專利名稱：一種微小rna用于調控b7-h4基因表達的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學技術領域，具體地說，本發明涉及基因表達調控技術領域，特別涉及一種微小RNA用于調控B7-H4基因表達。
背景技術：
腫瘤一直嚴重威脅著人類的健康和生命，傳統的治療方法不盡如人意。免疫治療通過提高腫瘤的免疫原性，誘導機體產生特異性的抗腫瘤免疫反應，達到治療腫瘤的目的，是一種變被動為主動的生物治療方法。由T細胞介導的細胞免疫是抗腫瘤免疫的主要形式，機體通過對腫瘤抗原的特異性識別，激活T細胞，產生相應的免疫殺傷作用。業已證實，T細胞的有效活化和功能介導需要雙重信號的協同作用一是抗原 肽-MHC復合物，由T細胞抗原受體(TCR)識別；二是協同刺激信號，由抗原遞呈細胞(APC)和T細胞表面的協同刺激分子配體和受體對提供。其中，B7-CD28是迄今為止公認的最基本的協同刺激信號，由表達在T細胞上的⑶28和表達在抗原遞呈細胞表面的⑶80和⑶86相互作用產生Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Tmmunol2002，2 (2) : 116-126.。經過多年的研究，B7-⑶28協同刺激信號的內容得到了極大的豐富，包括數個結構和功能相似的配體和受體組成的B7-CD28家族，其中B7分子的主要成員有0)80、0)86、87-0(、87-!11、10)51^、87-!13 和87_!14等，受體包括0)28、(1'1^-4、10)5、？0-1和 BTLA 等Greenwald RJ, Freeman GJ, Sharpe AH. The B7 family revisited. AnnuRev Immunol 2005, 23: 515-548.。這些協同刺激信號分子不僅提供促進T細胞生長、分化和產生細胞因子的正性信號，同時還能通過提供負性信號來限制、終止和/或減弱T細胞應答。T細胞的活化正是這種正性信號和負性信號相互平衡的結果Carreno BM, CollinsM. The B7 family of ligands and its receptors: new pathways for costimulationand inhibition of immune responses. Annu Rev Tmmunol 2002, 20: 29-53.。其中，負性信號主要是由B7家族的新成員B7-H1、B7-H3和B7-H4提供。如果這些負性協同刺激分子表達異常或功能障礙，就將導致疾病發生發展，如惡性腫瘤和自身免疫性疾病等。(B7S1、B7x、VTCNl)是2003年被發現的協同刺激信號B7-CD28家族中的最新成員Sica GL, et al. B7-H4, a molecule of the B7 family, negatively regulatesT cell immunity. Immunity 2003，18 (6) : 849-61.,主要通過抑制 T 細胞增殖、細胞因子的分泌和細胞周期的進程等方式來負性調控T細胞的免疫應答，同時它還可以促進人體正常上皮細胞向惡性轉化，防止惡變表皮細胞發生失巢凋亡，從而有利于腫瘤的發生和生長。目前，B7-H4已被發現在結直腸癌、卵巢癌、乳腺癌、腎癌、肺癌和骨髓瘤等多種惡性腫瘤組織中存在高表達，且與患者預后及臨床病理參數密切相關Zou W，Chen L.Inhibitory B7-family molecules in the tumour microenvironment. Nat Rev Tmmunol2008，8(6) : 467-77。在腫瘤組織中B7-H4主要表達在腫瘤細胞和腫瘤浸潤性巨噬細胞。高表達B7-H4的前列腺癌更容易轉移、復發，患者死亡率也更高Zang X，et al. B7-H3 andB7x are highly expressed in human prostate cancer and associated with diseasespread and poor outcome. Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104 (49) : 19458-19463.，而高表達B7-H4的胃癌、卵巢癌和腎癌患者預后更差Jiang J, et al. Tumor expressionof B7—H4 predicts poor survival of patients suffering from gastric cancer.Cancer Tmmunol Immunother 2010, 59(11): 1707-1714·。