專利名稱：細胞培養的制作方法
技術領域：
本發明涉及細胞培養，并且特別涉及原代細胞、細胞系、多潛能細胞、全能細胞和干細胞的培養，及通過調節細胞培養條件對其多種細胞過程的調節。本發明涉及在多種條件下利用多重培養步驟來調節細胞通路并且提供用于確定各種多重培養步驟方式對細胞過程，例如生長、分化和代謝活動的影響的方法。
背景技術：
近年來細胞培養已經成為生命科學中的核心技術。在，Basic CellCulture 1 Oxford University Press (2002)Ed.J.M.Davis ；和 1 Animal CellCulture' Oxford University Press (2000) Ed.John R.W.Masters 中有關于細胞培養的描述，兩者在此全部引入作為參考。細胞培養為研究細胞過程，例如細胞的存活、表型、基因型、增殖和分化，以及生物分子、中間物和產物的形成提供基礎。也從遺傳學水平-無論是在分離物或完整的轉基因動物中-直到個體的蛋白質分子水平，為研究這些過程的調節提供方法。盡管其對生物學目前的狀態有巨大貢獻，即為令人鼓舞的科學最終提供了遺傳治療和組織工程的可能性，然而在許多方面細胞培養仍處于發展狀態。細胞培養的重要目的是能夠使多種細胞在體外生長。可培養生長的不同細胞類型的目錄是廣泛的(參見美國典型培養物保藏中心，http://www.atcc.0ra:歐洲細胞保藏中心，http://www.ecacc.0rg.uk:德國微牛.物保藏中心,http://www.dsmz.de),包括大多數細胞類型的代表物，并且隨著越來越多的培養條件被發現而不斷增加。盡管本領域中的發展是穩定的，對于新的細胞類型的合適培養條件的確定方法仍保持為完全地經驗主義狀態:通常用反復試驗的方法發現生長條件。起始點的選擇經常是基于先前別人對于相似細胞所使用的，乃至目前 實驗室對于不同的細胞所正在使用的培養條件。通常這些條件可能根本是完全不夠的，并且必須重新開始反復試驗的過程。即使新的培養條件是成功的，也必須記住對先前方法的改進也為實驗引入了歷史性的偏移。例如，大量的早期組織培養實驗使得成纖維細胞能廣泛使用，并且迄今為止大多數標準的細胞培養條件促進來源于中胚層的細胞的生長(成纖維細胞、內皮、成肌細胞)。根據這些條件開發用于上皮細胞和其他細胞類型的選擇性生長的培養基是一種挑戰。對于一些細胞類型現在已知血清一一用于中胚層細胞的許多培養基的正常成分一一實際上抑制生長。在此所描述的本發明的一個方面是開發容許特定細胞類型的存活、增殖或生長以及保持其表型的合適培養條件的方法。除促進細胞增殖的條件外，現代組織培養中特別重要的步驟是能夠控制或指導細胞向特定的表型分化。因為細胞系的增殖需要細胞數目增加，絕大多數的培養條件已經發展至促進最大的細胞增殖。并不令人驚訝的是這些條件對細胞分化沒有幫助，其中細胞生長經常受到限制乃至消除了細胞生長。促進細胞增殖的條件一般是低的細胞密度、低的Ca2+濃度、和存在生長因子，例如表皮生長因子(EGF)、成纖維細胞生長因子(FGF)和血小板衍生的生長因子(TOGF)。另一方面，在高細胞密度、高Ca2+濃度和存在分化誘導物，例如激素(例如氫化可的松)、旁泌性因子(例如IL-6、KGF、NGF)、類視黃醇以及甚至平面的極性化合物，例如二甲基亞砜(DMSO)的條件下促進白細胞郁積和分化。因此可能需要不同的條件用于特定細胞系的增殖和分化，當然這些相應的條件可能在不同譜系的細胞之間是不同的。在此所描述的本發明的第二個方面是用于發現容許細胞選擇性分化的合適培養條件的方法。在細胞培養中還遇到的一些常見問題是原代細胞系的有限壽命，隨著傳代及其轉化的細胞系特性的變化伴隨有重要細胞特性的丟失。這些影響嚴重地限制了培養細胞供實驗或分析之用，例如如下所述基于細胞的分析的實用性。