專利名稱：疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制備普瑞巴林關鍵手性中間體(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。
背景技術：
普瑞巴林(Pregabalin，簡稱PGB)，化學名為(S)-(+)_3_氨甲基_5_甲基己酸(I )，是 Y -氨基丁酸的 3 位異丁基取代物(Angew. Chem.1nt. Ed. 2008，47:3500-3504)。普瑞巴林屬鈣離子通道調節劑，通過調節鈣通道減少鈣離子進入神經末梢，減少谷氨酸和去甲腎上腺素等興奮性神經遞質的過度釋放(Curr. Opin. Pharmacol. 2006, 6:108-113.),對癲癇、神經病理性疼痛有良好的療效。與傳統藥物相比，普瑞巴林的劑量更低、服用次數少、副作用小、持續時間長、耐受性強。自上市以來，普瑞巴林全球銷售額快速增長，成為全球暢銷藥市場的“重磅炸彈”，市場前景十分廣闊。(3S) -2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸(II)是制備普瑞巴林的關鍵手性中間體，經加熱脫羧、堿性水解和加氫還原即可合成普瑞巴林(I )。美國Pfizer公司利用Novozymes公司固定化脂肪酶Upolase 選擇性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成
(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸鹽，底物濃度可達3. 0M,轉化率42 48%( Org. ProcessRes.Dev.2008， 12:392-398 ；US2005/0283023)o
權利要求
1.一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如下的肽段經點突變獲得RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTGLLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEHPDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPRLPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD ;所述的點突變為下列之一或其中兩種以上(I)第88位的S突變為T ; (2)第99位的A突變為N ; (3)第116位的V突變為D。
2.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVDAADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLAA DLTEISDICS GCEGHVGFVTSffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPR VGNRAFAEFLTAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLffYFGPI SECD。
3.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHVGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD。
4.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，其特征在于所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體序列如下RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVTCSENVCPEVD AADATFLYSF EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGTRS VENWIANLNA DLTEISDICSGCEGHDGFVT SffRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYN IDVFSYGAPRVGNRAFAEFL TAQTGGTLYR ITHTNDIVPR LPPRDffGYSH SSPEYffVTSG NDVPVTANDI TVVEGIDSTDGNNQGNIPDI PSHLffYFGPI SECD 。
5.編碼如權利要求1所述疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體的基因。
6.如權利要求1所述的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體在水解外消旋2-羧こ基-3_氰基-5-甲基己酸こ酯制備普瑞巴林關鍵手性中間體(3S)-2-羧こ基-3-氰基-5-甲基己酸中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體、編碼序列及其應用。所述一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體，由序列如SEQ ID No.1的肽段經點突變獲得，所述的點突變為下列之一或其中兩種以上(1)第88位的S突變為T；(2)第99位的A突變為N；(3)第116位的V突變為D。本發明提供的疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶突變體較親本活力大幅提高，即使使用該酶的粗提物或者工程菌全細胞，反應也會以較高的速率進行；此外，本發明的突變體可以在常溫和相對較高的溫度例如40~60℃下用于工業化生產(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸，從而進一步合成普瑞巴林。
文檔編號C12N9/20GK103045559SQ20121040783
公開日2013年4月17日 申請日期2012年10月23日 優先權日2012年10月23日
發明者鄭裕國, 黎小軍, 鄭仁朝, 沈寅初 申請人:浙江工業大學