專利名稱：一種重組大腸桿菌及其用于制備蘆薈大黃素的方法
技術領域：
本發明涉及一種重組大腸桿菌及其用于制備蘆薈大黃素的方法，屬生物技術領域。
背景技術：
蘆薈大黃素(Aloe-emodin)，又稱蘆薈瀉素，化學名稱為1，8_二羥基_3_羥甲基蒽醌，是重要的蒽醌類物質，主要存在于蘆薈葉的表層中，具有抗腫瘤、抗菌抗病毒、抗氧化等一系列生物活性，因而在醫藥、保健食品、化妝品、日用洗滌用品等行業，獲得廣泛應用。
蘆薈大黃素分子結構如通式(I)所示，蘆薈苷的分子結構示于通式(2)，從通式
(I)和通式(2)的分子結構式可以看出，蘆薈大黃素蒽醌環ClO位上的羰基被葡萄糖取代后即構成了蘆薈苷，蘆薈苷是蘆薈大黃素的糖苷衍生物。
OH O OH
OH O OH
ini
OOH OH
Cl)(2)在蘆薈中，蘆薈苷含量可達到干重的百分之十幾甚至更高，相當于蘆薈大黃素含量的十幾倍甚至上百倍，蘆薈苷的價格也遠低于蘆薈大黃素，因此，以蘆薈苷為起始原料制備蘆薈大黃素具有現實意義。多年來很多學者相繼發表了涉及以蘆薈苷為起始原料，經過水解氧化反應，得到蘆薈大黃素的相關技術報道和專利，其中比較典型的方法有(I)張仰明等人(CN200610028926. 7)以氯化鐵為氧化劑，在酸性條件下，將蘆薈苷氧化得到蘆薈大黃素。雖然產率較高，工業化操作簡單易行，但是產生的廢水中含有大量鐵離子，可能會造成對環境的鐵離子污染和產品中的鐵殘留。(2)中國專利申請號200580038713. 6公開了瑞士梅迪多姆實驗室股份有限公司S ·卡里諾等人提出的一種制備蘆薈大黃素的方法，即在強酸催化下，以二元醇或三元醇為溶劑，較高溫度、較高壓力下用含氧氣體氧化蘆薈苷得到蘆薈大黃素。該方法較高效地制備了蘆薈大黃素，但存在的最大問題在于反應過程需要在較高溫度和較高壓力的條件下使用含氧氣體完成，對管道設備的要求較高，在實際生產中存在不安全因素。此外，成本也較高。(3)蘇為科(CN101508637B)公開了另一種蘆薈大黃素的制備方法，即以過硫酸鹽為氧化劑，氧化蘆薈苷制備蘆薈大黃素。將蘆薈苷和過硫酸鹽氧化劑按一定比例加入到反應器中，加入水作為反應介質，在一定的溫度條件下攪拌反應，即可完成蘆薈苷向蘆薈大黃素的轉變，轉化率較高。該方法工藝簡單，轉化率較高，其不足之處在于加入大量過硫酸鹽強氧化劑，產生大量活性氧，易斷裂蘆薈大黃素蒽醌環，降低收率；反應溫度較高；需要以純蘆薈苷為原料,也會增加生產成本。以上幾種化學合成方法需使用強酸或較高溫度或者氧氣，需要特殊設備或者加入大量過硫酸鹽強氧化劑。總之，反應條件不溫和，對反應設備要求較高，而且能耗相對也較高，增加廢水量不利于環境保護，而且反應沒有選擇性，容易產生各種副產物，增加產品分離提取的難度和經濟成本，同時影響最終產品的純度和應用效果。

發明內容
本發明提供了一種能夠生物轉化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，已于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號、中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6114，其分類學命名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本發明的目的在于公開一種使用重組大腸桿菌培養液制備蘆薈大黃素的方法，利·用微生物產生的酶作為催化劑，生物轉化蘆薈苷制備蘆薈大黃素，具有反應條件溫和，副產物少，無需特殊設備，能耗低，對環境友好等特點，以期克服現有技術存在的上述缺陷。為達到上述目的，本發明采用的技術方案是一種使用重組大腸桿菌制備蘆薈大黃素的方法，包括發酵培養重組大腸桿菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，和從反應產物中純化蘆薈大黃素，其特征在于還包括酶促水解步驟將培養后的大腸桿菌發酵液過冷凍離心，獲得的上清液作為酶源，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為O. 05 7. 5g/L，酶的加入量為20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸鹽緩沖液中進行水解反應，反應溫度為20 50°C，反應時間為2 24小時。所述酶液是將重組大腸桿菌發酵液(含菌體)經4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。所述酶活測定方法是將5ml酶液、5ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg蘆薈苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應20min，用HPLC法檢測蘆薈大黃素的含量。酶活單位(U)的定義在30°C、pH7. 5條件下，每小時酶促水解蘆薈苷產生I微摩爾蘆薈大黃素所需的酶量。水解反應的pH優先7 8。水解反應的溫度優先25 40C。所說的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl0發酵培養大腸桿菌菌種Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，依次包括下列步驟(I)平板培養將甘油保藏菌種在室溫自然融化，接種到平板培養基上，25 40°C恒溫培養I 2天；(2)種子培養搖瓶裝液量10 30% (v/v)，培養溫度25 40°C，搖床轉速60 300rpm,恒溫振蕩培養I 4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發酵培養搖瓶裝液量10 30% (v/v)，接種量2 10% (v/v)，培養溫度20 50°C，搖床轉速60 300rpm，恒溫振蕩培養5 24h。