原代細胞，即從組織新分離的細胞，極大地提供了最精確的細胞培養模型，因為它們表現出與其組織起源廣泛相似的方式。值得注意的是，仍然沒有開發出培養原代細胞的可靠方法，因此這些細胞在體外顯示出有限的壽命。例如當試圖擴增原代培養物或當試圖進行更長時間的實驗時，這表現出嚴重的技術限制。與原代培養物的使用相關的進一步問題是由于它們需要恒定的新鮮分離物，可能很難找到原材料，特別是來自于人的原材料，也很難獲得表現一致的品系。因此本發明的第三個方面是培養原代細胞以獲得具有延長壽命的有存活力培養物的方法。如果原代培養物在體外 維持延長的時間，它們一般經受大部分細胞死亡的危險期，然而幸存的細胞是壽命較長的并且可進行無限培養。大多數的這些連續細胞系幾乎總是如同細胞存在于完整動物組織中時的細胞的弱表現物。對于此的一個原因是容許細胞變得永生的過程也對細胞的特性有影響。例如，大多數已建立的細胞培養物已經停止表達組織特異的基因，并且替代的只表達為在細胞培養中連續生長所需要的管家基因一一因此大多數這種細胞系相互之間的相似性比與其最初來源的組織之間的相似性要高。例如，大多數肝細胞系已經停止表達藥物一代謝酶，該酶一般可能使其成為用于測試藥物毒性的重要工具。在此所描述的本發明的進一步方面是培養細胞的方法，以使得它們提供更精確的組織模型。這隨后可能改善基于細胞的實驗和分析的可靠性和預測功效。本領域中需要培養細胞的改進技術，以及發現和實施這種技術來調節細胞過程，例如生長、分化、代謝活動、和表型表達的方法。

發明內容
本發明提供新的細胞培養技術，該技術是基于將細胞培養作為涉及以限定順序進行系列培養步驟的動力學過程從而更好地達到預期效果的概念。本發明認識到可開發順序暴露于所選擇試劑的方式以調節細胞過程，因此達到先前不能通過傳統技術可得到的控制水平。本發明致力于解決通過傳統技術即使能夠也很難解決的涉及多個步驟和試劑的細胞培養技術。由于傳統細胞培養的繁重特性，復雜的多階段方法中組織培養條件的經驗主義確定不是在實踐中可實行的，因為它包括大量的工作負荷。在第一個方面，本發明提供用于確定多種培養條件對細胞的影響的方法，包括下列步驟:
(a)提供第一組各自包括一個或多個細胞的細胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養條件；(b)再重分一個或多個所述的群體以產生進一步的細胞單元群；(C)將所述的進一步的群體暴露于所需要的培養條件；(d)任選地，根據需要反復地重復步驟(b)-(c);以及(e)評估已經接觸細胞的培養條件對所述的給定細胞單元的影響。有利的是，根據本發明的細胞群是匯合的并且隨后被分開。因此在優選的實施方案中，本發明提供用于確定多種培養條件對細胞的影響的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個或多個細胞的細胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養條件；(b)匯聚兩個或多個所述的群體以形成至少一個庫；(C)再重分所述庫以產生進一步的細胞單元群；(d)將所述的進一步的群體暴露于所需要的培養條件；(e)任選地，根據需要反復地重復步驟(b)-(d);以及(f)評估細胞已經接觸的培養條件對給定細胞單元的影響。本發明致力于所有的細胞過程，包括細胞的表型、基因型、分子產生、活力和增殖以及分化。優選地，使用本發明鑒定導致細胞分化的條件。例如可通過使細胞經受合適的培養條件來誘導細胞沿著所需要的發育 途徑分化。也研究改變培養條件的時機以更好地限定細胞的發育程序。培養條件包括生長培養基、化學制品、分子、和存在于生長培養基中的大分子試齊 、溫度狀況、基質、大氣條件、物理的細胞處理等。