一株重組大腸桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因重組工程菌及其應(yīng)用，尤其設(shè)及一種用于發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧 還蛋白的重組大腸桿菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鐵氧還蛋白是一類含鐵硫簇的酸性蛋白，其中的鐵硫簇又主要分為[4化4S]、 [2Fe2S]、[3Fe4S]等類型。鐵氧還蛋白作為一種常見的電子載體，參與呼吸作用、光合作用、 發(fā)酵等重要代謝過程。目前，商業(yè)上出售的只有來自渡菜的巧化2S]型鐵氧還蛋白，然而因 物種差異，該鐵氧還蛋白在分析來自其他物種的酶的時候表現(xiàn)出不同的效率，且該蛋白價 格非常昂貴，運在很大程度上限制了鐵氧化還原蛋白的應(yīng)用和科學(xué)家對鐵氧還蛋白相關(guān)的 酶和代謝過程的研究。
[0003] 在已有的文獻報道中，大部分鐵氧還蛋白是從野生細菌等生物體中純化獲得的， 也有通過異源表達來制備，但運些方法具有很多不足，比如消耗大量的時間，純化步驟繁 瑣，表達量低，鐵氧還蛋白的鐵硫簇組裝不完整而活力較低，最終產(chǎn)量和純度較低等。基于 此，研究和開發(fā)能夠高效表達巧化2S]鐵氧還蛋白的方法成為目前亟待解決的課題，經(jīng)檢 索，有關(guān)能夠高效表達巧化2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)巧化2S]鐵氧 還蛋白中的應(yīng)用還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高效表達2Fe2S鐵氧還蛋白的重 組大腸桿菌及其應(yīng)用。
[0005] 本發(fā)明所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌命名為大腸桿菌 巧scherichiacoli)pCodonPlus/p服ISC/祀TDuet-S33 [2Fe2S]Fd，該菌株含有來源于根癌 農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因，其核巧酸序列如 SEQIDNO. 1所示；所述重組大腸桿菌是將巧化2S]鐵氧還蛋白基因連接入祀TDuet-1載 體，制得重組質(zhì)粒命名為祀TDuet-巧化2S]，并將制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pCodonPlus和 P服ISC質(zhì)粒的E.coliC41 (DE3)中獲得。
[0006] 本發(fā)明所述的重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)巧化2S]鐵氧還蛋白中的應(yīng)用。
[0007] 其中，所述重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)巧化2S]鐵氧還蛋白的方法是：
[0008] (1)將重組大腸桿菌菌株W體積比1~5%的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源 的TB培養(yǎng)基中，在37 ±rC和180 ± 1化pm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)2~3小時至孤62。?為0. 4~ 0.6,獲得菌液；
[0009] 其中，上述TB培養(yǎng)基的配方及組分終濃度是：T巧ptone12g/LYeastextract 24g/l，Glycerol4ml/l，KH2PO42. 3g/l，K2HPO4I2. 5g/L;
[0010] 上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環(huán)素，終 濃度為100μg/ml的氨節(jié)青霉素；
[0011] 上述鐵硫源配方及組分終濃度是：巧樣酸鐵錠0.2-0. 3g/l，心半脫氨酸 0. 1-0. 2邑/1，巧樣酸鐵 0. 18-0. 3g/l，i^S〇4· 7&0 0. 25-0. 4g/L;
[001引 似向制得的菌液中加入終濃度為0. 5mM的IPTG，在16~37°C和180±1化pm轉(zhuǎn) 速下誘導(dǎo)2. 5~24小時，收集培養(yǎng)液離屯、，獲得含巧化2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細 胞；
[0013] (3)破碎細胞，分離純化制備巧化2S]鐵氧還蛋白。
[0014] 上述的應(yīng)用中，步驟（2)所述IPTG優(yōu)選在35~37°C和18化pm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)10~ 24小時。
[0015] 步驟（3)中破碎細胞的方法是：將離屯、后獲得的含巧化2S]鐵氧還蛋白的重組大 腸桿菌細胞用含10%甘油的緩沖液A重懸后，采用超聲波破碎儀器進行細胞破碎，12,000 轉(zhuǎn)/分鐘離屯、30min，取上清液用0. 22um孔徑濾膜過濾，即獲得含有組氨酸標簽的巧化2S] 鐵氧還蛋白粗酶液。
[0016] 步驟（3)中分離純化制備巧化2S]鐵氧還蛋白的方法是：
[0017] 儀柱純化：將制得含有組氨酸標簽的巧化2S]鐵氧還蛋白粗酶液經(jīng)過上樣柱進入 儀柱中，上樣速度為2ml/min。上樣結(jié)束，用緩沖液A沖洗儀柱，去除雜蛋白。再用緩沖液A 和B按一定比例混合，進行梯度洗脫，收集目的蛋白。將純度不夠的蛋白用緩沖液C濃縮洗 涂，進行DEAE柱純化，用緩沖液C和D按一定比例混合，進行梯度洗脫，收集目的蛋白。
[0018] 洗脫出來的蛋白用濃縮管進行濃縮，并用洗涂緩沖液洗涂蛋白，SDS-PAGE觀察蛋 白的大小及純度，用考馬斯亮藍法測蛋白含量，用分光光度計對蛋白進行全波長掃描。
[0019] 最后得到純化好的蛋白在厭氧條件下低溫儲存。
[0020] 活性測定：分別用氨化酶和NfnAB兩種酶測定純化出來的鐵氧還蛋白的活性。 [002U上述緩沖液A的配方是：憐酸鋼20mM，化Cl0. 5M，pH7. 4。
[0022] 上述緩沖液B的配方是：憐酸鋼20mM，化Cl0. 5M，咪挫500mM，pH7. 4。
