專利名稱：一種以秸稈為原料發酵生產丙酮、乙醇、丁醇的方法
技術領域：
本發明涉及一種以秸桿為原料發酵生產丙酮、乙醇、丁醇的方法，具體涉及在發酵過程中添加FeSO4. 7H20來制備丙酮、乙醇、丁醇的方法。
背景技術：
丙酮、乙醇、丁醇(acetone-ethanol-butanol,以下簡稱ABE)發酵是一項傳統的大宗發酵工業，曾是僅次于酒精發酵的世界第二大發酵過程。我國從建國初期開始利用玉米、糖蜜、高粱等進行ABE發酵的工業化生產，同時也形成了穩定的發酵工藝。由于石化工業的發展，ABE發酵逐漸衰退。但是隨著石化資源的耗竭和溫室效應等環境問題的日益突出，利用可再生資源生產化工原料和能源物質受到高度重視。然而，利用糧食作物生產ABE引起人們對糧食安全與環境影響的憂慮，因此科學家對利用秸桿為原料生產ABE產生了濃
厚的興趣，與使用玉米和大豆等糧食作為原料的第一代生物燃料相比，秸桿ABE的最大優勢在于避免了“道德風險”，一旦產業化生產，秸桿ABE可以解決“與人爭糧”的問題，還可以變廢為寶。我國可利用的秸桿每年在7X108t左右，這些農業廢棄物是ABE生產的豐富來源。秸桿類生物質在發酵前需要進行預處理，預處理后會生成葡萄糖、木糖等可發酵性糖，同時會產生大量鹽類物質、酸類物質、醛類物質和酚類物質等抑制物。ABE生產菌對葡萄糖和木糖都有較高的利用效率，但對酚類、醛類等抑制物比較敏感，因此以秸桿水解物為底物發酵時需要進行復雜脫毒處理。目前常用的脫毒方法有物理法、化學法和生物法。物理法主要有旋轉蒸發、活性炭吸附、離子交換樹脂等，其中旋轉蒸發適合乙酸、糠醛等易揮發性物質的去除。活性炭吸附是主要依靠吸附作用除去部分木質素降解物及其他毒害物質，離子交換樹脂既可以除去無機離子也可除去水解液中大部分糠醛、醋酸等，化學法是通過化學沉淀、改變PH及一些抑制物的電離特性從而達到降低毒性的目的，生物法是用特定的酶或微生物作用于發酵抑制物，通過改變抑制物的結構而降低毒性。實際應用中單一方法難以滿足發酵需求，通常是各種方法綜合利用。這些脫毒方法明顯增加了生產成本，限制了利用秸桿生產ABE的產業化。因此，只有針對性地開發廉價、操作性高的生產工藝，避開脫毒工藝，才能真正實現以秸桿為原料生產ABE。

發明內容
本發明的目的是為了解決秸桿類原料預處理后需要復雜脫毒工藝才能用于ABE發酵的問題，選用一類廉價的添加物加入秸桿水解液后快速發酵生成ABE，簡化生產工藝，降低ABE生產成本。本發明的目的是通過如下措施來達到本發明以農業廢棄物秸桿為原料，主要包括如下工藝單元秸桿的預處理、秸桿的酶水解、發酵培養基的配制、ABE生產微生物種子液的制備、ABE發酵、溶劑蒸餾。具體步驟如下
a :秸桿的預處理將新鮮秸桿曬干后后粉碎過篩；b :秸桿的酶水解將步驟a得到的秸桿干粉與O. 5 % (體積比)硫酸混勻，121 °C處理60min后，Ca(OH)2調節pH為4. 8，添加預處理酶，混勻后55°C處理36— 54h。3000r/min離心5min,除去固體物質,上清即為稻桿水解液。c :發酵培養基的配制向每 升步驟b中得到的秸桿水解液中加入2g CH3COO(NH4)、O. 6g KH2PO47O. 4g K2HPO4^MgSO4O. 2g、1.5g 豆粉;用 Ca (OH) 2 調 pH 為 7. 0。加入到厭氧瓶中，向厭氧瓶中充N2去除O2,115°C滅菌20min備用；d =ABE生產微生物種子液的制備將混合均勻的4一6% (質量比)玉米粉蒸煮30min,補足蒸發水分后，充N2去除O2,115°C滅菌20min,即配制成種子培養基；加入5—10% (體積比)菌種孢子液，沸水浴熱擊40— 60s，37°C靜止培養18 — 24h即為微生物種子液；e =ABE發酵將步驟c中得到的發酵培養基在無菌條件下接入步驟d中得到的10% (體積比)微生物種子液和1% (體積比)混合維生素液，37°C靜止發酵18 — 24h時，添加 FeSO4. 