專利名稱：水稻轉錄因子Os05g39950基因的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于遺傳工程領域，具體地說，涉及水稻轉錄因子0s05g39950基因的應用。
背景技術：
水稻(Oryza sativa L.)是人類賴以生存的最重要的 糧食作物之一，也是一個重要的功能基因研究的模式物種，與其相關的遺傳學和分子生物學研究一直倍受關注，其中，轉錄水平的調控是基因表達調控的重要方式。在植物界中，能形成種子的植物約占植物總數的三分之二以上，作為重要的繁殖器官，種子同時也為人們提供食物來源，水稻就是其中的重要代表，種子來源于受精后的胚珠。從分子生物學的角度來說，種子的發育和萌發是一個有次序的、選擇性的基因表達過程。而轉錄因子在其間基因的精確調控中起到了關鍵性的作用。在模式植物擬南芥中很多轉錄因子都影響了種子和器官發育，YABBY類的一些成員在葉、花器官和胚珠的離軸細胞特性決定方面的功能保守(Golz和Hudson，1998)，bZIP類的基因、Dof基因和種子的休眠與萌發相關(Jakoby等，2002; Gualberti等，2002)，TTG2(Garcia等，2005)，haiku Mutants(Garcia等，2003) · BIGPETALp, (Szecsi等，2006)，BIG BROTHER (Disch 等，2006)，DAl (Yunhai Li 等，2008)，DAGG3 (Yunhai Li 等，2012)。近來來在水稻中也相繼報道種子和器官發育相關的研究報道，(Lin等，1995;Huang等，1997;Redona 和 Mackill, 1998;Kubo 等，2001;Xing 等，2001;Thomson 等，2003;Yan等，2003; Li 等，2004 ；Rabiei 等，2004; Tian 等，2005; Yamagishi 等，2002; Xu 等，2002 ；Wan 等，2006，2008 ；Xie 等，2006; Yoon 等，2006; Tan 等，2000; Lei 等，2008 ；Bai 等，2010 ;Lin和Wu ;2003)，植物種子和器官發育的調控是一門新興的研究領域，目前對其調控機制的研究及認識較少，因此對轉錄因子的研究在理論上為進一步理解植物種子和器官發育調控的分子機理提供了新思路；在實踐上也將為作物高產育種提供理論基礎。VP16最早在動物病毒基因中發現，現已被廣泛應用到植物中，主要用于植物基因的轉錄調控的研究中。轉錄因子在體內的作用大體上可以分成兩種一種為轉錄增強子，另一種為轉錄抑制子。當轉錄因子和VP16功能域基序融合之后，它就會增強轉錄因子的功能，從而在轉基因植株中出現更明顯的表型變化。OVATE蛋白首先在番茄中被報道，編碼該蛋白的基因中某特定位點的點突變會導致其功能缺失，番茄形狀由圓形變為梨形，過量表達該基因的同時還會影響葉片和花的生長和發育。據推測，OVATE蛋白本身并不控制果實的形狀差異，它可能是一種植物生長抑制調節蛋白(Liu等，2002)。基因組學研究表明，該蛋白在水稻和擬南芥基因組中也存在(Ku等，2000，2001)，擬南芥中過量表達該基因，顯示出發育遲緩、葉片、花和角果的生長發育受到抑制，花瓣萼片呈現卵圓形以及短角果等表型變化(Hackbusch等，2005)。近年來，有關擬南芥OVATE蛋白家族中基因的研究相繼被報道，AtOFPl是一個轉錄因子抑制子，調控一種控制細胞延伸的赤霉素合成酶基因表達，它的過表達會減小細胞長度，從而使其下胚軸、子葉、葉片、花器官、角果表現均變短的表型變化，同時At0FP2與At0FP7也有相似的表型(wang等，2007)。然而卻未見OVATE蛋白在水稻中調控機制的相關的報道。

發明內容
本發明的目的是提供水稻轉錄因子0s05g39950基因的應用。為了實現本發明目的，本發明首先提供一種融合蛋白，該融合蛋白為(VP16)n-Linker-0s05g39950 ;其中，η為彡I的整數；Linker由I 20個柔性氨基酸串聯而成(例如，GGGGG, GPPPG,或Gatway載體重組位點編碼的氨基酸序列DPAFLYKVVPR) ；VP16為來自單純皰疫病毒(Herpes simplex virus)的VP16蛋白;0s05g39950為水稻轉錄因子0s05g39950，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明還提供一種用于擴增水稻轉錄因子0s05g39950基因的引物，其包括正向引物F :5’ -CAAAAAAGCAGGCTTCATGTTGTCCAGCGAACCAGG-3’ 和反向引物 R :5’ -CAAGAAAGCTGGGTCTGGCATGACGCCACAGG-3’。0s05g39950是首次報道從水稻中分離并獲得功能鑒定的OVATE·
