芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼產物和應用的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼蛋白與用途，該基因為首次利用構建cDNA文庫從芍藥中克隆而得，填補了從我國傳統中藥材芍藥中分離克隆出2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶基因的空白。本發明所提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因具有SEQ?IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發明提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因可以通過生物技術提高芍藥中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸代謝產物的含量，在藥材芍藥的品質改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。
【專利說明】芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼產物和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物【技術領域】，主要涉及利用芍藥cDNA文庫克隆2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶基因及其編碼產物與應用，尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機酸、萜類酶基因及其編碼產物與應用，屬于藥用植物基因工程領域。
【背景技術】
[0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調控機制和解釋藥材品質的形成提供理論基礎，同時為利用生物技術提高目標成分含量或直接生產有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。藥用植物的化學成分復雜，種類繁多，其中主要含有有機酸類、黃酮類、揮發油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分，芍藥Paeonia lactif 1ra不僅是名花,還是一味常用中藥,其根可供藥用。其中白茍具有鎮痙、鎮痛、通經等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分，其中芍藥苷屬于單萜類化合物，具有顯著的鎮痛、鎮靜、抗驚厥、，解痙、解熱、抗炎、抗潰瘍、抗過敏、降血糖、調節免疫、保護肝臟等作用(楊俊，方紅編。芍藥[M]。北京:中國中醫藥出版社，2001，113)。
[0003]2_ 甲基-D-赤蘚醇-2,4-環二憐酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase, IspF)是位于質體中的職類化合物的脫氧木酮糖_5_磷酸途徑(DXP)中的關鍵酶基因，其表達量可能與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關。IspF能催化4-二憐酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5' -diphospho)-2-C-methyl-D-e·rythritol, CDP-ME2P)生成 2_C_ 甲基-D-赤蘚醇 2,4 環二憐酸(2-C-Methyl-D-erythri to 12,4-cyclodiphosphate, ME_2,4CPP)和 CMP,再經過 1-輕基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、異戊烯基單磷酸激酶(IPK)的作用生成異戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，再進一步合成各種不同的萜類化合物(張長波，孫紅霞，鞏中軍，祝增榮。植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關合酶[J]。植物生理學通訊，2007，43 (4):779-786)。芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因的克隆，為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要基礎，在藥材芍藥的品質改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶基因及其氨基酸序列。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在于提供一種芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4_環二磷酸合酶(PLIspF)基因。
[0005]本發明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質。[0006]本發明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0007]本發明的另一個目的在于提供該基因的應用。
[0008]本發明所提供的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因，為以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]該基因所編碼的蛋白質為芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因，是以下氣基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
[0014]本發明所提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4_環二磷酸合酶(PLIspF)基因是首次從芍藥中克隆制備的，體外實驗表明，I spF能催化4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5 1 -diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol,CDP-ME2P)生成 2-C-甲基-D-赤蘚醇 2，4 環二磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate,ME-2,4CPP)和CMP的活性。利用本發明可以通過基因工程技術來提高芍藥等植物中萜類物質含量。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1:PLIspF功能 域預測分析(來源于NCBI數據庫)；
[0016]圖2 =PLIspF系統進化樹(鄰接法)；
[0017]圖3:表達載體pTrc-PLIspF構建；
【具體實施方式】