7H20, 37 °C 靜止發酵 48— 54h。f :溶劑蒸餾采用常規工藝蒸餾發酵醪液制得丙酮、乙醇和丁醇。所述的發酵過程為在無菌條件下接入10% (體積比)微生物種子液和1% (體積比)混合維生素液，37°C靜止發酵18 — 24h時添加FeSO4. 7H20, 37°C繼續靜止發48— 54h ；所述FeSO4. 7H20 加入量為 O. I—lg/L ；所述秸桿為小麥秸桿、水稻秸桿、玉米秸桿中的任意一種或幾種的混合物。所述步驟a中是將新鮮秸桿曬干后粉碎過40目篩；所述秸桿干粉與O. 5 % (體積比)硫酸混勻時按I : 6— I 12 (質量比)混合。所述預處理酶為纖維素酶和木聚糖酶，木聚糖酶的標準酶活> I X 108U/ml (酶活定義1ml酶液于50°C、pH5. O條件下，Imin水解I %木聚糖溶液產生I μ g木糖的酶量為一個木聚糖酶活力單位。)；纖維素的標準酶活(CMC酶活)> lX105u/ml (酶活定義1ml酶液于50°C，pH4. 5條件下，Imin催化CMC水解生成I μ g葡萄糖為一個纖維素酶CMC活力單位)。所述加入的預處理酶量為纖維素酶50μ 1/lOOml秸桿水解液和木聚糖酶50 μ I/IOOml稻桿水解液。所述的菌種為丙酮丁醇梭菌(CLostridiumacetobutylicum CICC8012),保存于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCM 2010148 ;保藏日期2010年6月17日；保藏單位地址中國武漢武漢大學，郵編430072。所述的維生素混合液包括肌醇、維生素BI、維生素B6、煙酸、生物素，其在混合液中的終濃度為(mg/L):肌醇200，維生素B180，維生素B680，煙酸80，生物素I。蒸餾水配制后過濾除菌，4°C保存備用。其中，步驟e中發酵液中的ABE含量可以用氣相色譜法測定。發酵結束后氣相色譜測定發酵醪液中溶劑濃度，其中乙醇含量O. 79g/L，丙酮含量3. 71g/L，丁醇含量 6. 59g/L，總溶劑含量 11. 09g/L。本發明的有益效果I.本發明利用秸桿進行微生物ABE轉化，在生產ABE的同時，解決秸桿不能被合理利用對環境造成的壓力。2.秸桿預處理后直接發酵，發酵過程中添加FeSO4. 7H20繼續靜止發酵，避開了復雜的脫毒工藝，降低了生產成本。
具體實施例方式以下以具體實施例來說明本發明的技術方案，但并非是對本發明的技術方案的限制，本領域技術人員應該理解，依然可以對發明進行修改或等同替換，而不脫離本發明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應涵蓋在本發明的保護范圍之中。對照例I新鮮玉米秸桿曬干后粉碎過40目篩，取20g秸桿干粉放入500ml三角瓶，加入200ml0. 5%稀硫酸，121°C處理60min后，Ca(OH)2調節pH為4. 8，同時添加100 μ I纖維素
酶和ΙΟΟμ I木聚糖酶，混勻后55°C處理48h。3000r/min離心5min，除去固體物質，上清即為水解液。取上清液 50ml，加入 CH3COO(NH4)O. lg、KH2PO4O. 03g、MgSO4O. 01g、0. 075g 豆粉，用Ca(OH)2調pH為7. 0，轉入IOOml厭氧瓶中，充N2去除O2后115°C滅菌20min作為發酵培養基備用。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養72h,氣相色譜測定發酵液中乙醇含量O. 