專利名稱：一種高f值金槍魚寡肽制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于寡肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高F值金槍魚寡肽制備方法。
背景技術(shù)：
金槍魚(Tunas)又叫鮪魚、吞拿魚，屬S盧形目(Perciformes)鯖科(Scombridae),作為一種深海魚類，金槍魚不僅肉味鮮美，而且營養(yǎng)價值非常高，富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和維生素，以“純天然、營養(yǎng)價值高”而享譽(yù)國際市場。金槍魚的主要加工種類有藍(lán)鰭金槍魚、長鰭金槍魚、黃鰭金槍魚和大眼金槍魚。浙江省是我國金槍魚加工中心，擁有全國最大的金槍魚加工基地，金槍魚除了鮮銷外，其加工產(chǎn)品的附加值非常高，一般經(jīng)過冷凍處理用于制作壽司及罐裝食品。金槍魚在加工過程中產(chǎn)生大量碎肉，這些碎肉同金槍魚的魚肉主體一樣營養(yǎng)豐富，目前尚無有效的工業(yè)化深加工方法。 高F值寡肽是由3 7個氨基酸殘基所組成的混合小肽混合物，F(xiàn)值是指混合物中支鏈氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸，簡稱BCAA)和芳香族氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸，簡稱AAA)的摩爾比值，是為了紀(jì)念德國著名學(xué)者Fischer在上個世紀(jì)70年代提出的“偽神經(jīng)傳遞質(zhì)假說”而命名的。小肽分子與游離氨基酸相比具有滲透壓低、抗原性低等優(yōu)點，所以更容易被吸收。研究表明高F值寡肽能夠改進(jìn)肝臟疾病(肝硬化、肝性腦病)，常被用于輔助治療肝性腦病以及改善手術(shù)后和臥床病人的蛋白質(zhì)營養(yǎng)狀況，另外，高F值寡肽還具有抗疲勞和醒酒等多種生物活性。但是，相對于水產(chǎn)蛋白及加工副產(chǎn)物蛋白水解液的抗氧化肽和ACE降壓肽研究而言，水產(chǎn)蛋白高F值寡肽的研究還較少，而以金槍魚碎肉為原料制備高F值寡肽的研究還未見報道。目前高F值寡肽制備主要采用二步酶解法，第一步酶切在原料蛋白肽鏈的芳香族氨基酸處切割使芳香族氨基酸暴露出來；第二步酶切將芳香族氨基酸切掉，釋放到水解液中為游離型，使寡肽剩下含量高的支鏈氨基酸。所以，酶解法制備高F值寡肽關(guān)鍵點之一是要選擇特異性蛋白酶，提高酶解效率，釋放芳香族氨基酸。獲得高F值寡肽關(guān)鍵點之二是要最大限度地去除蛋白水解液中芳香族氨基酸，提高支鏈氨基酸與芳香族氨基酸的比值(F值>20)。蛋白質(zhì)水解液中的芳香族氨基酸去除方法很多，如離子交換法、凝膠過濾法、膜分離法、活性炭吸附色譜法等，其中活性炭對苯丙氨酸、酪氨酸有選擇性吸附特性，利用這一特性，可將寡肽和芳香族氨基酸分離，而且從工業(yè)應(yīng)用角度考慮，活性炭吸附法更易推廣使用，適合大規(guī)模生產(chǎn)。現(xiàn)有的活性炭吸附法都采用活性炭靜態(tài)吸附法，在酶解液中直接加入活性炭進(jìn)行吸附，這種方法洗脫效果有限，酶解液中有較多的活性炭殘留，吸附使用過的活性炭再生困難。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種高F值金槍魚寡肽的制備方法，具有良好的酶解效率，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。本發(fā)明的具體技術(shù)方案是
一種高F值金槍魚寡肽的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟
預(yù)處理稱取解凍后的金槍魚碎肉，采用勻漿機(jī)勻漿兩分鐘，直到無大塊魚肉為止，然后按一定比例w/v=l:7加入蒸餾水，放在反應(yīng)器中，35° C保溫；
固定化酶制備
稱取一定量的殼聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器將制備好的殼聚糖凝膠按1:3 90%乙醇溶液中，凝結(jié)2h,加入5%戍二醒,開動磁力攪拌器，在150rpm轉(zhuǎn)速下振蕩Ih,用去離子水充分洗滌，至無戊二醛殘液，得到交聯(lián)好的載體；
在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由PH 3.0的乳酸-乳酸鈉配置的胃蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化胃蛋白酶；