目前對B7-H4在腫瘤組織中表達的調控機制尚不明確。有研究發現，腫瘤微環境中的某些細胞因子和炎癥介質對B7-H4的表達存在調節作用。IL-6和IL-IO能誘導B7-H4在單核細胞、粒細胞、巨噬細胞和骨髓DC細胞上表達。DC細胞分化因子GM-CSF(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子)和IL-4能降低IL-6和IL-IO對B7-H4表達的誘導作用Kryczek I, Zou L, Rodriguez P, et al. B7-H4 expression identifies anovel suppressive macrophage population in human ovarian carcinoma. J ExpMed, 2006，203(4) :871-881.。與B7-H1不同，IFN-γ對B7-H4表達的影響卻很小。在人卵巢癌中，腫瘤相關Treg細胞誘導巨噬細胞產生大量IL-6和IL-10，進而刺激Β7-Η4以自分泌和/或旁分泌方式在APC上表達。然而，IL-4、IL-6、IL-IO和GM-CSF都不能誘導Β7-Η4在腫瘤細胞上表達Kryczek I, Wei S，Zhu G, et al. Relationship between B7-H4, regulatory T cells, and patient outcome in human ovarian carcinoma. Cancer Res,2007， 67 (18):8900-8905.。廣泛表達于淋巴樣及非淋巴樣組織，但其蛋白質在各種組織中不表達或低表達，在樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、B細胞和T細胞表面誘導性表達Choi IH, et al.Genomic organization and expression analysis of B7—H4, an immune inhibitorymolecule of the B7 family. J Tmmunol 2003，171 (9) :4650-4654.。正常人類組織不表達或極低表達B7-H4，但在多種腫瘤組織中發現B7-H4高表達。由此提示，這種負性協同刺激分子蛋白在正常組織中的表達受到轉錄后調控，而這種調控機制在腫瘤中存在異常。因此，調控B7-H4表達有望成為一種新的抗腫瘤治療途徑，具有潛在應用價值He C，et al.The inhibitory role of b7_h4 in antitumor immunity: association with cancerprogression and survival. Clin Dev Tmmunol 2011:695834.。是近年來發現于真核細胞中的一類長約22個核苷酸的內源性非編碼小分子RNA，可通過與靶mRNA的3’ -UTR互補結合在轉錄后水平使其降解，或者與之不完全互補結合在翻譯水平抑制蛋白合成，從而在基因表達中發揮重要的調節作用。越來越多的研究證實，miRNA在腫瘤組織中表達異常，與腫瘤發生發展及患者治療反應密切相關；如hsa-miR-21在結直腸癌組織中表達上調，與結直腸癌 M分期及患者預后密切相關SchetterAJ, Leung SY, Sohn JJ, et al. MicroRNA expression profiles associated withprognosis and therapeutic outcome in colon adenocarcinoma. JAMA 2008, 299(4):425-36.。最近，這種在腫瘤組織中表達異常的miRNA有的已被證實具有顯著的抗腫瘤活性[Thorsen SB, et al. The Therapeutic Potential of MicroRNAs in Cancer. CancerJ 2012, 18(3) :275-84.，如miR-145和miR_33a能抑制HCT-116結直腸癌細胞移植瘤的生長Ibrahim AF, et al. MicroRNA replacement therapy for miR-145 and miR_33a isefficacious in a model of colon carcinoma. Cancer Res 2011,71:5214-5224.。