78g/L，丙酮含量I. 72g/L，丁醇含量3. 92g/L，總溶劑含量6. 42g/L。其中，通過采用常規工藝蒸餾發酵醪液制得丙酮、乙醇和丁醇，以下對照例和實施例也可照此常規工藝蒸餾發酵醪液制得丙酮、乙醇和丁醇。其中微生物種子液的制備是按發明內容部分所述的方法，即將混合均勻的4一6%(質量比)玉米粉蒸煮30min，補足蒸發水分后，充N2去除O2，115 °C滅菌20min，即配制成種子培養基；加入5 —10% (體積比)菌種孢子液，沸水浴熱擊40— 60s，37°C靜止培養18—24h即為微生物種子液。下面的對照例和實施例中的微生物種子液的制備均按上述方法操作。對照例2新鮮小麥秸桿處理及發酵培養基配制同對照例I。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養72h，氣相色譜測定發酵液中乙醇含量O. 44g/L,丙酮含量I. 45g/L, 丁醇含量4. 22g/L,總溶劑含量6. I lg/L。對照例3新鮮水稻秸桿處理及發酵培養基配制同對照例I。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養72h,發酵液中乙醇含量I. 47g/L，丙酮含量2. 08g/L, 丁醇含量3. 14g/L，總溶劑含量6. 69g/L0對照例4河南省南陽市天冠集團有限公司提供玉米秸桿氣爆水解液，檢測水解液單糖為葡萄糖，含量為7. 49%。3000r/min離心5min，除去固體物質，取上清液稀釋糖濃度為5. 5%，取稀釋液 50ml，加入0130)0(順4)0· Ig^KH2PO4O. 03g,MgSO4O. 01g、0. 075g 豆粉，用 Ca (OH) 2 調pH為7.0，轉入IOOml厭氧瓶中，充N2去除02后115°C滅菌20min作為發酵培養備用。
發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養72h,氣相色譜測定發酵液中乙醇含量I. 27g/L，丙酮含量2. 69g/L，丁醇含量7. 55g/L，總溶劑含量11.31g/L。實施例I新鮮玉米秸桿處理及發酵培養基配制同對照例I。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養24h，添加O. Olg FeSO4. 7H20后繼續靜止發酵48h，氣相色譜測定發酵液中乙醇含量O. 79g/L,丙酮含量3. 71g/L，丁醇含量6. 59g/L，總溶劑含量11. 09g/L。實施例2新鮮小麥秸桿處理及發酵培養基配制同對照例I。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養24h，添加O. 02g FeSO4. 7H20后繼續靜止發酵48h，氣相色譜測定發酵液中乙醇含量O. 66g/L,丙酮含量3. 64g/L，丁醇含量6. 12g/L，總溶劑含量10. 42g/L。實施例3新鮮水稻秸桿處理及發酵培養基配制同對照例I。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養24h，添加O. 03gFeS04. 7H20后繼續靜止發酵48h，發酵液中乙醇含量O. 72g/L，丙酮含量3. 75g/L，丁醇含量 6. 21g/L，總溶劑含量 10. 68g/L。實施例4玉米秸桿氣爆水解液處理及發酵培養基配制同對照例4。發酵培養基接入5ml微生物種子液，同時加入O. 5ml維生素混合液，37°C靜止培養24h，添加O. 02gFeS04. 7H20后繼續靜止發酵48h，氣相色譜測定發酵液中乙醇含量I. 42g/L，丙酮含量4. 12g/L，丁醇含量9. llg/L，總溶劑含量15. 65g/L。結果顯示，本發明所述的以秸桿為原料生產ABE的方法工藝簡單，避免了常用的脫毒工藝，添加FeSO4. 7H20后，發酵終止時發酵液中乙醇含量O. 79g/L，丙酮含量3. 71g/L，丁醇含量6. 59g/L，總溶劑含量11. 09g/L。