在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由蒸餾水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化木瓜蛋白酶；
將固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶裝配于一個兩層筒狀酶反應(yīng)器中，該酶反應(yīng)器由上下兩層旋轉(zhuǎn)筐連接而成，將固定化胃蛋白酶裝配在上面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中，將固定好的木瓜蛋白酶裝在下面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中；
酶解讓反應(yīng)液依次流過這兩個旋轉(zhuǎn)筐，所述旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)部設(shè)有主軸帶動葉輪轉(zhuǎn)動，使酶解液與固定化酶發(fā)生相對運(yùn)動，利于固定化酶與酶解液充分接觸；
其中，第一步酶解條件如下調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH至2. 0，放入上層旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)進(jìn)行酶解，酶解溫度為40°C，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液保持在pH2. 0下進(jìn)行酶解，酶解時間為4小時；
第二步酶解條件如下打開上下層旋轉(zhuǎn)筐之間的閥門，讓第一步酶解液流入下層旋轉(zhuǎn)筐中，調(diào)節(jié)第一步酶解液pH至6. 5，酶解溫度55°C，酶解時間3小時，每隔半小時調(diào)節(jié)一次PH值，讓酶解液始終保持在pH6. 5下進(jìn)行酶解；酶解完成后酶解液調(diào)節(jié)pH至中性，冷卻至室溫，從下層旋轉(zhuǎn)筐取出后4500r/min離心15min,提取上清液備用；
微濾第二步酶解得到的上清液經(jīng)5000Da微濾膜微濾，壓力為30psi，溫度35° C，除去未水解的大分子蛋白質(zhì)和多肽；
活性炭動態(tài)吸附將活性炭顆粒裝載于玻璃吸附柱中制備而成的活性炭吸附柱對微濾后的濾液進(jìn)行動態(tài)吸附，其中活性炭顆粒由粒度200目、比表面積1200 Hf的活性炭一和粒度200目，比表面積1300 In2的活性炭二按質(zhì)量比1:2裝填，活性炭顆粒與物料比為1:10，調(diào)節(jié)微濾液的PH2. (T4. 0，以0. 5ml/min流速進(jìn)行層析，吸附溫度為40°C，動態(tài)吸附3小時，以3000r/min離心lOmin，去上清液即為高F值金槍魚寡肽溶液。所述活性炭吸附柱包含用于吸附酶解液中芳香族氨基酸的豎向流體通道和用于活性炭吸附柱洗脫的橫向流體通道，兩個流體通道均設(shè)有獨(dú)立流體泵。所述活性炭吸附柱的底部設(shè)有加熱部件。本發(fā)明的另一個方案，所述活性炭動態(tài)吸附步驟，將活性炭裝入吸附反應(yīng)器，該吸附反應(yīng)器包含一個旋轉(zhuǎn)夾層筒，旋轉(zhuǎn)夾層筒夾層為解吸管路，旋轉(zhuǎn)夾層筒的內(nèi)側(cè)管路為吸附管路，
吸附時，打開泵一，設(shè)定泵一壓力為0. 04Mpa，吸附溫度40°C，酶解液進(jìn)入媳婦管路，開動葉片，使其與活性炭充分接觸，同時打開左側(cè)泵二，設(shè)定壓力為o. 02Mpa，設(shè)定解吸溫度15°C，讓解吸液流入解析管路中，由于壓力較小，不會進(jìn)入到酶解液中，解吸液會將活性炭吸附好的芳香族氨基酸解吸下來，打開右側(cè)泵三，設(shè)定壓力為-lOOOPa，使解吸液流出，動態(tài)吸附3小時后，以3000r/min離心lOmin，取上清液即為高F值金槍魚寡肽溶液。活性炭顆粒裝進(jìn)吸附柱的夾層中，吸附和解吸同時進(jìn)行，互不干擾，通過增加吸附泵的壓力，讓酶解液進(jìn)入裝有活性炭的夾層中，再降低解吸泵壓力，讓在活性炭夾層中的洗脫液流出)
由于酶解需要的PH值環(huán)境各不相同，現(xiàn)有技術(shù)中往往僅僅進(jìn)行一次pH的調(diào)整，這種做法會引起酶解效率的下降，因為隨著酶解的持續(xù)進(jìn)行，溶液環(huán)境中的PH值也在不斷的變化，因此，本發(fā)明通過多次調(diào)整溶液PH值，確保酶解在最合適的條件下進(jìn)行，提高了酶解效 率。