另夕卜，miR-122由于能調控丙型肝炎病毒RNA的豐度，其互補序列用于治療丙型肝炎病毒感染患者已經進入 II 期臨床試驗Janssen HL, ReesinkHW, Zeuzem S，et al. A randomized,double-blind, placebo (plb) controlled safety and anti-viral proof of conceptstudy of miravirsen (MIR), an oligonucleotide targeting miR-122, in treatmentnaBve patients with genotype I (gtl) chronic HCV infection. Hepatology.2011:1430A.，顯示出miRNA作為一種極其重要的基因表達調控因子和作用靶標，具有潛在的治療作用和實際應用價值。雖然本領域中已知某些微小RNA與腫瘤具有一定的相關性，但本領域中已知的miRNA種類繁多，功能各異，要從中篩選出與腫瘤相關且可作為發病、治療方案的選擇及預后的特定miRNA存在較大難度。目前，本領域中尚無miR-143和B7-H4基因相關性的報道。

發明內容
本發明所要解決的技術問題在于提供一種微小RNA對B7-H4基因表達的調控，特別是miR-143用于調控B7-H4基因表達。
本發明的目的是通過以下方式實現的一種微小RNA用于調控B7-H4基因表達，其特征在于，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5， -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3，。優選地，所述微小RNA能與B7-H4基因3’ -UTR結合，抑制B7-H4基因表達。優選地，所述微小RNA為miR-143。優選地，所述微小RNA通過化學合成得到。優選地，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。本發明微小RNA的獲取來源可以是來自化學合成和/或存在該基因序列的細胞、組織，組織可以選自外周血、體液、腔道的脫落物、病變組織，以及用這些組織制成的石蠟塊、石蠟切片。在本文中，術語“樣本”指的是潛在可能含有微小RNAmiR-143的離體循環血樣品，優選是來自人的樣品。盡管用抽提出血總RNA的純化樣品也能夠在本發明中使用，但是，本發明的樣品優選是未經提純的、含有血總RNA的裂解液體樣品。本領域技術人員知曉將固體的有核血細胞裂解或抽提、純化并保持其中miRNA成分不被降解的細胞分子生物學技術。本發明的樣品可以是經過處理的樣品，如稀釋處理、血細胞裂解處理以及PCR擴增等，也可以是未經處理的樣品。經過處理的樣品可以進一步純化，以富集miRNA。在本文中，術語“miR-143”指的是指的是包含序列“UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC”或其同源序列的微小RNA。本領域中已知各種來源的miR-143，例如人、黑猩猩、馬、雞等，這些同源序列均包含在本發明的術語“miR-143”中。本發明的術語中還包含上述天然存在的miR-143序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸，或經過生物化學修飾，且仍然具有生物學活性的衍生RNA。本發明人采用實時熒光定量PCR技術測定了 6例結直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達；統計分析發現，hsa-miR-143在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常組織，結果如圖I所示。本發明人采用生物信息學軟件miRanda預測發現，hsa-miR-143可能與B7-H4基因3’-UTR結合，結果如圖2所示。隨后，本發明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-143可與B7-H4基因3’ -UTR結合，從而抑制B7-H4分子表達；可通過調控B7-H4信號通路和/或miR-143表達及功能以發揮抗腫瘤作用。


下面結合附圖及實施例對本發明作進一步描述
圖I為結直腸癌組織中和正常組織miR-143表達量測定結果；
圖2為miRanda軟件預測結果；
圖3 B7-H4基因3’ -UTR的PCR擴增結果；
