利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE5的重組載體。
4.一種包含權利要求2所述羧酸酯酶基因D-lCarE5的重組菌株。
全文摘要
本發明涉及一種羧酸酯酶D-1CarE5及其基因。其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。且本發明提供了上述羧酸酯酶的編碼基因D-1CarE5，羧酸酯酶基因D-1CarE5的重組載體和羧酸酯酶基因D-1CarE5的重組菌株。本發明的羧酸酯酶具有以下性質以α-乙酸萘酯為底物最適溫度40℃；最適pH7.38；終濃度1mM的金屬離子Mn2+和Zn2+對酶有激活作用，Cu2+、Ag+、Hg2+和Pb+等有較強的抑制作用；在溫度35℃以下保溫50min基本保持穩定；經1/15mol/LpH5.91、pH7.38和pH8.04緩沖液下處理80min，分別保持40%、90%和45%以上的活性；同時也能夠水解β-乙酸萘酯；可應用于農藥殘留或農藥污染治理方面。
文檔編號C12N15/63GK102787107SQ20121025085
公開日2012年11月21日 申請日期2012年7月19日 優先權日2012年7月19日
發明者周峻沛, 唐湘華, 李俊俊, 楊云娟, 許波, 謝振榮, 黃遵錫 申請人:云南師范大學