所使用的平板培養基、種子培養基和發酵培養基均為LB培養基。種子培養基和發酵培養基均為LB液體培養基，配方為蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7. 5,加去離子水至1L, 121°C滅菌20min。平板培養基為LB固體培養基，在LB液體培養基基礎上添加2. 0%瓊脂粉，121°C滅菌20min后得到。所述從反應產物中純化蘆薈大黃素的方法是指，在酶促水解反應的混合液中，力口入600mL甲苯，萃取分液3次，合并萃取液，于60°C真空旋轉蒸發濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱中，在4°C下保持I小時，再在-10°C下保持2小時；抽濾，洗滌結晶兩次，60°C真空干燥。，本發明的積極效果是反應條件溫和，副產物較少，提取純化方便；不需要特殊設備，能耗低，對環境友好等特點，轉化率可達到65 %以上，所得蘆薈大黃素純度大于98 %。 利用微生物產生的酶作為催化劑，在溫和條件下催化水解廉價易得的蘆薈苷，制備應用價值很高的稀有碳糖苷元——蘆薈大黃素，市場應用前景寬廣。生物材料樣品保藏與生物材料存活證明
一種能夠生物轉化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，其分類學命名為大腸埃希氏菌Escherichia coli,該菌株于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號、中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6114。


圖I為本發明中蘆薈大黃素的質譜圖；圖2為本發明中蘆薈大黃素的核磁共振譜圖。
具體實施例方式下面將通過實施例對本發明作進一步的闡述，其目的是為更好理解本發明的內容。因此，所舉之例并不限制本發明的保護范圍。本發明提供了一種能夠生物轉化蘆薈苷生成蘆薈大黃素的重組大腸桿菌，已于2012年5月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號、中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No. 6114，其分類學命名為大腸埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本發明公開了一種使用重組大腸桿菌培養液生物轉化蘆薈苷制備蘆薈大黃素的方法，包括發酵培養大腸桿菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3) -pET28a (+)，和從反應產物中提取純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟。菌種篩選將vector pET28a(+) (NcoI&EcoRI)載體直接轉入 Escherichia coliBL2ItrxB(DE3)菌株，得到帶卡那抗性的重組大腸桿菌E. coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)。將該菌接種到平板分離培養基上，37°C培養24h，再從平板中挑取單菌落培養。重復60個周期，得到能夠代謝蘆薈苷制備蘆薈大黃素的重組菌株。平板分離培養基配方蛋白胨1%，蘆薈苷0.4%，NaClO. 5%，瓊脂2%。制備方法用INNaOH調節pH至7. 5，121°C滅菌20min。高壓滅菌后待降溫到55°C左右，加入蘆薈苷，按照0. 5ml/L加入卡那霉素，搖勻后倒平板。發酵培養大腸桿菌Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a (+),依次包括下列步驟(I)平板培養將甘油保藏菌室溫融化，接種到平板培養基上，25 40°C培養I 2天；(2)種子培養搖瓶裝液量10 30% (v/v)，培養溫度25 40°C，搖床轉速60 300rpm,恒溫振蕩培養I 4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發酵培養搖瓶裝液量10 30% (v/v)，接種量2 10% (v/v)，培養溫度20 50°C，搖床轉速60 300rpm，恒溫振蕩培養5 24h。所使用的平板培養基、種子培養基和發酵培養基均為LB培養基。種子培養基和發酵培養基均為LB液體培養基，配方為蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 溶于800ml去離子水中，用NaOH調pH至7. 5,加去離子水至1L, 121°C滅菌20min。平板培養基為LB固體培養基，在LB液體培養基基礎上添加2. O %瓊脂粉，121°C滅菌20min。實施例中所述酶液是將大腸桿菌發酵液(含菌體)經4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。所述酶活測定方法是將5ml酶液、5ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg蘆薈苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應20min，用HPLC法檢測蘆薈大黃素的含量。酶活單位(U)的定義在30°C、pH7. 5條件下，每小時酶促水解蘆薈苷產生I微摩爾蘆薈大黃素所需的酶量。所述反應產物中純化蘆薈大黃素的方法是指水解反應產物中，加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液，于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時，再在-10°C下保持2小時；抽濾，洗滌結晶兩次，60°C真空干燥。用HPLC法檢測蘆薈大黃素的純度檢測方法，并計算酶催化反應轉化率蘆薈大黃素高壓液相檢測方法色譜柱=Eclipse XDB-C18柱(4. 6mmX250mm，5 μ m);檢測波長254nm ;流動相甲醇-水溶液(80 20);流速0. 8mL/min ;柱溫室溫。蘆薈大黃素的質譜條件ESI離子源噴霧電壓4. 5kV ;毛細管溫度200°C ;毛細管電壓45V ;鞘氣(N2)流速40個單位；流動相甲醇0. 01mol/L乙酸銨水溶液(50 50V/V);流速0. 