圖I為本發(fā)明高F值金槍魚寡肽的制備方法流程圖。圖2為本發(fā)明制備方法所用酶反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為本發(fā)明所用吸附反應(yīng)器結(jié)構(gòu)示意圖。其中，上層旋轉(zhuǎn)筐I，下層旋轉(zhuǎn)筐2，閥門3，同心轉(zhuǎn)軸4，葉片5，旋轉(zhuǎn)夾層筒6，泵一7，泵二 8，泵三9，轉(zhuǎn)軸10，葉片11。
具體實施例方式實施例一
高F值金槍魚寡肽的制備方法包括以下步驟
預(yù)處理稱取50g解凍后的金槍魚碎肉，采用勻漿機(jī)勻漿兩分鐘，直到無大塊魚肉為止，然后按w/v=l 7加入蒸餾水，放在反應(yīng)器中，35° C保溫；
第一步酶解用6mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2.0，按照800U/g加入胃蛋白酶，放置于35° C振蕩水浴箱中水浴4h，每隔半小時用6mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液始終在PH2.0下進(jìn)行酶解；調(diào)節(jié)反應(yīng)器溫度為95° C滅酶15min，調(diào)節(jié)pH至中性，冷卻至室溫，然后抽濾，濾液備用；
第二步酶解取第一步酶解的濾液按照E/S=l%加入肌動蛋白酶，用2mol/L HCL和NaOH調(diào)節(jié)濾液pH至6. 5，放置于37° C振蕩水浴箱中水浴3h，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液始終在PH6. 5下進(jìn)行酶解；酶解完成后95° C滅酶15min，調(diào)節(jié)pH至中性，冷卻至室溫，4500r/min離心15min,上清液備用；
微濾第二步酶解得到的上清液經(jīng)5000Da微濾膜微濾，壓力為30psi，溫度35° C，除去未水解的大分子蛋白質(zhì)和多肽，
活性炭動態(tài)吸附將活性炭裝載于玻璃吸附柱中制備而成的活性炭吸附柱對微濾后的濾液進(jìn)行動態(tài)吸附。木質(zhì)顆粒活性炭(粒度200目，比表面積1200 m2)和木質(zhì)顆粒活性炭(粒度200目，比表面積1300 m2)按質(zhì)量比1:2裝填，活性炭與物料比1:10，吸附溫度為40°C，調(diào)節(jié)微濾液PH 2. 0-4. 0，以0. 5ml/min流速上層析柱，當(dāng)?shù)竭_(dá)80ml時，以同樣速度上洗脫液，一般吸附時PH變化不大，如有變化，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH，直到穩(wěn)定為止，動態(tài)洗脫3h, 3000 r/min離心10 min,取上清液，OD22(lnm/OD26(lnm達(dá)到最大值，即高F值金槍魚寡肽溶液。活性炭再生用0. 8mol/L的氨水和0. 8mol/L的無水乙醇等體積比混合作為洗脫液，對動態(tài)吸附飽和的活性炭吸附柱進(jìn)行洗脫。下表為不同濃度洗脫液洗脫效果表。實施例二
與實施例一不同的是，本實施例采用固定化酶反應(yīng)器。固定化酶制備
稱取一定量的殼聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器將制備好的殼聚糖凝膠 按1:3 90%乙醇溶液中，凝結(jié)2h，加入5%戊二醛，開動磁力攪拌器，在150rpm轉(zhuǎn)速下振蕩 lh，用去離子水充分洗滌，至無戊二醛殘液。在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由pH=3. 0的乳酸-乳酸鈉配置的胃蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化酶。在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由蒸餾水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化酶。第一步酶解調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH至2.0，按照800U/g加入固定化胃蛋白酶，放置于40° C振蕩水浴箱中水浴4h，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液始終在pH2. 0下進(jìn)行酶解。第二步酶解打開閥門，讓第一步酶解液流入下面的酶解筒中，按照E/S=l%加入固定化木瓜蛋白酶，調(diào)節(jié)濾液PH至6.5，放置于55° C振蕩水浴箱中水浴3h，每隔半小時調(diào)節(jié)一次PH值，讓酶解液始終在pH6. 5下進(jìn)行酶解；酶解完成后調(diào)節(jié)pH至中性，冷卻至室溫，4500r/min離心15min,提取上清液備用；