本發明的上述方法，被稱為組合的細胞培養、或分開-匯聚的培養，容許細胞經受一系列培養條件，并且在培養基中以系統的和高度多產的方式接觸一系列試劑。盡管可通過與組合化學類似的方式高度有效地使用分開和匯合的重復循環，考慮到必要的處理能力可使用包括至少2個連續的分開步驟(無再匯合)的方案。這種方法的缺點是它們可能迅速地產生極大量的已經不同處理的分離樣品。然而優點是各個樣品不需要費力的重疊合法，因為其中的細胞單元只暴露于一組條件。因此，考慮到合適的樣品處理設備，分開的處理可能產生快速的結果。本發明使用細胞單元。這種單元可以是單個細胞，或者更有優勢的是兩個或多個細胞的克隆，該細胞是以甚至在分開匯合培養過程期間可抗破壞的形式排列的。例如，可在固體基質，例如珠子上培養細胞，如下進行更詳細地描述。優選地,可對細胞單元進行標記。標記允許對細胞已經接觸的培養條件,或暴露于不同培養條件的細胞單元進行追蹤；因此，任何給定的細胞單元可通過其標記讀取以確定它如何來源于起始細胞匯合物或培養物。標記可能是任何種類的分子或物理形式，包括核酸標記、射頻編碼標記、熒光或光學的標記、和表面或基質上的細胞單元的空間編碼。本發明的方法容許以多道傳遞高通量分析的方式測試成千的或上百萬的細胞培養條件和試劑，以確定為達到相對于任何細胞過程所需要的結果而必需的條件。因此，本發明提供用于將細胞暴露于多種細胞培養條件的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個或多個細胞的細胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養條件；(b)再重分一個或多個所述的群體以產生進一步的細胞單元群；(C)將所述的進一步的群體暴露于所需要的培養條件；以及(d)任選地，根據需要反復地重復步驟(b)-(c)。在優選的實施方案中，如上所述使用匯合步驟。在如此的實施方案中，本發明提供用于確定多種培養條件對細胞的影響的方法，包括下列步驟:(a)提供第一組各自包括一個或多個細胞的細胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養條件；(b)匯合兩個或多個所述的群體以形成至少一個第二庫；(C)再重分第二庫以產生進一步的細胞單元群；(d)將所述的進一步的群體暴露于所需要的培養條件；(e)任選地，根據需要反復地重復步驟(b)-(d);以及(f)評估細胞已經接觸的培養條件對給定細胞單元的影響。在進一步的方面，本發明提供用于鑒定影響細胞過程的基因的方法，包括下列步驟:a)根據本發明中上述的方面來確定一種或多種培養條件對細胞單元的影響；

b)當所述的細胞接觸所述的培養條件時，在所述的細胞單元中分析基因表達；以及c)鑒定在所需要的培養條件下差異表達的基因。優選地，所使用的培養條件引起細胞過程的變化；選擇這些培養條件用于產生待分析基因表達的細胞。可利用任何比較性的表達監測技術便利地分析基因表達，包括基于PCR的技術、基因表達的系列分析(SAGE)、或例如可從如AfTymetrix供應商廣泛獲得的陣列技術。在另一個方面，本發明提供用于產生編碼影響細胞過程的基因產物的核酸的方法，包括如上鑒定基因，以及通過核酸合成或生物復制制備所述基因的至少編碼區域。在進一步的方面，提供用于在細胞中誘導細胞過程的方法，包括下列步驟:a)根據本發明鑒定與細胞過程相關的一個或多個差異表達的基因；以及b)在細胞中調節所述的一種或多種基因的表達?？赏ㄟ^例如轉染或其他方式將基因轉移到細胞中，以使得其以瞬時或永久的方式過表達而調節細胞中基因的表達。備選地，可例如通過增強子插入或施用在基因表達中產生增加(例如安慰誘導物)或降低(例如反義RNA1、轉錄因子)的外源試劑而改變內源基因的表達。