本發明涉及基因工程領域，具體涉及植物抗旱相關蛋白EtSnRK2.2及其編碼基因和應用。
背景技術：
：小麥作為我國重要的糧食作物之一，在國民經濟中占有非常重要的地位。然而，每年因干旱、鹽堿等逆境脅迫條件嚴重影響著小麥的產量和品質，制約著我國小麥糧食安全。利用基因工程技術從分子水平上深入研究植物與非生物逆境之間的關系，揭示植物對逆境脅迫信號傳導及基因表達調控分子機理，克隆抗逆相關基因為培育作物抗逆新種質提供候選抗逆基因資源。蔗糖非發酵相關蛋白激酶家族(SnRKs)在植物的許多生理過程中起著重要的作用，例如激素信號傳導、非生物脅迫和植物的生長發育等。SnRK2家族基因在功能上表現出差異性，擬南芥中SnRK家族成員中有9個基因被甘露醇或NaCl高滲脅迫誘導，5個基因被ABA誘導，但均不受冷脅迫誘導。水稻中SnRK基因，通過蛋白磷酸化分析表明所有成員都能被高滲脅迫激活，但是只有OsSAPK8、OsSAPK9和OsSAPK10這三個基因受ABA誘導表達。在小麥中，第一個SnRK2成員是從ABA處理的小麥胚胎cDNA文庫中分離得到的PKABA1，PKABA1的表達除受ABA和干旱脅迫所誘導。TaSnRK2.4基因過表達能夠增強轉基因擬南芥對干旱、高鹽的脅迫耐性，同時不會造成植物的生長矮化現象。TaSnRK2.7基因功能分析顯示，在糖代謝、降低滲透勢、增強光系統II的活性以及促進植物生根等生理生化過程中起著重要作用；TaSnRK2.8基因過表達的擬南芥對干旱、低溫、高鹽、高溫等均有一定脅迫耐性。因此，克隆、分離抗逆相關SnRK蛋白激酶基因改良和提高作物的抗逆性具有非常重要的意義。技術實現要素：本發明的目的是提供一種植物抗旱相關蛋白EtSnRK2.2。本發明的再一目的是提供編碼上述植物抗旱相關蛋EtSnRK2.2的基因。本發明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發明的另一目的是提供包含上述基因的轉基因細胞系。本發明的另一目的提供上述植物抗旱相關蛋白EtSnRK2.2的應用。本發明所提供的抗旱相關蛋白EtSnRK2.2，來源于毛穗偃麥草，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本發明的蛋白激酶由343個氨基酸殘基組成，是SnRK類蛋白激酶。自SEQIDNO.1的氨基末端第10-30位氨基酸殘基是ATP結合域，自SEQIDNO.1的第115-130位氨基酸殘基為絲氨酸/蘇氨酸結合域。SEQIDNO：1為了使蛋白EtSnRK2.2便于純化，可在由SEQIDNO.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL根據本發明所公開的SEQIDNO.1序列，本發明的轉錄因子EtSnRK2.2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。根據本發明的EtSnRK2.2編碼基因具有如SEQIDNO.2所示cDNA序列。SEQIDNO.2含有EtSnRK2.2基因的表達盒、重組表達載體、轉基因細胞系及重組菌均屬于本發明的保護范圍。可用現有的植物表達載體構建含有EtSnRK2.2基因的重組表達載體。所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(Ti)質粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。使用EtSnRK2.2構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動子、玉米的泛素啟動子(Ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是ATG起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(GUS基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除莠劑基因)等。從轉基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標記基因，直接以逆境篩選轉化植株。本發明的另一個目的是提供一種培育耐逆植物的方法。本發明所提供的培育耐逆植物的方法，是將上述任一種含有EtSnRK2.2基因的重組表達載體導入植物細胞中，得到耐逆植物。利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將本發明所提供的SnRK蛋白激酶EtSnRK2.2基因導入植物細胞，可獲得對干旱和鹽等非生物逆境脅迫耐受力增強的轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有編碼基因的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：擬南芥、小麥、毛穗偃麥草、擬南芥、水稻、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。本發明以抗旱性較強的毛穗偃麥草(ElytrigiatrichophoraL.)為實驗材料，得到了抗逆相關的EtSnRK2.2蛋白及其編碼基因，并將其導入小麥，顯著提高了轉基因小麥的抗旱性。本發明的抗旱相關蛋白及其編碼基因對改良、增強小麥抗逆性，提高產量、加速抗逆分子育種進程，以及有效節省水資源具有十分重要的理論和實際意義。下面結合附圖及具體實施例對本發明做進一步說明。附圖說明圖1顯示EtSnRK2.2轉基因小麥分子檢測結果。M：Trans2KPlusDNAmarker；7：陰性對照；2-6為不同轉基因小麥株系。圖2顯示EtSnRK2.2轉基因小麥旱棚抗旱鑒定結果，其中，京冬18為受體對照；446-1，463-2，660-1，471-3為不同轉基因株系。圖3顯示EtSnRK2.2轉基因小麥田間抗旱生理指標測定結果，主要測定了446-1，463-2，660-1，471-3轉基因株系及受體京冬18的可溶性糖及葉綠素熒光。