20mL/min ;負離子一級質譜全掃描。蘆薈大黃素的核磁共振條件Varian XL400 (400MHz)超導核磁共振儀上進行，以DMSO-d6為溶劑，1H-匪R的工作頻率為400. 13MHz。產物經質譜和核磁共振鑒定，表明產物確為蘆薈大黃素。實施例I一株重組大腸桿菌菌株及其用于制備蘆薈大黃素的方法，包括發酵培養重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114 (I)平板培養將篩選出來的重組菌株，接種到平板培養基上，37°C恒溫培養I天;(2)種子培養從平板上挑取菌落接種于種子培養基(250ml瓶裝液50ml)，37°C、250rpm振蕩培養4h (至OD600在O. 6 I. O之間)，4°C靜置過夜；(3)發酵培養按4%接種量將種子液接種于發酵培養基(250ml瓶裝液50ml)，于30°C、250rpm振蕩培養llh，產酶量可以達到148U/L發酵液。上述重組大腸桿菌發酵終止后，將發酵液(含菌體)經4°C、12000rpm，離心15min,棄沉淀，上清液即為酶液。將300mg蘆薈苷，50ml酶液，50ml磷酸鹽緩沖液(40mmol/L磷酸氫二鈉·磷酸二氫鈉緩沖液，PH7. 5，I. 2% NaCl)加入到500ml三角瓶中，30°C、210rpm振蕩反應8小時。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時，再在-10°C下保持2小時。抽濾，洗滌結晶兩次，60°C真空干燥。結晶產物經HPLC檢測，純度為98. 5%，酶促反應轉化率為73%。產物質譜圖如圖1，顯示分子量為270 ;產物核磁共振圖譜如圖2，由此確定產物為蘆薈大黃素。實施例2實施例I中發酵終止后，將發酵液(含菌體)經4°C、12000rpm,離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。將500mg蘆薈苷，75ml酶液，50ml磷酸鹽緩沖液(160mmOl/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH8. 0,1. 5% NaCl)加入到500ml三角瓶中，25°C、210rpm振蕩反應24小時。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時，再在-10°C下保持2小時。抽濾，洗滌結晶兩次，60°C真空干燥。結晶產物經HPLC檢測，純度為98. 2%，酶催化反應轉化率為65%。·實施例3實施例I中發酵終止后，將發酵液(含菌體)經4°C、12000rpm，離心15min，棄沉淀，上清液即為酶液。將200mg蘆薈苷，IOOml酶液，IOOml磷酸緩沖液(80mmol/L磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，pH7. 0，0. 6%NaCl)加入到500ml三角瓶中，40°C、210rpm振蕩反應12小時。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空濃縮至30ml左右，待冷卻至室溫后放置冰箱，在4°C下保持I小時，再在-10°C下保持2小時。抽濾，洗滌結晶兩次，60°C真空干燥。結晶產物經HPLC檢測，純度為98. 3%，酶催化反應轉化率為71. 8%。
權利要求
1.一株重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCCNo. 6114。
2.采用權利要求I所述的菌種制備蘆薈大黃素的方法，包括發酵培養重組大腸桿菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114，和反應產物中純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟將培養后的大腸桿菌發酵液冷凍離心，獲得的上清液作為酶源，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為O. 05 7. 5g/L，酶的加入量為20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸鹽緩沖液中進行水解反應，反應溫度為20 50°C，反應時間為2 24小時。
3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反應的pH優先選擇7 8。
4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反應的溫度優選25 40°C。
5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液，濃度為20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl。
全文摘要
本發明涉及用重組大腸桿菌菌株Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416 CGMCC No.6114制備蘆薈大黃素，屬生物技術領域。本發明包括發酵培養重組大腸桿菌和從生物轉化反應液中提取純化蘆薈大黃素，其特征在于包括酶促水解步驟將發酵培養后的大腸桿菌發酵液冷凍離心，獲得的上清液作為粗酶液，以蘆薈苷為底物，蘆薈苷加入量為0.05～7.5g/L，酶的加入量為20～300U/g底物，在pH5.0～9.0的磷酸鹽緩沖液中進行水解反應，反應溫度為20～50℃，反應時間為2～24小時。積極效果是利用微生物產生的酶作為催化劑，催化水解價廉易得的蘆薈苷，制備價值很高的稀有碳糖苷元——蘆薈大黃素，具有反應條件溫和，不需要特殊設備，能耗低，對環境友好等特點，轉化率可達到65％以上，所得蘆薈大黃素純度大于98％。
文檔編號C12P7/66GK102952773SQ201210290350
公開日2013年3月6日 申請日期2012年8月15日 優先權日2012年8月15日
發明者寇正福, 許建和, 劉坐鎮, 江邦和, 牛艷豐 申請人:華東理工大學, 上海華震科技有限公司