專利名稱：皺紋盤鮑基因組dna的無損傷提取方法
技術領域：
本發明涉及一種基因組DNA的提取方法，特別是一種皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法。
背景技術：
皺紋盤鮑(Haliotisdiscus hannai)屬于軟體動物門腹足綱、前鰓亞綱、原始腹足目，是鮑科貝類分布于我國北方的唯一種，也是遼寧和山東沿海海水養殖的重要對象。利用現代分子生物學技術，對皺紋盤鮑進行群體遺傳結構分析和遺傳改良等操作，均必須對皺紋盤鮑的基因組DNA進行提取。傳統的動物基因組提取方法主要是以肌肉組織或外周血細胞為DNA提取對象，這些方法都會不可避免地導致皺紋盤鮑處于應激狀態，造成永久性損傷甚至死亡，無法使試驗對象繼續應用于生產。目前，國際貝類育種已開始流行基于親權鑒定的Walk-back選擇法，而采用此種方法必須在選擇前對子代貝類的家系歸屬進行鑒定，因此現在需要采用一種無損傷的DNA提取方法，以免影響鮑的存活能力和生產性能。
發明內容
本發明是為了解決現有技術所存在的上述不足，提出一種簡單、高效、便捷，且不會對皺紋盤鮑造成損傷，不影響其存活能力和生產性能的皺紋盤鮑基因組DNA無損傷提取方法。本發明的技術解決方案是一種皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，其特征在于包括以下步驟
a、使用沾有70%-75%酒精的棉球對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，將處理后的皺紋盤鮑腹面朝上靜置，待分泌粘液后，刮取0. 1-0. 2g粘液和表皮組織碎片的混合物，將該混合物中加入無水乙醇固定，冰上靜置5-10分鐘后，離心分離，取沉淀；
b、所得沉淀中加入細胞裂解液，震蕩混勻；
C、在上步中獲得的混合樣品中加入6iil-20iil，5mg/ml-10mg/ml的蛋白酶K，在65°C的條件下消化3-5小時，且每15分鐘震蕩一次，消化完成后在4°C條件下冷卻10-20分鐘；
d、在冷卻后的樣品中加入7.5M/L的NH4Ac,加入的體積為樣品總體積的
\，冰上靜置5-10分鐘后，4°C條件下離心，取上清液；
e、在所得的上清液中加入與其體積相同的異丙醇，充分震蕩混勻，冰上靜置2-5分鐘后，離心取沉淀；
f、所得沉淀用70%-75%的乙醇洗滌兩次，室溫下曬置5-10分鐘，獲得皺紋盤鮑基因組
DNA。本發明同現有技術相比，具有如下優點
本發明與傳統的動物基因組DNA提取方法的主要區別是，通過75%的乙醇刺激皺紋盤鮑的外套膜，使其分泌粘液，并通過處理粘液即掛取粘液時一同獲得的表皮組織碎片進而、提取基因組DNA。本方法的優點是首先，保護了取樣個體的組織完整性，沒有造成任何機械性損傷，通過不長的恢復期個體即可從應激狀態中恢復過來，可以長期多次取樣；其次，通過75%乙醇清洗，起到了消毒殺菌和減少外源DNA干擾的作用，有利于獲得高質量的DNA。本方法所得DNA可廣泛應用于皺紋盤鮑的種群遺傳結構分析、系統進化和分子標記輔助育種等方面，也為利用分子手段連續監測特定個體的生長發育情況奠定了基礎。同時本方法還可以應用于其它貝類如九孔鮑、櫛孔扇貝等的育種上。因此可以說這種DNA提取方法具備了多種優點，特別適合于在本領域中推廣應用，其市場和科研前景十分廣闊。
具體實施例方式下面說明本發明的具體實施方式
。
實施例一
皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，它包括以下步驟首先取鮮活皺紋盤鮑，用無菌人工海水反復沖洗3遍，使其腹面朝上，室溫下靜置5分鐘。使用沾有70%酒精的棉球對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，將處理后的皺紋盤鮑腹面朝上靜置5分鐘，待分泌粘液后，刮取0. Ig粘液和表皮組織碎片的混合物，并將混合物放入離心管內，向離心管中加A 600微升無水乙醇進行樣品固定，固定后的樣品于冰上靜置8分鐘后，上離心機分離，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入細胞裂解液600微升，這里的細胞裂解液推薦選用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震蕩混勻；
混勻后的樣品中加入I的蛋白酶K(其濃度為10mg/ml),并在65°C條件下消化3小時，每15分鐘震蕩一次，消化完成后在4°C條件下冷卻10分鐘；
在冷卻后的樣品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的體積為樣品總體積的三分之一，在冰上靜置5分鐘后，4°C條件下離心，取上清液；
在獲得的上清液中加入等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，在冰上靜置2分鐘后，離心取沉淀；
將所得的沉淀用70%的乙醇洗滌兩次，并在室溫下曬置5分鐘，便獲得皺紋盤鮑基因組DNA ;將基因組DNA在4°C的條件下保存在無水乙醇中，或溶解于適量的無菌水中備用即可。實施例二
皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，它包括以下步驟首先取鮮活皺紋盤鮑，用無菌人工海水反復沖洗3遍，使其腹面朝上，室溫下靜置5分鐘。使用沾有72%酒精的棉球對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，將處理后的皺紋盤鮑腹面朝上靜置5分鐘，待分泌粘液后，刮取0. 15g粘液和表皮組織碎片的混合物，并將混合物放入離心管內，向離心管中加A 600微升無水乙醇進行樣品固定，固定后的樣品于冰上靜置5分鐘后，上離心機分離，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入細胞裂解液600微升，這里的細胞裂解液推薦選用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震蕩混勻；
混勻后的樣品中加入12ii I的蛋白酶K(其濃度為8mg/ml),并在65°C條件下消化4小時，每15分鐘震蕩一次，消化完成后在4°C條件下冷卻15分鐘；
在冷卻后的樣品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的體積為樣品總體積的三分之一，在冰上靜置8分鐘后，4°C條件下離心，取上清液；
在獲得的上清液中加入等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，在冰上靜置3分鐘后，離心取沉淀；
將所得的沉淀用73%的乙醇洗滌兩次，并在室溫下曬置8分鐘，便獲得皺紋盤鮑基因組DNA ;將基因組DNA在4°C的條件下保存在無水乙醇中，或溶解于適量的無菌水中備用即可。實施例三
皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，它包括以下步驟首先取鮮活皺紋盤鮑，用無菌人工海水反復沖洗3遍，使其腹面朝上，室溫下靜置5分鐘。使用沾有75%酒精的棉球對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，將處理后的皺紋盤鮑腹面朝上靜置5分鐘，待分泌粘液后，刮取0. 2g粘液和表皮組織碎片的混合物，并將混合物放入離心管內，向離心管中加入600微升無水乙醇進行樣品固定，固定后的樣品于冰上靜置10分鐘后，上離心機分離，取沉淀物；
在所得的沉淀物中加入細胞裂解液600微升，這里的細胞裂解液推薦選用Tris-Cl100 mM, EDTA 50 mM, 1% SDS, pH 8.0，并震蕩混勻；
混勻后的樣品中加入20 ii I的蛋白酶K(其濃度為5mg/ml),并在65°C條件下消化5小時，每15分鐘震蕩一次，消化完成后在4°C條件下冷卻20分鐘；
在冷卻后的樣品中加入7. 5M/L的NH4Ac,加入的體積為樣品總體積的三分之一，在冰上靜置10分鐘后，4°C條件下離心，取上清液；
在獲得的上清液中加入等體積的異丙醇，充分震蕩混勻，在冰上靜置5分鐘后，離心取沉淀；
將所得的沉淀用75%的乙醇洗滌兩次，并在室溫下曬置10分鐘，便獲得皺紋盤鮑基因組DNA ;將基因組DNA在4°C的條件下保存在無水乙醇中，或溶解于適量的無菌水中備用即
可。權利要求
1.一種皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，其特征在于包括以下步驟 a、使用沾有70%-75%酒精的棉球對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，將處理后的皺紋盤鮑腹面朝上靜置，待分泌粘液后，刮取0. 1-0. 2g粘液和表皮組織碎片的混合物，將該混合物中加入無水乙醇固定，冰上靜置5-10分鐘后，離心分離，取沉淀； b、所得沉淀中加入細胞裂解液，震蕩混勻；C、在上步中獲得的混合樣品中加入6iil-20iil，5mg/ml-10mg/ml的蛋白酶K，在65°C的條件下消化3-5小時，且每15分鐘震蕩一次，消化完成后在4°C條件下冷卻10-20分鐘； d、在冷卻后的樣品中加入7.5M/L的NH4Ac,加入的體積為樣品總體積的-，冰上靜置5-10分鐘后，4°C條件下離心，取上清液； e、在所得的上清液中加入與其體積相同的異丙醇，充分震蕩混勻，冰上靜置2-5分鐘后，離心取沉淀； f、所得沉淀用70%-75%的乙醇洗滌兩次，室溫下曬置5-10分鐘，獲得皺紋盤鮑基因組DNA。
全文摘要
本發明公開一種皺紋盤鮑基因組DNA的無損傷提取方法，包括以下步驟用75%酒精對皺紋盤鮑的外套膜進行消毒和刺激，刮取粘液和表皮組織碎片的混合物，并對該混合物經過處理后離心分離取沉淀；在沉淀中加入細胞裂解液；蛋白酶K，經消化、震蕩后冷卻一段時間；并在樣品中加入NH4Ac，離心取上清液；在上清液中加入異丙醇，震蕩混勻后離心取沉淀；所得沉淀用乙醇洗滌，并室溫下曬置5分鐘，便獲得皺紋盤鮑基因組DNA。這是一種簡單、高效、便捷，且不會對皺紋盤鮑造成損傷，不影響其存活能力和生產性能的皺紋盤鮑基因組DNA無損傷提取方法。
文檔編號C12N15/10GK102747069SQ20121025667
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月24日 優先權日2012年7月24日
發明者劉小林, 劉明泰, 常亞青, 張艷, 李丹, 李旭光, 李楊, 許淑芬 申請人:大連海寶漁業有限公司