此外，可施用基因產物本身或導入細胞以實現增加其活性。而且可對細胞施用增減基因產物活性的試劑(例如競爭性的和非競爭性的抑制劑、藥物、藥品)。在更進一步的方面，本發明提供用于鑒定細胞中細胞過程狀態的方法，包括下列步驟:a)如上所述鑒定與細胞過程相關的一個或多個差異表達的基因；以及b)檢測細胞中所述的一個或多個基因表達的調節，由此確定所述細胞中細胞過程的狀態。優選地，用于這個分析的基因編碼細胞標記，其可例如通過免疫測定進行檢測。備選地，基因產物可以是能夠根據熒光的、色度學的、放射度的、或其他方法學分析活性的酶。本發明進一步地提供用于調節細胞過程的方法，包括下列步驟:a)根據本發明中上述的方面來確定一種或多種培養條件對細胞單元的影響；b)將細胞暴露于影響細胞過程變化的培養條件；以及c)分離所需要的細胞。因此根據 本發明的上述方面，本發明提供用于從雙潛能、多潛能或全能的祖代產生分化細胞的方法。分化的細胞、特別是部分分化的、多潛能的細胞、或發育定型但未分化的祖細胞在藥物發現、細胞治療和需要限定譜系的細胞的其他步驟中是有用的。也提供一種用于鑒定能夠誘導細胞過程的試劑的方法，包括下列步驟:a)根據本發明上述的方面來確定一種或多種試劑對細胞單元的影響；以及b)鑒定在細胞單元中誘導細胞過程的試劑?？赏ㄟ^常規的化學、生物化學或其他技術合成根據本發明鑒定的試劑，并用于在例如在此所描述的細胞中調節特定細胞過程的方法。此外本發明廣泛提供培養附著于固體載體，例如附著于微載體或珠子的細胞的方法。這種載體可由大分子組成，例如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖、或丙烯酰胺、或無機材料，例如玻璃。可通過物理或化學處理進一步改進載體的表面，例如吸附或共價交聯具有所需要電荷或其他所需要特性的分子實體。備選地，載體可由細胞或包封在基質內的細胞組成，該基質容許灌注亞細胞大小的物質。微載體培養具有顯著的優點，包括擴大規模的培養，以及根據需要容許細胞單元便利地暴露于所選擇的培養條件以產生所需要的細胞過程。因此在廣泛的實施方案中，本發明提供用于在體外培養細胞的方法，包括使所述的細胞附著于微載體或珠子生長。優選地，細胞經受至少一個培養條件的變化。優選地，它們經受2、3、4、5、6、7、8、9或10或10種以上不同的培養條件。優選地，所述的培養條件的變化包括培養基的變化。此外本發明提供用于培養細胞的方法，其中如本發明前述實施方案所描述的產生匯合的細胞并加以再重分。因此，在一個方面中，提供用于體外培養細胞的方法，包括下列步驟:a)組合在不同條件下生長的一個或多個細胞培養物；以及b)在普通的條件下培養該細胞。在進一步的實施方案中，提供用于體外培養細胞的方法，包括下列步驟:a)培養細胞培養物；以及b)將所述的培養物分為兩組或多組細胞群，并且在兩種或多種不同種類的培養條件下培養所述的細胞群。優選地，將細胞暴露于3、4、5、6、7、8、9、10種或10種以上不同的培養條件。所使
用的培養條件有利地包括培養基的變化。此外本發明廣泛提供附著于微載體，例如珠子來體外培養干細胞和來源于干細胞的分化細胞的方法。微載體培養具有顯著的優點，包括擴大規模的培養，以及根據需要容許干細胞單元暴露于所選擇的培養條件以獲得所需要的生長和/或分化條件。因此在一個實施方案中，本發明提供用于在體外培養干細胞和來源于干細胞的分化細胞的方法，包括使所述的細胞附著于微載體或珠子生長。