圖4 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重組載體酶切驗證結果；圖5 B7-H4/3’ -UTR/pGEM-T重組載體測序驗證結果；
圖6 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重組載體酶切驗證結果；
圖7 B7-H4/3’ -UTR/ pGL-3重組載體測序驗證結果；
圖8 hsa-miR-143對B7-H4/3’ -UTR/pGL-3重組載體表達活性的抑制作用。
具體實施例方式以下結合具體實施例對上述方案做進一步說明。應理解，這些實施例是用于說明本發明而不限制本發明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據具體廠家的條件做進一步調整，未注明的實施條件通常為常規實驗中的條件。一、試劑與材料 I、試劑
胎牛血清(Hyclone，美國)；完全培養基每升RPMI1640 (Hyclone，美國)中，添加胎牛血清100ml、L-谷氨酰胺O. 15g、2-巰基乙醇10.0 ml (5X l(T3mol/L);脂質體2000(Invitrogen,美國);青霉素、鏈霉素(上海生工生物技術有限公司);TRIzol (Invitrogen,美國);瓊脂糖(LP0028A，Oxoid Ltd,英國);凝膠電泳加樣液和溴化乙錠(EtBr)(上海生工生物技術有限公司);膠回收DNA試劑盒和質粒抽提試劑盒(Axygen,美國);鹿糖、Triton-100、MgCl2*6H20、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、鹽酸、EDTA、NaCl、苯酚、氯仿、異戊醇、十二烷基磺酸鈉(SDS)和無水乙醇等實驗所用試劑均為分析純或優級純；雙熒光素酶檢測試劑盒(Promega,美國Xhsa-miR-HS及其實時突光定量試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司);TaqDNA聚合酶、M-MuLV反轉錄酶、油a I限制性內切酶(MBI，美國)；T4 DNA連接酶(Takar a，日本)；PCR 引物(Invitrogen, PAGE 級)。pGEM-T、pGL-3> pRL-TK 載體(Promega,美國)。2、組織樣本
收集6例結直腸癌患者的新鮮手術組織樣本，包括癌組織和遠端正常腸組織(離癌邊沿5cm)。所有患者經HE染色、病理診斷確認為結直腸癌；術前未接受化療或放療。3、細胞株
中國倉鼠卵巢細胞株CHO (ATCC，美國);大腸桿菌TPlO (Novagen，美國)。細胞株經檢測，無支原體污染。4、儀器
CO2培養箱、低溫高速離心機、常速離心機(Thermo,德國)；倒置顯微鏡(Olympus,日本)；微弱發光測量儀(BPCL-K，中科院生物物理研究所)；PCR儀(S1000，Bio-Rad，美國)；電泳儀(Bio-Rad,美國)；微量定量分光光度計(Alpha Innotech,美國)；凝膠成像系統(GeneGenius, SYNGENE,英國)。
二、實驗方法
I、細胞培養
采用含10% FCS的RPMI 1640培養基進行培養，培養液中含有100kU/L青霉素、IOOmg/L鏈霉素，培養條件為37° C、5% CO2、飽和濕度。CHO細胞株貼壁生長，傳代時用O. 25%胰酶消化。間隔2-3天更換新鮮培養基。2、實時熒光定量分析hsa-miR-143表達量
采用Trizol試劑按照使用說明書從6對結直腸癌和正常組織樣本中提取總RNA。實時熒光定量PCR試劑盒測定RNA樣本中hsa-miR-143的表達量；以U6 RNA為內對照。取5μΜRT引物工作液lPL，加入79μ RNsae-free水，配置成62. 5nM RT引物工作液。50μ RT反應體系，加入2μ RNA樣品，引物工作液各4μ ，加RNsae-free水至19μ 。以上體系混勻后，瞬時離心，70° C放置lOmin，冰育2min，再加入以下試劑進行RT反應1XRT buffer，WL dNTP (10mM),40U RNase inhibitor, 200U RT 酶，加 RNsae-free 水至 50μ 。RT 反應程序42° C 60min，70° C lOmin。RT反應結束后立即將cDNA產物取出，快速置冰上冷卻，后續所有步驟都在冰上進行。接著進行qRT-PCR反應定量測定hsa-miR-143表達量，20μ 反應體系10μ SYBR Green Μ χ,2μ RT反應產物，Bulge-Loop miR-143正向引物和反向引物(5μΜ)各2μ ，加RNsae-free水至20μ 。反應程序95° C預變性20sec ;接著進行40個循環(95。C 變性 10sec;60。C 退火 20sec;70。C 延伸 5sec)。3、miRNA作用靶位點的預測