蛋白家族基因。優選地，前述融合蛋白中η為4，即前述融合蛋白為(VP16)4-Linker-0s05g39950。其中，(VP16)4即VP64，是由4個VP16功能域基序融合在一起組成的增強子，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，或該序列經替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。本發明還提供編碼所述融合蛋白的基因，以及在嚴格條件下，可與該基因的核苷酸序列雜交的核苷酸序列；其中，所述嚴格條件為65°C，在O. I X SSPE或O. 1XSSC、0. 1%SDS的溶液中雜交并洗膜。本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的載體。所述載體為任一種可引導外源基因在宿主中表達的載體。優選地，所述載體為植物雙元表達載體(例如，PCAMBIA1301)。在將本發明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，可在其轉錄起始核苷酸前添加任一種強啟動子(例如，玉米強啟動子Ubiquitin)或誘導型啟動子。此外，在將本發明編碼所述融合蛋白的基因構建到植物表達載體中時，還可以使用增強子，且這些增強子區域必須與編碼序列的閱讀框相同，以確保整條序列的翻譯。 本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的轉基因細胞系。本發明還提供含有編碼所述融合蛋白的基因的工程菌。本發明還提供編碼所述融合蛋白的基因在改良水稻籽粒性狀(如改變水稻籽粒粒型、增加粒重)中的應用。本發明進一步提供水稻轉錄因子0s05g39950基因的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g39950基因的⑶S序列(完整翻譯區)構建到4個轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化植物，篩選并最終獲得轉基因植物。前述的應用，其是將水稻轉錄因子0s05g39950基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化水稻(例如，水稻品種‘kitaake’)，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀(如改變水稻籽粒粒型、增加粒重)。其中，水稻轉錄因子0s05g39950基因的CDS序列如SEQ ID No. 3所示，4個轉錄因子激活基序VP16的核苷酸序列如SEQ ID No. 4所示。
攜帶有編碼所述融合蛋白的基因的表達載體可通過使用Ti質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電穿孔等常規生物技術方法導入植物細胞中(Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII, Academy Press, New York,第 411-463 頁；Geiserson 和 Corey,1998, Plant Molecular Biology, 2nd Edition)。本發明首次利用轉錄因子激活基序VP64 (即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻轉錄因子0s05g39950基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物，如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，如水稻籽粒長度變短，而寬度、厚度和粒重下降。對于詳細闡明調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。


圖I為本發明實施例I中nVP64-bar_asRED載體圖譜。
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圖2為本發明實施例I中ubi:VP64-0s05g39950載體圖譜。圖3為本發明實施例3中PCR檢測轉基因陽性水稻株系的結果；其中，WT為野生型水稻 ‘kitaake’，UBI:0s05g39950 為 VP64_0s05g39950 轉基因水稻株系。圖4為本發明實施例3中Western Blot檢測轉基因陽性水稻株系的結果；其中，WT 為野生型水稻 ‘kitaake’，0s05g39950-0X-l 和 0s05g39950-0X_2 為 VP64_0s05g39950 轉基因水稻株系。圖5為本發明實施例4中VP64-0s05g39950轉基因水稻籽粒粒型分析結果；其中，WT為野生型水稻‘kitaake’，UBI:0s05g39950為VP64_0s05g39950轉基因水稻株系。圖6為本發明實施例4中VP64-0s05g39950轉基因水稻籽粒性狀的考種統計數據