有利地，細胞經受至少一個培養條件的變化。優選地，它們經受2、3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上不同的培養條件。優選地，所述的培養條件的變化包括培養基的變化。此外本發明提供用于培養干細胞的方法，其中如本發明前述實施方案所描述的產生匯合的干細胞并加以再重分。因此，在一個方面中，提供用于體外培養干細胞和來源于干細胞的分化細胞的方法，包括下列步驟:a)組合在不同條件下生長的一個或多個細胞培養物；以及b)在普通的條件下培養該細胞。在進一步的實施方案中，提供用于體外培養干細胞和來源于干細胞的分化細胞的方法，包括下列步驟: a)培養干細胞培養物；以及b)將所述的培養物分為兩組或多組干細胞群，并且在兩種或多種不同種類的培養條件下培養所述的干細胞群組。優選地，將細胞暴露于3、4、5、6、7、8、9、10或10種以上不同的培養條件。所使用
的培養條件有利地包括培養基的變化。有利地，以細胞單元的方式培養細胞或干細胞，每個細胞單元包括一個或多個這種細胞。例如，該細胞單元可以是單個 細胞。然而，各個細胞單元可能包括附著或結合固體基質，例如微載體或珠子的一個或多個細胞或干細胞。進一步地固體基質包括孔或培養基可滲透的屏障物。根據本發明用于培養細胞或干細胞的方法可以在合適的生物反應器中擴大規模。例如，本發明的方法可利用超過50g干重的微載體來實施。


圖1顯示進行三輪分開-匯合細胞培養的實施例。通過在給定的條件下進行生長來獲得細胞單元群。將細胞單元描繪為球狀物而細胞單元群顯示在培養瓶中。將細胞單元分為3等分，在標示為A、B、C的不同生長條件下培養2天。隨后匯合細胞單元并且再一次分為3等分，在條件D、E或F下生長。在這個步驟進行2輪后，可見多種細胞群已經暴露于所有可能的細胞培養條件的組合。圖2顯示分開-匯合細胞培養的另一個實例。在這種情況下，實驗從A、B和C3群開始。在第一個步驟中匯合樣品，隨后分為D、E和F群。圖3顯示分開-匯合方法的變化，其中來自A、B和C的群直接分為D、E和F群而沒有先前的匯合。個別細胞群的分隔可以是隨機的或可以是預定的。圖4顯示分開-匯合方法的進一步變化，其中將細胞群A、B和C分為細胞群D、E和F而沒有先前的匯合，但是在第二個步驟中細胞群D、E和F匯合并隨后分為細胞群G、H和I。圖5顯示分開-分開的方法，包括將細胞群A分開以形成細胞群B、C和D的第一步驟，以及將細胞群B、C和D分開以形成細胞群E-M的第二步驟。圖6顯示包含分開-分開步驟地分開-匯合方法。在2輪的分開和匯合后，分開細胞群A、B和C而沒有先前的匯合，結果形成來源于細胞群A、B或C的3組不同的細胞群譜系。注意可使用包括分開-分開步驟來推導細胞效應的產生中細胞培養條件的作用。例如，如果在只來源于譜系A的細胞單元中觀察到細胞效應，而假定在譜系A、B和C的分散后的多種細胞群中分析的細胞培養條件是相同的，那么在分支點的細胞群A的培養條件必定對細胞效應是必不可少的。也注意圖1-6中所說明的方法可進行許多組合使用。圖7顯示包括多潛能的胚胎干細胞、表達嵌合的τ -綠色熒光蛋白、附著于多孔微載體(Cytopore 2, Amersham Biosciences)的細胞單兀。圖8Α-Η顯示通過抗體染色法確定神經膠質標記GFAP的表達，表明包含表達τ_綠色熒光蛋白(GFP)融合蛋白質的ES細胞和多孔微載體Cultispher G的細胞單元正在進行分化。A-D顯示利用40Χ物鏡在相差顯微鏡(A)下，以及在熒光作用下觀察到的細胞單元，其中利用DAPI (B)、和(紅色)標記GFAP (C)以及(綠色)GFP (D)染成藍色的細胞核是明顯的。圖C和D顯示似乎是暗示為神經膠質包裹神經元過程的細胞的線性陣列(白色箭頭)。E-H顯示對照細胞單元，其中已經除去了抗-GFAP的第一抗體。圖1顯示通過熒光顯微術獲得的合成圖像，顯示在無孔微載體(Cytodex 3，Amersham Biosciences)上生長的分化的胚胎干細胞。該細胞表達τ-GFP并且用針對神經元-特異的蛋白質β微管蛋白III的熒光抗體免疫化學地染成紅色。黃色著色表明紅色和綠色的同時染色。