[002引上述緩沖液C的配方是：憐酸鋼50mM，pH7. 0。
[0024] 上述緩沖液D的配方是：憐酸鋼50mM，IM化Cl，pH7. 0。
[0025] 上述步驟所有操作過程均在厭氧操作箱中進行，所有溶液均進行煮沸后脫氣厭氧 處理。
[0026] 本發(fā)明成功構(gòu)建了能夠表達帶有組氨酸標簽的[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸 桿菌，它的應(yīng)用就是大家熟悉的大腸桿菌中異源表達的方法，不需要大量培養(yǎng)產(chǎn)鐵氧還蛋 白的野生菌，節(jié)省了大量的時間，節(jié)約了成本。
[0027] 本發(fā)明的重組大腸桿菌種含有的pCodonPlus與P服ISC質(zhì)粒和誘導(dǎo)時加入的鐵硫 源促進了蛋白上鐵硫簇的合成，活力強表達量高，使巧化2S]鐵氧還蛋白最終產(chǎn)量顯著提 升。實驗證實：通過SDS-PAGE觀察蛋白純度較好，大小與預(yù)期的相符；每升培養(yǎng)物最終可W 獲得23mg純化后的巧化2S]鐵氧還蛋白，遠大于報道中的野生菌中純化的0.03mg^ ;蛋白 進行全波長掃描后在325,415和456nm處有特征吸收峰（見圖1)，說明鐵硫簇構(gòu)建比較完 整，獲得的融合標簽的鐵氧還蛋白具有與野生蛋白相同的活性。活性檢測中分別測得氨化 酶的比活為12. 5 + 1.8U/mg，NfnAB的比活為33.8+ 4.lU/mg。預(yù)示本發(fā)明提供的重組大腸 桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0028] 圖1 :為本發(fā)明所述重組大腸桿菌表達的帶有組氨酸標簽的巧化2S]鐵氧還蛋白 全波長掃描圖。
[0029] 其中：在325,415和456皿處顯示有特征吸收峰。
[0030] 圖2 :為本發(fā)明所述重組大腸桿菌表達的帶有組氨酸標簽的巧化2S]鐵氧還蛋白 SDS-PAGE電泳圖。
[0031] 其中，Μ表示蛋白marker，1表示目的蛋白在大腸桿菌中異源表達后的粗酶液，2表 示儀柱純化后的巧化2S]鐵氧還蛋白，3表示DEAE柱純化后的蛋白。
【具體實施方式】
[0032] 下面結(jié)合實施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
作進一步闡述。
[0033] 本發(fā)明中所用菌株、材料及來源說明：
[0034]含pCodonPlus和P服ISC質(zhì)粒的E.coliC41 (DE3)細胞由Dr.YasuhiroTak址as hi(大阪大學(xué)）構(gòu)建和提供，其中pCodonPlus和E.coliC41(DE3)分別來自Stratagene公 司和Lucigen公司。根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33由山東大學(xué)王書寧篩 選，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中屯、，編號為CCTCCM206131。
[0035] 質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化 科技（北京）有限公司。QIAampDNAMini試劑盒、Mi址lutePCR純化試劑盒購自Qiagen公 司。Wizard基因組DNA純化試劑盒購自Promega公司。祀TDuet-1載體購自Novagen公司。 高保真化stP化DNA聚合酶購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。祀ASY-Blunt克隆載體購 自北京全式金生物技術(shù)有限公司。E.coliMach1-T1細胞購自Invitrogen公司。內(nèi)切酶、 T4DNA連接酶購自Thermo公司。義用的儀柱為HisTrapHPColrnnn，購自GEHealthcare 公司。
[0036] 實施例1 :高效表達AgrobacteriumtumefaciensS33中的[2Fe2S]型鐵氧還蛋 白的重組大腸桿菌的構(gòu)建
[0037] 取AgrobacteriumtumefaciensS33細胞，按照細菌基因組DNA提取試劑盒推薦 方法，從AgrobacteriumtumefaciensS33細胞中提取基因組DNA。
[0038] 根據(jù)已知的根癌農(nóng)桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)S33基因組中[2Fe2S]型 鐵氧還蛋白基因序列如SEQIDNO. 1所示，設(shè)計引物如下：
[0039]F引物：5'CGCGGATCCGATGACAAAACTGACAATCGTTGC3'
[0040]R引物：5'CCCAAGCTTTCAGCCCTGGCGCTCAGGAAC3'
[0041]W提取的AgrobacteriumtumefaciensS33基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲 得巧化2S]型鐵氧還蛋白基因。PCR反應(yīng)體系如下：
[0042] 加H:0 71Lii F化腳'u錠沖液 20μ1 !0niMclNTPs 2μ1 2〇μΜΡ引物 1.5 μ1
[0043] 20μΜ民引物 21.5 μ1 .化化也化'似7'""!化從7'州.、' S33語!人|如.日ΝΑ 2 μ1 FastPfu DNA polymerase 2 μ1
[0044] PCR反應(yīng)條件為：
[0045] 95°C5min
[0046] 95°C30s，55°C30s，72°C30s30 個循環(huán)
[0047] 72°ClOmin
[0048] 4°C保溫
[0049]PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳初步確認正確后，用DNA純化回收試劑盒純化。將純化 的PCR產(chǎn)物與祀TDuet-1載體分別用BamHI和Hindlll在37°C酶切20分鐘，酶切體系如 下：
[0050] DNA 80ul Green Buffer lOul ///円cUll Sul 5ul
[0051]用DNA純化回收試劑盒回收后進行連接，連接反應(yīng)體系如下：
[0052] 目的基園的PC民產(chǎn)物 4μ1 pETDud-i哉體 4.5 μ1 Τ4DNA連接酶 0.5 μ1 Τ4DNA連接酶緩沖液 1