分析結果。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。實施例I水稻轉錄因子0s05g39950基因的獲得及植物表達載體的構建登錄 http://rice. plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 網站，找到水稻轉錄因子0s05g39950基因，根據其序列設計PCR擴增引物0s05g39950-F :5’-CAAAAAAGCAGGCTTCATGTTGTCCAGCGAACCAGG-3’0s05g39950-R :5’-CAAGAAAGCTGGGTCTGGCATGACGCCACAGG-3’以水稻‘日本晴’葉片為材料，TRIzol法提取總RNA，反轉錄得cDNA，反應步驟如下(1)在冰上向不含核酸酶的PCR反應管中依次加入下列物質總RNA6 μ I (O. lng-5 μ g), Oligo (dT) 18 引物 1μ 1，不含核酸酶的 ddH20 5 μ 1，置于 PCR 儀中65°C反應5min ； (2)然后再加入下列物質5X反應緩沖液4 μ 1，RNase抑制劑I μ 1，IOmMdNTP2y I, M-Mμ IV反轉錄酶I μ 1，輕輕混勻，在PCR儀中45°C反應60min ; (3) PCR儀中，700C 5min，終止反應。以總cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增體系為反應緩沖液25 μ 1，dNTP 4μ l，ddH2017. 5μ l，Taq DNA 聚合酶 O. 5 μ 1，模板 I μ 1，上 / 下游引物各 O. 5 μ I。反應程序為熱啟動98°C 10s，57°C 5s, 72°C lmin，30個循環后，72°C延伸lOmin，最后25°C反應結束。獲得水稻轉錄因子0s05g39950基因的CDS序列，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示。按照PrimeSTAR聚合酶擴增體系和反應程序進行PCR。根據Gateway克隆技術的要求，此過程中包含兩輪PCR,第一輪PCR的引物用加部分adaptor attB接頭的引物，而第二輪的模板用第一輪的PCR產物，并且引物采用完整的adaptor attB引物。將PCR產物克隆到連接PDONR克隆載體上，經測序鑒定得到與目的基因完全相同的序列。通過LR反應將0s05g39950基因構建到植物表達載體nVP64-bar-asRED (圖I)上，獲得載體ubi:VP64-0s05g39950 (圖 2，載體全序列如 SEQ ID No. 6 所示)。其中，植物表達載體nVP64-bar_asRED的構建過 程為以雙元表達載體pCAMBIA1300左右邊界包含的序列為骨架序列，通過體外重組，將ubipromoter-VP64_Gateway 表達單兀、35S promoter-asRED 表達單兀和 35S promoter-bar 表達單元與之融合構建得到，載體nVP64-bar_asRED的全序列如SEQ ID No. 5所示。實施例2轉基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒之后接種到誘導培養基上進行誘導培養。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農桿菌介導法將ubi :0s05g39950-VP64轉入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和0. D.值為0. 7的農桿菌的AAM轉化液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置于共培養基上進行共培養，25°C暗培養3d后置于篩選培養基上培養約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養基上生根，待約7d長出發達根系后煉苗，并計算轉化所獲轉基因苗數。煉苗7d后轉移至大田生長。用Basta篩選轉基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta(l: 1000，v:v)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉基因水稻40株。其中，誘導培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。共培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L 2，4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調pH至5. 2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入AS (乙酰丁香酮)10(T200yg/mL。篩選培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調PH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術公司)。分化培養基配方為MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. 0mg/L Kinetin (激動素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。