一種發酵產低溫脂肪酶的方法
【專利摘要】本發明提供了一種發酵產低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發菌種，采用優化的種子培養基、產酶培養基及發酵生產技術方法來制備低溫脂肪酶的，發酵液最高酶活可達6000U/L以上，所產低溫脂肪酶最適溫度為30℃，在0℃仍具有65％的相對酶活，可廣泛應用于洗滌劑、食品工業、造紙、醫藥、皮革、環境保護等領域，屬于生物【技術領域】。
【專利說明】ー種發酵產低溫脂肪酶的方法
【技術領域】
[0001]本發明提供的ー種發酵產低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發菌種，采用優化的種子培養基、產酶培養基及發酵生產技術方法來制備低溫脂肪酶的，發酵制備的低溫脂肪酶最高酶活可達6000U/L以上，所產低溫脂肪酶最適溫度為30°C，在(TC仍具有65%的相對酶活，可廣泛應用于洗滌劑、食品エ業、造紙、醫藥、皮革、環境修復等領域，屬于生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]脂肪酶(lipase, EC3.1.1.3)又稱甘油三酰酯甘油水解酶(triacylglycerolacylhyrolase),能在油-水界面上催化其水不溶性的天然底物甘油三酰酯水解為脂肪酸和甘油[I]。在微水環境下，脂肪酶具有獨特的性能，其催化反應具有可逆性，包括甘油酯及水不溶性酯類的水解、醇解、酸解以及酯化等反應。除了能分解脂肪外，脂肪酶還可催化其它酯水解的能力，因此，脂肪酶是生物技術中應用酶類的重要組成部分，是繼蛋白酶、糖化酶的第三大商業用酶，已被廣泛應用于洗滌劑、食品エ業、造紙、醫藥、皮革等方面。
[0003]脂肪酶按其作用pH的不同，可以分為酸性、中性、堿性脂肪酶；而按其作用溫度的高低則可以分為低溫脂肪酶(cold-active lipase)、中溫脂肪酶和高溫脂肪酶，低溫脂肪酶多為低溫微生物產生，此類菌生長條件相對苛刻，嚴重制約了低溫脂肪酶的發展，因而開發和研究的時間較短，但由于低溫脂肪酶在低溫環境下具有高催化活性而其活化能和反應最適溫度較低，有利于節約能源和防止產物結構破壞，對于環境保護和修復也有極大的意義，因為環境溫度多數在40°C以下，在某些領域中應用低溫脂肪酶有著中高溫脂肪酶不可比擬的優越性，低溫脂肪酶的研究開發及生產制備技術開始受到世界各國的重視，我們就是在這樣的形勢和思想指導下，研究出一種有效的制備低溫脂肪酶的方法。
【發明內容】
`[0004]本發明提供了ー種發酵產低溫脂肪酶的方法，一種優化的種子培養基配方和產酶培養基配方及發酵生產制備中的參數，所制備的低溫脂肪酶可廣泛應用于洗滌劑、食品エ業、造紙、醫藥、皮革、環境保護等領域。
[0005]本發明的技術方案:ー種發酵產低溫脂肪酶的方法，用我們自己篩選的野生菌株為出發菌種，經種子培養和產酶培養發酵制備低溫脂肪酶，エ藝為:
[0006](I)種子培養
[0007]種子培養基:蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ；
[0008]取250ml的三角瓶若干個，每個裝種子培養基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻；
[0009]在姆個裝種子培養基50ml的三角瓶中挑取一環菌接入，置于搖床培養，培養條件--溫度30°C，轉速200r/min，培養8小時即為發酵種子液；
[0010]⑵產酶培養
[0011]產酶培養基:牛肉膏40g/L，橄欖油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敵3ml/L ；
[0012]取產酶培養基4.5升加入到7升發酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻；
[0013]按10%的接種量，將450ml發酵種子液加入到含產酶培養基的發酵罐中，
[0014]設定發酵參數，，溫度30°C，pH 7.0，轉速 3501'/1^11，通氣量1.5，17111111/1，發酵35小時；
[0015](3)脂肪酶液制備
[0016]將發酵液用高速冷凍離心機在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液；
[0017](4)酶活力的測定
[0018]以對硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和0.2mL IOmmoI/L p-NPB組成的反應體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測吸光值，以Imin內催化產生I y mo I的對硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量為I個酶活力単位。
