專利名稱：滇池金線鲃精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，屬于低溫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
Sinocyclocheilus grahami (Regan, 1904)又名漠池金線魚(yú)、波蘿魚(yú)、小洞魚(yú)，隸屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)金線把屬(SinocyclocheiIus)。滇池金線魚(yú)巴 是滇池流域的特有種，分布于滇池及其流域所在河流、溶洞、暗河之中。滇池金線鈀肉質(zhì)鮮美，系云南“四大名魚(yú)”之首，1989年，被列為國(guó)家II級(jí)保護(hù)動(dòng)物，在《中國(guó)瀕危動(dòng)物紅皮書(shū)(魚(yú)類)》中被列為瀕危等級(jí)，在中國(guó)物種紅色名錄中被列為VU等級(jí)。自上世紀(jì)50年代后期以來(lái)，由于外來(lái)種入侵、水體污染、生境喪失、過(guò)度捕撈等原因，滇池金線鈀在滇池湖體已經(jīng)消失，現(xiàn)僅存于入湖溪流及龍?zhí)吨小Ｈ舨患皶r(shí)采取有效拯救措施，以后將在自然界中將很難找到滇池金線鈀這一物種；盡管滇池金線鈀人工繁殖已成功，但由于養(yǎng)殖魚(yú)類本身的局限性，在人工繁殖中，容易造成雌雄性腺發(fā)育不同步；并且在長(zhǎng)期的塘養(yǎng)環(huán)境下，容易造成種質(zhì)退化，遺傳多樣性減少、生長(zhǎng)速度緩慢、品質(zhì)下降、對(duì)病害和環(huán)境脅迫的防御能力降低，病害發(fā)生日趨嚴(yán)重，因此對(duì)其進(jìn)行精子冷凍保存技術(shù)的研究對(duì)于滇池金線鈀優(yōu)良品種的種質(zhì)保存及遺傳多樣性保護(hù)具有重要意義。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明的相同報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種能夠簡(jiǎn)便、高效、長(zhǎng)期保存滇池金線鈀精子的超低溫冷凍及復(fù)蘇方法。本發(fā)明的滇池金線鈀精子的超低溫冷凍及復(fù)蘇方法，其具體步驟如下a.配子的采集采精方法為輕壓腹部法，選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的親魚(yú)原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚(yú)類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中；b.鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍；c.冷凍方法將精液與抗凍液按1:2的體積比稀釋后分裝，經(jīng)4°C平衡60 min,然后在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min后投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+7. 5%乙二醇；d.復(fù)蘇方法是將凍存管從液氮中取出后置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)20 S。使用時(shí)，將滇池金線鈀魚(yú)卵擠入容器中，按IO5:1的精卵數(shù)量比加入解凍后的精液，拌勻，再滴加0. 2 ml激活液，攪拌，使卵受精。本發(fā)明的各步驟中所用的百分比為體積百分比。
本發(fā)明具有成本低，操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后精子的活力較高，人工繁殖的滇池金線鈀魚(yú)的受精率和孵化率較高，能投入規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于開(kāi)展魚(yú)類資源恢復(fù)與重建也具有重要意義。
具體實(shí)施例方式發(fā)明人分別于2011年I月I月和2012年I月I月在中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所珍稀土著魚(yú)類保育研究基地，采用本發(fā)明方法超低溫冷凍了 80尾滇池金線鈀精液，經(jīng)檢測(cè)，解凍后精子活力平均為59. 3%。滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存方法的如下親魚(yú)的選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的原種或良種。配子的采集100ppm 的 MS-222 (Tricaine, CltlH15NO3S)麻醉 5 min,魚(yú)類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中。 鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍。冷凍方法將精液與抗凍液(D-15+7. 5%乙二醇)按1:2的體積比稀釋后分裝，經(jīng)4°C平衡60min，然后在液氮面上方6cm處平衡2min，液氮面上平衡2min后投入液氮中保存。復(fù)蘇方法將凍存管從液氮中取出后置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)20 S。凍精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力。2012年3月12日復(fù)蘇2011年2月21日超低溫冷凍保存的10尾滇池金線鈀精液，采用人工授精的方法，按IO5 1的精卵數(shù)量比例進(jìn)行人工授精，獲得受精卵48715粒，受精率平均為52. 9%，多細(xì)胞期、神經(jīng)胚期和體節(jié)期的胚胎存活率分別為90. 8%,66. 0%和46. 8%，孵化率為35. 3% ；2012年3月19日完成魚(yú)苗孵化，孵出魚(yú)苗9097尾。
權(quán)利要求
1.、一種滇池金線鈀精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，其特征在于該保存及復(fù)蘇方法的具體步驟如下 a.配子的采集采精方法為輕壓腹部法，選擇形態(tài)正常、生長(zhǎng)良好、無(wú)疾病、達(dá)到性成熟的親魚(yú)原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，魚(yú)類腹部用毛巾擦干，然后輕輕擠壓腹部，成熟的精液自然流出到1.5 mL離心管中； b.鮮精活力檢測(cè)先用移液器滴一滴水于載玻片上，對(duì)準(zhǔn)視野，然后用針尖挑取上述精液立即于顯微鏡下攪拌，觀察其活力，鮮精活力在85%以上的精液樣品用于精子冷凍； c.冷凍方法將精液與抗凍液按1:2的體積比稀釋后分裝，經(jīng)4°C平衡60min，然后在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min后投入液氮中保存；其中抗凍液為稀釋液D-15+7. 5%こニ醇； d.復(fù)蘇方法是將凍存管從液氮中取出后置于37°C水浴鍋中快速晃動(dòng)20S。
全文摘要
滇池金線鲃精子超低溫冷凍保存及復(fù)蘇方法，屬于低溫生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。方法為選擇性成熟的優(yōu)質(zhì)原種或良種，用100 ppm的MS-222麻醉5 min，擠壓擦干的腹部，成熟精液流入1.5 mL離心管，檢測(cè)鮮精活力，活力在85%以上的精液用于冷凍。將精液與抗凍液(D-15+7.5%乙二醇)按體積比12的比例稀釋，分裝，4℃平衡60 min，在液氮面上方6 cm處平衡2 min，液氮面上平衡2 min后投入液氮中保存。精子復(fù)蘇方法是在37℃水浴快速晃動(dòng)20 s解凍，將擠出的滇池金線鲃魚(yú)卵與解凍后的精液按1105的數(shù)量比混合使卵受精。本發(fā)明具有成本低，操作簡(jiǎn)便，保存時(shí)間長(zhǎng)，復(fù)蘇后精子的活力較高，人工繁殖的滇池金線鲃魚(yú)的受精率和孵化率較高，能投入規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)；對(duì)于開(kāi)展魚(yú)類資源恢復(fù)與重建也具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N5/076GK102763641SQ201210277918
公開(kāi)日2012年11月7日 申請(qǐng)日期2012年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月7日
發(fā)明者楊君興, 潘曉賦, 王曉愛(ài), 陳小勇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所