實施例3 0s05g39950_VP64轉基因水稻的鑒定為檢測0s05g39950基因的⑶S序列是否整合至水稻基因組DNA中，首先采用CTAB法分別提取野生型和轉基因水稻葉片總DNA，設計檢測引物序列，上游引物5’ -ATGGACGCGCTGGACGATTT-3’，下游引物5’ -TCACTTGTCATCGTCGTCCTTGTAG-3 '，進行PCR，擴增體系為反應緩沖液5 μ 1，dNTP I μ I, ddH20 2. 2 μ 1，Taq DNA聚合酶O. 2 μ 1，上下游引物各0.3“1，0嫩模板1“1.反應條件為熱啟動96°C 5min ；95°C 30s, 55°C 30s, 72°C2min，共32個循環；72°C延伸lOmin，最后25°C反應結束。鑒定轉基因植株，對擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結果表明，轉基因水稻均擴增出目的條帶，而野生型水稻中未擴增出目的條帶(圖3)，初步確定0s05g39950基因的⑶S序列已通過農桿菌介導的方法插入到水稻基因組中，PCR產物經測序后，測序結果如SEQ ID No. 3所示。由于過表達載體帶有FLAG標簽，在轉基因水稻中將與目的蛋白融合，因此利用該FLAG抗體可以鑒定轉基因水稻中目的基因的蛋白表達情況，經過SDS-PAGE蛋白電泳一免疫印記一免疫熒光反應，Western Blot鑒定結果表明轉基因植株存在目的蛋白，而野生型未雜出條帶(圖4)。具體的Western Blot實驗流程如下將適量樣品放入液氮冰凍后研磨成粉末，加入適量上樣緩沖液混勻，12000rpm離·當溴酚藍到達凝膠的底端即可停止電泳；電泳后采用半干轉移法轉膜，并用麗春紅染色液對膜進行染色，觀察轉膜效果；轉膜完畢后，將膜放入含5%的脫脂奶粉的PBST溶液中封閉室溫封閉60分鐘或4°C過夜；室溫下加入一抗(FLAG抗體，購自Abmart，貨號M20008L)孵育I小時或4°C孵育過夜，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；室溫下加入二抗(羊抗鼠，購自Abmart，貨號M21001S)孵育I小時，然后用PBST洗滌3次，每次5分鐘；在膜上加入底物，進行曝光。實施例4轉基因水稻表型分析和考種分析與野生型水稻‘kitaake’相比，VP64_0s05g39950轉基因水稻的籽粒明顯變短、變寬、變厚、粒重下降(圖5)。根據考種數據分析結果，可以明顯看出VP64-0s05g39950轉基因水稻種子的上述4個性狀較野生型差異顯著(圖6)。以上提供的實施例是將水稻轉錄因子0s05g39950基因的CDS序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化水稻品種‘kitaake’，從而改良水稻籽粒性狀，如水稻籽粒長度變短，粒重下降，而寬度、厚度增加。同樣地，將水稻轉錄因子0s05g39950基因的⑶S序列通過Gateway系統構建到I 3個或4個以上轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化水稻品種，也能夠達到改良水稻籽粒性狀的效果。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.一種融合蛋白，其特征在于，該融合蛋白為(VP16)n-Linker-0s05g39950 ； 其中，n為≥1的整數；Linker由廣20個柔性氨基酸串聯而成；VP16為來自單純皰疹病毒(Herpes simplex virus)的 VP16 蛋白;0s05g39950 為水稻轉錄因子 0s05g39950。
2.根據權利要求I所述的融合蛋白，其特征在于，n為4。
3.編碼權利要求I或2所述融合蛋白的基因。
4.含有權利要求3所述基因的載體。
5.含有權利要求3所述基因的轉基因細胞系。
6.含有權利要求3所述基因的工程菌。
7.權利要求3所述的基因在改良水稻籽粒性狀中的應用。
8.水稻轉錄因子0s06g08400基因在調控水稻籽粒性狀中的應用。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g39950基因的CDS序列構建到4個轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化植物，篩選并最終獲得轉基因植物。
10.根據權利要求8所述的應用，其特征在于，其是將水稻轉錄因子0s05g39950基因的⑶S序列通過Gateway系統構建到4個轉錄因子激活基序VP16的下游，轉化水稻，從而改良轉基因水稻籽粒的性狀。
全文摘要
本發明涉及水稻轉錄因子Os05g39950基因的應用，其是利用轉錄因子激活基序VP64(即4個轉錄因子激活基序VP16)與水稻轉錄因子Os05g39950基因融合構建得到組成型轉錄因子，并轉化到農作物如水稻中，從而改良水稻籽粒性狀，如水稻籽粒明顯變短、變寬、變厚、粒重下降。對于詳細闡明調控種子發育機理具有重要的理論價值，并且可以通過轉基因手段，改良水稻的粒型，因此在生產實踐中也具有重要意義。
文檔編號C12N1/15GK102786599SQ20121027251
公開日2012年11月21日 申請日期2012年8月1日 優先權日2012年8月1日
發明者于慧, 劉軍, 劉斌, 李宏宇, 林辰濤, 趙濤, 邊鳴鏑 申請人:中國農業科學院作物科學研究所