[0018]實施例1、芍藥cDNA文庫的構建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉移至 65°C預熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol ? L' EDTA25mmol ? L' NaCl 2.0mol ? I71，PVP402%，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% )，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl，混勻后放置 4°C沉淀過夜；7500g 離心 20 分鐘，沉淀用 500iiL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol ? I71，Tris-HCl (pH8.0) IOmmol ? L' EDTA lmmol ? I71，在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2小時；4°C 13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOiI L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫的構建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Ca.N0.634903)進行建庫，原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]實施例2:芍藥相關基因的克隆
[0024]隨機挑取5000個單克隆進行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 y L，MgCl2 (25mM) 1.8 y L，dNTP (2.5mM) I y L，M13+引物(IOpmol) I u L，M13-引物(IOpmol) I u L，Taq SI 0.4 u L0 PCR 反應條件為 94°C預變性 5 分鐘后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分鐘，35個循環后72°C延伸10分鐘，4°C保存。待PCR反應進入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR產物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，根據膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴增產物送至華大基因公司進行測序，獲得芍藥相關基因序列。
[0025]實施例3、PLIspF基因的生物信息學分析
[0026]本發明涉及的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇_2，4-環二磷酸合酶基因全長cDNA的長度為696bp，詳細序列見序列表中的序列I,其中開放讀碼框位于l_696bp。將芍藥全長cDNA序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBankQ)S translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的IspF有較高的同源性，同時具有典型的MEraP_synthase (2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase, IspF)結構域。如圖1。
[0027]實施例4、PLIspF基因功能的研究
[0028]1.表達載體的構建
[0029]以PLIspFcDNA為模板，利用引物Pl:5' -GGATCCATGGCCACGGCGACTCCGCTATA-3'
，P2:5' -TCTAGACTACTTCTTCATAAGA`AGAACCACA-3'進行 PCR 反應，反應體系同實驗例 2。取5ul擴增產物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為708bp。用Bamh I和Xba I在37°C下雙酶切擴增產物2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產物。同時利用BamH I和Xba I在37°C下酶切pMD19_T載體2小時，加入5ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用回收試劑盒回收片段。
[0030]回收片段經T4連接酶在8°C連接過夜。電擊轉化大腸桿菌DH5 a感受態細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子。含PLIspF克隆的pMD19質粒經PCR和限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列分析，保存具有正確目標序列的重組質粒pMD-PLIspF。
[0031]BamH I 和 Xba I 雙酶切攜帶 PLIspF 的 pMD_19T Vector 質粒和 pTrc-AtlPI 質粒，分別回收目標片段708bp和3700bp，于16 °C連接回收片段，獲得重組質粒，經PCR和限制性內切酶酶切鑒定和DNA序列分析，證明含有正確序列的PLIspF，該表達載體命名為pTrc-PLIspF(圖 3)。
[0032]2.工程菌構建
[0033]將pTrc-PLIspF轉化攜帶pAC_BETA質粒的大腸桿菌XLl-Blue，并在含有Amp (150 u g/ml)和Cm(50 u g/ml)的LB培養基上篩選陽性克隆。
[0034]3.PLIspF基因功能分析
[0035]由于在大腸桿菌中存在MEP途徑，菌株XLl-Blue中含有質粒pAC_BETA可以制造和積累(6-胡蘿卜素，并形成黃色菌落。當PTrc-PLIspF被轉化到這種能夠積累(6-胡蘿
卜素的大腸桿菌XLl-Blue中后，細菌的顏色變成黃色或橙黃色，表明PLIspF能加速(6-胡蘿卜素的積累。
[0036]本發明挑取分別含有XLl-Blue+pTrc-PLIspF、XLl-Blue+pTrc-PLIspF+pAC-BETA的大腸桿菌單克隆，在含有Amp (150 ii g/ml)和Cm(50 y g/ml)的LB培養基上，于28°C倒置暗培養，2~3天后觀察菌落顏色變化情況。以含有XLl-Blue、XLl-Blue-+pAC-BETA、XLl-BIue+pTrc+pAC-BETA大腸桿菌單克隆為對照。
[0037]實驗結果表明，2-3天培養后，與對照菌株相比，含有PLIspF的大腸桿菌克隆顏色變成了黃色，從而證明了在PLIspF可以加速(6-胡蘿卜素的積累。
[0038]4.突變IspF驗證
[0039]以PLIspFcDNA為模板，利用突變引物P3:5' -GGATCCATGGCCACGGCAACTCCGCTATA-3'，P45' -TCTAGACTACTTCTTCATAAGAAGAACCACA-3'進行 PCR 反應，表達載體的構建及功能驗證方法同上，結果表明突·變PLIspF轉基因工程菌株與正常PLIspF沒有顯著差異。
【權利要求】
1.一種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環二磷酸合酶(PLIspF)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權利要求1所述的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-壞二磷酸合酶(PLIspF)基因全序列或部分序列。
【文檔編號】C12N9/12GK103571860SQ201210262095
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優先權日:2012年7月27日
【發明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請人:中國中醫科學院中藥研究所