圖9顯不包括附著于無孔微載體(Cytodex 3, Amersham Biosciences)的HepG2細胞的細胞單元的相差(圖A、C、E)和熒光顯微照片。圖A/B:陽性對照細胞單元顯示乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮轉化為紅色熒光產物；圖C/D:以同樣方式培養的陰性對照細胞單元，其中沒有加入乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮；圖E/F:分開-匯合實驗后的細胞單元，表明一些用P450誘導劑β -萘黃酮處理的細胞單元具有高水平的P450，并且能夠快速地轉化乙氧基9-羥基-3-異吩唑酮為熒光產物(圖F)，同時通過不表達高水平Ρ450的大量細胞增殖經受分開-匯合培養的其他細胞單元(例如圖E的底部右側的明顯細胞單元)。圖10顯示利用RF ID標記細胞單元。圖A:玻璃包封的射頻轉發器IDlOO-A(Trovan);圖B:在玻璃包封的射頻轉發器的直線邊緣上生長的表達τ-GFP融合體蛋白質的小鼠胚胎干細胞(光學顯微術，頂部；熒光顯微術，底部；合并成像，中部)；(C)顯示在玻璃包封的射頻轉發器的圓頭上生長的表達GFP的胚胎干細胞(光學顯微術，頂部；熒光顯微術,底部；合并成像，中部)。圖11表明小鼠ES細胞的分開-匯合培養后有差異的基因表達。使ES細胞在Cytopore 2微載體上，在沒有加入物(泳道1、4、7、10)、或加有I μ M LiCl (2、5、8、11)、或I μ M視黃酸(3、6、9、12)的ES培養基(A)、CDM⑶、或DMEM(C)中生長。從該細胞制備cDNA，并且以相等的數量用對照基因甘油醛3磷酸脫氫酶(G3TOH)、和未分化的ES細胞的標記物(0ct4)、神經元前體(Nestin)、和內皮細胞(HNF3 β )的寡核苷酸引物進行PCR。該照片是PCR產物的溴化乙唳-染色的瓊脂糖凝膠,其以開括號(open brackets)表明。'PD'表明引物-二聚體產物。圖12顯示微載體的標記。圖A-D:沒有(A、B)或有(C、D)生物素?；目筥膠原抗體孵育的、用鏈霉抗生物素-FITC染色的CytodeX3微載體，并且在相差(A、C)和熒光(B、D)顯微鏡下觀察。圖E-H:沒有(E、F)或有(G、H)交聯的生物素部分的、用鏈霉抗生物素-包被的I μ m直徑的紅色熒光珠染色的Cultispher G微載體，并且在相差(E、G)和熒光(F、H)顯微鏡下觀察。圖片a顯示將CytodeX3微載體與表達τ -GFP轉基因的ES細胞一起接種。圖13顯示具有2種不同熒光標記的微載體的2個群體的標記。將CytodeX3微載體分別與紅色或綠色的鏈霉抗生物素乳狀珠孵育，然后以1:1比率混合。利用相差顯微鏡術(A)進行觀察，并且用濾光器檢測綠色(C)或紅色(D)熒光。B是C+D的合并照像。兩個標記是容易檢測的，并且沒有檢測到標記的顯著轉移。圖14表明具有2種不同突光標記的微載體的雙標記。將Cytodex3微載體與紅色和綠色鏈霉抗生物素乳狀珠的1:1混合物孵育。在相差顯微鏡(A)下進行觀察，并且用濾光器檢測綠色(C)或紅色(D)熒光。B是C+D的合并照像。每種微載體都是雙標記的。圖15顯示利用相差(圖A)或熒光(圖B)顯微鏡檢測顯示細胞過程的細胞單元。可利用熒光顯微術⑶容易地從背景辨別出表達τ-GFP融合蛋白的細胞單元，并且可從混合物人工分離出來。圖16 顯不來自利用 COPAS 選擇(Union Biometricalnc., SomerviIle,MA)儀器自動分析微載體和細胞單元的的數據。圖A和B:將懸浮在PBS中的CytodeX3微載體通過分揀器并且監測大小(飛行時間；T0F)對光散射(消光；Ext) [A]，以及監測綠色熒光(FLUl)對紅色熒光(FLU2) [B]。