將固定好的胃蛋白酶酶裝在上面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中，將固定好的木瓜蛋白酶裝在下面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中，讓酶解液依次流過這兩個旋轉(zhuǎn)筐中，此設(shè)計的關(guān)鍵在于旋轉(zhuǎn)筐，讓筐內(nèi)固定化酶旋轉(zhuǎn)起來，而其內(nèi)部由主軸帶動一個葉輪轉(zhuǎn)動，由于受到離心力和攪動力的雙重作用，使酶解液與固定化酶發(fā)生相對運(yùn)動，利于固定化酶與酶解液充分接觸，酶解完全。采用酶反應(yīng)器的優(yōu)點如下
I、相比于那種靜態(tài)的插入酶板，優(yōu)點在于受到離心力和攪動力的雙重作用，使酶解液與固定化酶發(fā)生相對運(yùn)動，利于固定化酶與酶解液充分接觸，酶解效果明顯好于靜態(tài)插入酶板的方法，水解度多出15%，蛋白轉(zhuǎn)化率也明顯增強(qiáng)。2、與非固定化酶解相比，縮短了酶解時間，提高了生產(chǎn)效率。3、上面酶解好后，打開閥門，酶解液便可流入第二個旋轉(zhuǎn)筐中，這時，上面的旋轉(zhuǎn)框就可以繼續(xù)酶解。4、兩個旋轉(zhuǎn)框同時工作，互不影響。活性炭動態(tài)吸附將活性炭裝載于玻璃吸附柱中制備而成的活性炭吸附柱對微濾后的濾液進(jìn)行動態(tài)吸附。木質(zhì)顆粒活性炭(粒度200目，比表面積1200 Hf)和木質(zhì)顆粒活性炭(粒度200目，比表面積1300 m2)按質(zhì)量比1:2裝填，活性炭與物料比1:10，吸附溫度為40°C，調(diào)節(jié)微濾液pH 2. 0-4. 0，以0. 5ml/min流速上層析柱，當(dāng)?shù)竭_(dá)80ml時，以同樣速度上洗脫液，一般吸附時PH變化不大，如有變化，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH，直到穩(wěn)定為止，動態(tài)洗脫3h, 3000 r/min離心10 min,取上清液，0D22(lnm/0D26(lnm達(dá)到最大值，即高F值金槍魚寡肽溶液。實施例三
與實施例二不同的是，本實施例采用吸附反應(yīng)器替代活性炭吸附柱。將活性炭裝入旋轉(zhuǎn)夾層中，吸附時，打開泵一，設(shè)定壓力為0.04Mpa，吸附溫度400C，酶解液進(jìn)入活性炭柱中，開動葉片，使其與活性炭充分接觸，同時打開左側(cè)泵二，設(shè)定 壓力為0. 02Mpa,設(shè)定解吸溫度15°C，讓解吸液流入旋轉(zhuǎn)夾層中，由于壓力較小，不會進(jìn)入到酶解液中，解吸液會將活性炭吸附好的芳香族氨基酸解吸下來，打開右側(cè)泵三，設(shè)定壓力為-lOOOPa，使解吸液流出。吸附管路和解析管路相對獨(dú)立。
權(quán)利要求
1.一種高F值金槍魚寡肽的制備方法，其特征在于該制備方法包括以下步驟 預(yù)處理稱取解凍后的金槍魚碎肉，采用勻漿機(jī)勻漿兩分鐘，直到無大塊魚肉為止，然后按一定比例w/v=l:7加入蒸餾水，放在反應(yīng)器中，35° C保溫； 固定化酶制備 稱取一定量的殼聚糖，用2%乙酸溶液至完全溶解，用注射器將制備好的殼聚糖凝膠按1:3 90%乙醇溶液中，凝結(jié)2h,加入5%戍二醒,開動磁力攪拌器，在150rpm轉(zhuǎn)速下振蕩Ih,用去離子水充分洗滌，至無戊二醛殘液，得到交聯(lián)好的載體； 在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由PH 3.0的乳酸-乳酸鈉配置的胃蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化胃蛋白酶； 在交聯(lián)好的載體中，加入一定量由蒸餾水配制的木瓜蛋白酶溶液，于4°C冰箱中交聯(lián)10h，用蒸餾水洗滌，布氏漏斗抽濾得到固定化木瓜蛋白酶； 