采用生物信息學軟件miRanda (www. microRNA. org)預測可能與B7-H4基因3’-UTR結合的miRNA。4、構建含B7-H4基因3’ -UTR片段的熒光素酶表達載體
采用Trizol試劑按照使用說明書從MDA-MB-435細胞中提取總RNA，以Oligo (dT)為逆轉錄引物，用M-MuLV反轉錄酶將RNA反轉錄為cDNA。μ L PCR反應體系中含有2 μ L cDNA模板，I. 25U Taq DNA聚合酶，I X緩沖液，O. 2mmol/L dNTPs，O. 4Mmol/L正向引物5’- GGC TAG TCT AGA ACT CAG CTG GGG TGA TTT CG-3’和反向引物5’- GGC TAG TCT AGA TGT AAT ACA GTC ACC GTG GC-3’(下劃線堿基為內切酶油<31識別序列)。熱循環條件為94° C預變性5min ;然后以94° C變性20sec，60° C退火30sec，72° C延伸lmin，擴增35個循環；最后72° C延伸7min使反應完全。反應完成后，取反應產物3PL在I. 5%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I X TAE電泳緩沖液，電壓200V，恒壓電泳5min)，凝膠成像系統拍攝電泳圖譜。擴增成功的產物采用Sanger’ s測序法測定DNA序列(Invitrogen);另取30μ 反應產物在2. 0%瓊脂糖凝膠上進行電泳(I XTAE電泳緩沖液，電壓100V，恒壓電泳lOmin)，然后采用膠回收試劑盒回收純化目的DNA片段，并用微量紫外分光光度計測定其濃度。參考產品說明書，將純化的B7-H4基因3’ -UTR片段克隆到pGEM_T載體；熱轉化大腸桿菌TPlO感受態細胞，進行藍白斑篩選。挑取白斑搖菌，抽提質粒；PCR擴增及酶切鑒定后再進行測序驗證。將測序正確的重組子用油al酶切后，回收3’ -UTR片段。用PGL-3和pRL-TK載體質粒轉化常規制備的大腸桿菌TPlO感受態細胞，進行大量擴增；試劑盒抽提法大量制備PGL-3和pRL-TK質粒，電泳檢測質粒的純度和含量。用限制性內切酶對提取的PGL-3質粒進行酶切，試劑盒直接回收大片段的酶切產物。參考產品說明書，將酶切回收純化后的B7-H4基因3 ’ -UTR片段按適當比例與pGL_3載體的Xba I酶切片段進行連接反應，16° C酶連過夜。取10 μ L連接產物直接轉化100 μ L大腸桿菌TPlO感受態細胞。經過含有氨芐青霉素的LB平板固體培養基中選擇培養。從轉化子的平板上隨機挑取10個菌落，經過含氨芐青霉素的LB液體培養基擴增培養；經PCR擴增、酶切和測序鑒定后，用試劑盒抽提質粒備用。5、細胞轉染
首先，將培養于含有10% FCS、100kU/L青霉素、100mg/L鏈霉素的RPMI1640完全培養基中細胞株，按I X IO4個細胞/孔的量在24孔板中接種指數生長期的細胞，培養過夜，直到細胞80%匯片。然后，將一定量的hsa-miR-143、B7-H4/3 ' _UTR/pGL3重組質粒和內參質粒 pRL-TK稀釋至50 μ L不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養基中，用移液槍混合均勻；然后將I μ L脂質體2000懸液加入50 μ L不含血清和抗生素的Opti-MEMsI培養基中，在室溫孵育5min ;最后將兩者混合在一起，充分混勻，靜置20min，使hsa-miR-143、重組質粒和內參質粒與脂質體充分結合。將只加脂質體的孔作為陰性對照。最后，吸去接種到24孔板中的培養液，用不含血清和抗生素的0pti-MEM I培養基洗一次，在每個孔中加入100 μ L上述混合物，培養3h ;吸棄培養板中的轉染培養液，向各孔加入100 μ L有血清無抗生素的Opti-MEMsI培養基，繼續培養24h后進行檢測。6、雙熒光素酶報告系統基因活性測定