圖4顯示了EtSnRK2.2轉基因小麥不同株系表型比較，主要考察了421-1、437-8、471-2、582-1轉基因株系及受體京冬18的穗粒數、株高、穗長等數據。具體實施方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書進行。以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。實施例1：毛穗偃麥草抗旱相關EtSnRK2.2基因的cDNA克隆對生長30天左右的毛穗偃麥草幼苗進行干旱處理5小時，用Trizol提取毛穗偃麥草總RNA。應用5’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18374-058)和3’RACE試劑盒(GIBCOBRL,CAT.NO.18373-019)獲得EtSnRK2.2基因的全長序列1032bp。用Trizol提取毛穗偃麥草幼苗的總RNA，用superscriptII(invitrogen)反轉錄酶反轉錄獲得到cDNA。根據EtSnRK2.2基因編碼區序列設計引物P1和P2。以反轉錄得到的cDNA為模板，用引物P1和P2進行PCR擴增。引物P1和P2的序列如下：P1：5’-ATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’，P2：5’-TTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’。對PCR產物進行0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到分子量約為1kb左右的條帶，與預期結果相符。回收該片段，將該回收片段與pGEM-TEasy(Promega)連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，根據pGEM-TEasy載體上的氨卞青霉素抗性標記篩選陽性克隆，得到含有回收片段的重組質粒。以該重組質粒載體上的T7和SP6啟動子序列為引物對其進行核苷酸序列測定，測序結果表明擴增到的EtSnRK2.2基因的開放閱讀框(ORF)為SEQIDNo.2的自5’末端第1至1032位脫氧核糖核苷酸，編碼氨基酸序列是SEQIDNo.1的蛋白質。將含序列SEQIDNo.2所示EtSnRK2.2基因的重組載體命名為pTE-EtSnRK2.2。EtSnRK2.2基因為一個新基因，進一步用引物P1和P2在毛穗偃麥草基因組中進行擴增，結果顯示該基因的基因組序列大小與cDNA長度大小一致，不含有內含子序列。實施例2：用EtSnRK2.2基因增強植物的抗旱性1、重組表達載體的構建1)Ubi-EtSnRK2.2重組表達載體的構建以毛穗偃麥草的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用含有HindIII和BamHI接頭序列的特異引物進行PCR擴增；然后HindIII和BamHI雙酶切PCR產物回收，將酶切產物正向插入載體pNT112的Ubi啟動子之后的HindIII和BamHI酶切位點之間，得到重組載體Ubi::EtSnRK2.2。引物序列如下：EtSnRK2.2[HindIII]5’-TCAAGCTTATGGATCGGTACGAGGTGGT-3’EtSnRK2.2[BamHI]5’-GGGGATCCTTACAAAGGGCACACGAAATCC-3’2、轉基因小麥獲得和功能鑒定1)轉基因小麥材料的獲得將上述構建的重組表達載體pUbi::EtSnRK2.2分別用凍融法轉化根癌農桿菌C58C1，再用pUbi::EtSnRK2.2的根癌農桿菌C58C1轉化小麥，用含200mg/LBasta的MS培養基進行篩選，得到陽性轉基因植株。將篩選得到的陽性轉基因植株用PCR做進一步鑒定篩選，PCR所用的一對引物為P3和P4。P3(上游引物):5’-GGAGATTATGAACCACCGGT-3’，P4(下游引物):5’-TCTCCGGGATGGTTATTCGC-3’。對Ubi::EtSnRK2.2轉基因小麥進行PCR鑒定，陽性轉基因植株經PCR擴增可獲得1000bp左右條帶，結果獲得轉Ubi::EtSnRK2.2小麥56株(圖1)。同時將pNT112空載體導入小麥，方法同上，作為對照，獲得10個株系的轉空載體小麥，篩選獲得的轉基因小麥用T2代表示。2)EtSnRK2.2轉基因小麥抗旱性鑒定在全生育期只澆返青水情況下，對種植的EtSnRK2.2轉基因材料進行旱棚抗旱性篩選。對田間抗旱表型鑒定發現，EtSnRK2.2轉基因株系持綠性較好，旗葉仍然能夠正常進行光合作用，籽粒灌漿充足，千粒重增加顯著；而對照京冬18持綠性差，旗葉及其他部位葉片發黃、早衰嚴重，不能正常進行光合作用(圖2)。可溶性糖、葉綠素熒光生理指標測定發現，EtSnRK2.2轉基因株系的葉綠素熒光值、可溶性糖含量均比對照積累較多(圖3)。此外，從收獲的考種數據分析發現，轉基因株系的穗粒數、根系、穗長等性狀均優于對照，從而使得EtSnRK2.2轉基因材料耐旱性顯著增強(圖4)。<110>北京市農林科學院<120>植物抗旱相關蛋白EtSnRK2.2及其編碼基因和應用<160>2<210>1<211>343<212>PRT<213>偃麥草<400>1MDRYEVVRDIGSDNFGVAKLVRDVRTKEHFAVKFIKRGRKIDEHVQREIMNHRSLKHPNI60IRFKEVVLTPTHLAIIMEYASGGELFQRICNAGRFSEDEGRFFFQQLISGVSYCHSMQVC120HRDLKLENTLLDGSVAPRLKICGFGYSKSSVLHSQPKSTVGTPAYIAPEVLSRREYDGKV180ADVWSCGVTLYVMLVGAYPFEDPDEPRNFRKTITRILSVQYS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