[0019]本發明的有益效果:
[0020]首先提供了ー種發酵產低溫脂肪酶的方法。鑒于低溫脂肪酶多為低溫微生物產生，此類菌生長條件相對苛刻，發酵生產制備低溫脂肪酶的方法較少，嚴重制約了低溫脂肪酶的發展，在世界各國開發和研究的時間也較短，但低溫脂肪酶在低溫環境下具有高催化活性而其活化能和反應最適溫度較低，有利于節約能源和防止產物結構破壞，對于環境保護和修復也有極大的意義，因為環境溫度多數在40°C以下，在某些領域中應用低溫脂肪酶有著中高溫脂肪酶不可比擬的優越性。本發明ー種發酵產低溫脂肪酶的方法與其它制備低溫脂肪酶的方法相比較，具有酶活力高、發酵時間短、操作簡單、成本低的特點，且所生產出來的低溫脂肪酶可廣泛使用于洗滌劑、食品エ業、造紙、醫藥、皮革、環境修復等領域，因此本發明ー種發酵產低溫脂肪酶的方法有廣泛的エ業使用價值和較顯著的經濟效益前景。
【具體實施方式】
[0021]實施例1
[0022]1、從斜面上挑取單菌落，劃線于LB平板培養基(蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，瓊脂20g/L，pH 7.2)中，將平板置于30°C培養箱培養24h。
[0023]2、從平板上括取I環菌種接種到含50ml種子培養基(蛋白胨10g/L，氯化鈉IOg/し酵母浸出汁5g/L，pH 7.0)的250ml的三角瓶中，共接種10瓶，置于搖床培養，培養條件:溫度30°C，轉速200r/min，培養8小時即為發酵種子液。
[0024]3、按10%的接種量，將發酵種子液450ml加入到含4.5升產酶培養基(牛肉膏40g/L，橄欖油 10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始 PH = 7.0，泡敵 3ml/L)的 7 升發酵罐中，設定發酵參數，，溫度30°C，pH 7.0，轉速350r/min，通氣量1.5L/min/L，發酵35小時取出；
[0025]4、脂肪酶液制備
[0026]將發酵液用高速冷凍離心機在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液；
[0027]5、酶活力的測定
[0028]以對硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和0.2mL I Ommol/L p-NPB組成的反應體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測吸光值，以Imin內催化產生I y mo I的對硝基酚(e = 1.86 X IO4CnT1 XiT1)所需的酶量為I個酶活力単位，測的 酶活力為6200U/L。
【權利要求】
1.ー種發酵產低溫脂肪酶的方法，是以自己篩選的野生菌株為出發菌種，采用改進的種子培養基和產酶培養基及方法發酵制備低溫脂肪酶，エ藝為: (1)種子培養 種子培養基:蛋白胨10g/L，氯化鈉10g/L，酵母浸出汁5g/L，pH 7.0 ； 取250ml的三角瓶若干個，每個裝種子培養基50ml，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 在姆個裝種子培養基50ml的三角瓶中挑取一環菌接入,置于搖床培養,培養條件:溫度30°C，轉速200r/min，培養8小時即為發酵種子液； (2)產酶培養 產酶培養基:牛肉膏40g/L，橄欖油10ml/L, Triton X_1005ml/L，初始PH = 7.0，泡敵3ml/L ； 取產酶培養基4.5升加入到7升發酵罐中，121°C滅菌40分鐘，冷卻； 按10%的接種量，將450ml發酵種子液加入到含產酶培養基的發酵罐中，設定發酵參數，，溫度 30°C，pH 7.0，轉速 350r/min，通氣量 1.5，L/min/L，發酵 35 小時； (3)脂肪酶液制備 將發酵液用高速冷凍離心機在4°C 10，800g離心15min的條件下離心，上清液即為脂肪酶粗酶液； (4)酶活力的測定 以對硝基苯丁酸酯p-NPB為底物，將pH 9.0的3.7mL 0.lmol/L Tris-HCl緩沖液和.0.2mL IOmmoI/L p_NPB組成的反應體系，30°C保溫15min后加入0.1mL酶液，在405nm下測吸光值，以Imin內催化產生I u mo I的對硝基酚，系數e = 1.86 X IO4CnT1 X M—1，所需的酶量為I個酶活力単位。
【文檔編號】C12N9/20GK103571808SQ201210278064
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年8月7日 優先權日:2012年8月7日
【發明者】李洪兵, 張峰, 張明 申請人:湖南鴻鷹生物科技有限公司