將轉染有PGL-3和pRL-TK的CHO細胞經過24h培養后收集，吸棄培養基，用PBS洗I次。加入裂解液20 μ L/孔，室溫搖動15 min0按照雙熒光素酶檢測試劑盒的操作說明書，取100 μ L突光素酶分析緩沖液II于I. 5ml離心管中，設定化學發光儀延遲2sec,發光儀測讀IOsec ;將全部細胞裂解液加入到離心管中，用移液槍輕輕抽吸2-3次混勻(不要旋渦振動)；將離心管放入化學發光儀中測讀螢火蟲熒光素酶發光值Fl ;將離心管移出發光儀，力口AlOOuL Stop&Glo試劑，快速旋渦混勻后，將離心管重放回發光儀中測讀海腎熒光素酶發光值F2。應用SPSS. 10統計軟件的卡方檢驗分析受試組與空白對照組的F1/F2比值差異，以判斷hsa-miR-143的調控作用。三、結果
I.hsa-miR-143在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常組織采用實時熒光定量PCR技術測定了 6例結直腸癌組織和正常組織中miRNA的表達；統計分析發現，hsa-miR-143在結直腸癌組織中的表達顯著低于正常組織，結果如圖I所示。與B7-H4 基因 3’ -UTR 結合
我們采用生物信息學軟件miRanda預測發現，hsa-miR-143可能與B7-H4基因3’ -UTR結合，結果如圖2所示。構建B7-H4/3’ -UTR/pGL-3熒光素酶表達載體
PCR擴增得到長度為700bp的B7-H4基因3’ -UTR序列(圖3)，切膠純化回收后，將片段插入pGEM-T載體，轉化感受態大腸桿菌。隨機挑克隆擴增后提取質粒DNA。經過油al酶切鑒定，證實酶切后得到的基因片段與預期大小758bp相符(圖4)。測序結果表明，插入PGEM-T載體的B7-H4基因3’ -UTR片段序列正確，如圖5所示。抽提pGEM_T載體，酶切獲得B7-H4基因3’ -UTR片段；將其插入pGL_3載體，然后轉化感受態大腸桿菌。酶切后得到的基因片段與預期大小758bp相符(圖6);測序結果證實插入序列正確(圖7)。2、hsa-miR-143抑制重組熒光素酶表達活性
將200ng重組B7-H4/3’-UTR/pGL-3熒光素酶表達載體、20ng內參質粒pRL_TK與IOpmol hsa-miR-143共同轉染CHO細胞后，采用熒光素酶活性檢測試劑盒檢測轉染培養后CHO細胞中熒光素酶的活性。結果顯示，在CHO細胞中加入hsa-miR-143后，熒光素酶的活性比值(pGL-3/pRL-TK)顯著低于不加hsa-miR-143的細胞(圖8)。由此表明，hsa-miR-143通過與B7-H4基因3’ -UTR上靶序列結合，抑制了熒光素酶的表達。
上述實例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人是能夠了解本發明的內容并據以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明精神實質所做的等效變換或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種微小RNA用于調控B7-H4基因表達,其特征在于,所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體5’ -UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。
2.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA能與B7-H4基因3’_UTR結合，抑制B7-H4基因表達。
3.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA為miR-143。
4.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA通過化學合成而得。
5.根據權利要求I所述的用途，其特征在于，所述微小RNA來自生物體樣本，包括組織、細胞和外周血。
全文摘要
本發明公開了一種微小RNA用于調控B7-H4基因表達，所述的微小RNA為包含以下序列的核酸或者功能片段或變體:5’-UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3’。所述微小RNA為miR-143。本發明人采用體外生物學功能實驗證實，hsa-miR-143可與B7-H4基因3’-UTR結合，從而抑制B7-H4分子表達；可通過調控B7-H4信號通路和/或miR-143表達及功能以發揮抗腫瘤作用。
文檔編號C12N15/113GK102776192SQ20121025261
公開日2012年11月14日 申請日期2012年7月20日 優先權日2012年7月20日
發明者張學光, 朱健潔, 汪維鵬 申請人:蘇州大學