權利要求
1.一種以秸桿為原料發酵生產丙酮、乙醇、丁醇的方法，其特征在于包含以下步驟 a :秸桿的預處理將新鮮秸桿曬干后粉碎過篩； b :秸桿的酶水解將步驟a得到的秸桿干粉與O. 5% (體積比)硫酸混勻，121°C處理60min后，Ca(OH)2調節pH為4. 8，添加預處理酶，混勻后55°C處理36— 54h ；3000r/min離心5min，除去固體物質，上清即為秸桿酶水解液； c :發酵培養基的配制向每升步驟b中得到的秸桿酶水解液中加入2gCH3C00(NH4)、O.6g KH2PO4,0. 4g K2HPO4^MgSO4O. 2g、I. 5g 豆粉，用 Ca (OH) 2 調 pH 為 7. 0 ;加入到厭氧瓶中，向厭氧瓶中充N2去除O2,115°C滅菌20min備用； d:丙酮、乙醇、丁醇發酵微生物種子液的制備將混合均勻的4一6% (質量比)玉米粉蒸煮30min,補足蒸發水分后,充N2去除O2,115°C滅菌20min,即配制成種子培養基；加入5—10% (體積比)菌種孢子液，沸水浴熱擊40— 60s，37°C靜止培養18 — 24h即為微生物種子液； e :丙酮、乙醇、丁醇發酵將步驟c中得到的發酵培養基在無菌條件下接入步驟d所述的10% (體積比)的微生物種子液和I % (體積比)混合維生素液，37°C靜止發酵18—24h時，添加 FeSO4. 7H20, 37 °C 靜止發酵 48— 54h ； f :溶劑蒸餾采用常規工藝蒸餾發酵醪液制得丙酮、乙醇和丁醇。
2.根據權利要求I所述方法，其特征在于，步驟a中是將新鮮秸桿曬干后粉碎過40目篩。
3.根據權利要求I所述方法，其特征在添加FeSO4.7H20的量為O. I — lg/L。
4.根據權利要求I所述方法，秸桿為小麥秸桿、水稻秸桿、玉米秸桿中的任意一種或幾種的混合物。
5.根據權利要求I所述方法，其特征在于秸桿干粉與O.5% (體積比)硫酸按I : 6—I : 12 (質量比)混勻。
6.根據權利要求I所述方法，其特征在于步驟b中加入的預處理酶是纖維素酶和木聚糖酶的混合物。
7.根據權利要求I或6所述方法，其特征在于加入的預處理酶量為纖維素酶50 μ l/100ml秸桿水解液、木聚糖酶50 μ l/100ml秸桿水解液。
8.根據權利要求I所述方法，所述的菌種為丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)CICC8012，保藏號為 CCTCC M 2010148。
9.根據權利要求I所述方法，其特征在于混合維生素液成分為mg/L:肌醇200mg/L，維生素 B180mg/L，維生素 B680mg/L，煙酸 80mg/L，生物素 lmg/L。
全文摘要
本發明涉及一種以秸稈為原料發酵生產丙酮、乙醇、丁醇的方法，其特征在于向所述秸稈類原料中添加FeSO4．7H2O。該工藝包括秸稈的預處理，秸稈的酶水解，發酵培養基的配制，丙酮、乙醇、丁醇發酵微生物種子液的制備，發酵等步驟。通過利用秸稈來生產丙酮、乙醇、丁醇，通過單添加FeSO4．7H2O促進發酵，提高了溶劑產量和生產效率，降低了生產成本，簡化了生產工藝。
文檔編號C12P7/10GK102876736SQ20121025952
公開日2013年1月16日 申請日期2012年7月25日 優先權日2012年7月25日
發明者趙海, 靳艷玲, 方揚, 郜曉峰 申請人:中國科學院成都生物研究所