將固定化胃蛋白酶和固定化木瓜蛋白酶裝配于一個兩層筒狀酶反應(yīng)器中，該酶反應(yīng)器由上下兩層旋轉(zhuǎn)筐連接而成，將固定化胃蛋白酶裝配在上面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中，將固定好的木瓜蛋白酶裝在下面一個旋轉(zhuǎn)筐夾層中； 酶解讓反應(yīng)液依次流過這兩個旋轉(zhuǎn)筐，所述旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)部設(shè)有主軸帶動葉輪轉(zhuǎn)動，使酶解液與固定化酶發(fā)生相對運(yùn)動，利于固定化酶與酶解液充分接觸； 其中，第一步酶解條件如下調(diào)節(jié)反應(yīng)液PH至2. 0，放入上層旋轉(zhuǎn)筐內(nèi)進(jìn)行酶解，酶解溫度為40°C，每隔半小時調(diào)節(jié)一次pH值，讓酶解液保持在pH2. 0下進(jìn)行酶解，酶解時間為4小時； 第二步酶解條件如下打開上下層旋轉(zhuǎn)筐之間的閥門，讓第一步酶解液流入下層旋轉(zhuǎn)筐中，調(diào)節(jié)第一步酶解液pH至6. 5，酶解溫度55°C，酶解時間3小時，每隔半小時調(diào)節(jié)一次PH值，讓酶解液始終保持在pH6. 5下進(jìn)行酶解；酶解完成后酶解液調(diào)節(jié)pH至中性，冷卻至室溫，從下層旋轉(zhuǎn)筐取出后4500r/min離心15min,提取上清液備用； 微濾第二步酶解得到的上清液經(jīng)5000Da微濾膜微濾，壓力為30psi，溫度35° C，除去未水解的大分子蛋白質(zhì)和多肽； 活性炭動態(tài)吸附將活性炭顆粒裝載于玻璃吸附柱中制備而成的活性炭吸附柱對微濾后的濾液進(jìn)行動態(tài)吸附，其中活性炭顆粒由粒度200目、比表面積1200 Hf的活性炭一和粒度200目，比表面積1300 In2的活性炭二按質(zhì)量比1:2裝填，活性炭顆粒與物料比為1:10，調(diào)節(jié)微濾液的PH2. (T4. 0，以0. 5ml/min流速進(jìn)行層析，吸附溫度為40°C，動態(tài)吸附3小時，以3000r/min離心lOmin，去上清液即為高F值金槍魚寡肽溶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高F值金槍魚寡肽的制備方法，其特征在于所述活性炭吸附柱包含用于吸附酶解液中芳香族氨基酸的豎向流體通道和用于活性炭吸附柱洗脫的橫向流體通道，兩個流體通道均設(shè)有獨(dú)立流體泵。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高F值金槍魚寡肽的制備方法，其特征在于所述活性炭吸附柱的底部設(shè)有加熱部件。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的高F值金槍魚寡肽的制備方法，其特征在于所述活性炭動態(tài)吸附步驟，將活性炭裝入吸附反應(yīng)器，該吸附反應(yīng)器包含一個旋轉(zhuǎn)夾層筒，旋轉(zhuǎn)夾層筒夾層為解吸管路，旋轉(zhuǎn)夾層筒的內(nèi)側(cè)管路為吸附管路， 吸附時，打開泵一，設(shè)定泵一壓力為0. 04Mpa,吸附溫度40°C，酶解液進(jìn)入媳婦管路，開動葉片，使其與活性炭充分接觸，同時打開左側(cè)泵二，設(shè)定壓力為o. 02Mpa，設(shè)定解吸溫度 15°C，讓解吸液流入解析管路中，由于壓力較小，不會進(jìn)入到酶解液中，解吸液會將活性炭吸附好的芳香族氨基酸解吸下來，打開右側(cè)泵三，設(shè)定壓力為-lOOOPa，使解吸液流出，動態(tài)吸附3小時后，以3000r/min離心lOmin，取上清液即為高F值金槍魚寡肽溶液。
全文摘要
本發(fā)明屬于寡肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高F值金槍魚寡肽制備方法。本發(fā)明采用固定化酶解方法和活性炭動態(tài)吸附法，具有良好的酶解效率，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號C12P21/06GK102776262SQ20121028051
公開日2012年11月14日 申請日期2012年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月8日
發(fā)明者宋茹, 杜帥, 羅紅宇 申請人:浙江海洋學(xué)院