圖C和D:對標記有紅色熒光乳狀珠的CytodeX3微載體的分析顯示Ext對T0F[C]、和熒光[D]的曲線圖；圖B和D的比較說明微載體的標記導致其紅色熒光信號的增加。圖E和F:分析包括CytodeX3和表達τ-GFP轉基因的ES細胞的細胞單元群。Ext對T0F[E]的曲線圖中增加的散射和綠色熒光的寬范圍(FLUl) [F]顯示可根據細胞數目分揀細胞單元。圖17顯示鑒定用于標記細胞單元的標記。圖A-D:用生物素修飾的Cultispher微載體的鏈霉抗生物素-FITC標記(A、B)或其天然的未處理狀態(C、D)。圖E-G:在相差顯微鏡術(E)下，和在綠色(F)和紅色(G)落射熒光光學裝置下觀察包括表達τ-GFP融合蛋白的ES細胞,和用鏈霉抗生物素-包被的I μ M紅色-熒光乳狀珠(Sigma)標記的生物素?；疌ultispher G微載體的細胞單元，以分別顯像GFP-標記的細胞和紅色突光標記。圖H-K:利用I μ M紅色-熒 光乳狀珠(Sigma)的對照樣品校準FACS，顯示FL3熒光通路⑴中特征性的前向和旁側的-散射參數(H;方框區域)和特征性的熒光強度。通過控制預先確定的標記的大小參數對單獨蛋白水解消化的、用I μ M紅色-熒光乳狀珠(Sigma)標記的細胞單元進行FACS分析(J ;方框區域)，然后檢測特征性標記的特征性的FL3通路強度(K)。圖18顯示鑒定用于標記微載體的多個標記。圖A:使用對照標記的前進/旁側散射參數限定控制門大小為4.4 μ Μ(控制門Rl)、5.5μΜ(控制門R2)、和1μΜ(控制門R3)珠。圖B-D:蛋白水解消化的標記的微載體的FACS分析顯示存在相應于來自Bangs Labs5號組的綠色熒光4.4 μ M珠的標記(圖B);來自Bangs Labsl號組的綠色-熒光5.5 μ M珠(圖C)，和來自Sigma的I μ M紅色熒光珠(圖D)。
具體實施例方式定義培養條件如在此所使用的，術語"培養條件"是指為了促進所述細胞的生長或分化而放置細胞或細胞接觸的環境。因此，該術語是指可能影響細胞的生長和/或分化的培養基、溫度、大氣條件、基質、攪拌條件等。更特別地，該術語是指可摻入培養基并可影響細胞的生長和/或分化的特定試劑。細胞如在此所指，細胞被定義為能夠獨立發揮功能的生物體的最小結構單位，或單細胞的生物體，其由全部都被半透性的細胞膜或細胞壁包圍的一個或多個細胞核、細胞質和多種細胞器組成。該細胞可以是原核的、真核的或古細菌的。例如，細胞可以是真核細胞。優選哺乳動物細胞，特別是人細胞。細胞可以是天然的或例如通過遺傳操作或在培養物中傳代而改進以獲得所需要的特性。對干細胞如下進行更詳細地定義，其是能夠產生一個以上分化的細胞類型的全能性、多潛能或多能細胞。干細胞可以在體外分化以產生分化的細胞，其本身可以是多能的，或可以是末端分化的。體外分化的細胞是已經通過將干細胞暴露于一種或多種促進細胞分化的試劑而人工產生的細胞。細胞過程細胞過程是任何胞內或胞外發生或觀察到的，或可歸于細胞的特性、功能、過程、事件、起因或效應。細胞過程的實例包括但不限于，活力、衰老、死亡、多能性、形態學、信號、結合、識別、分子的產生或破壞(降解作用)、突變、蛋白折疊、轉錄、翻譯、催化作用、突觸傳遞、泡囊轉運、細胞器功能、細胞周期、代謝、增殖、分裂、分化、表型、基因型、基因表達、或這些過程的調控。細胞單元一群細胞，其可以是一種細胞的群體?？梢允腔旧喜浑x解細胞單元本身而分揀、重分和處理的細胞單元的匯合，該細胞單元表現為細胞的集落并且在該細胞單元中各個細胞暴露于相同的培養條件。例如，細胞單元可包括粘附細胞群體的珠子。全能性全能細胞是存在于生物體中具有分化成為任何類型的體細胞或生殖細胞的潛力細胞。因此，可以從全能細胞以一些方式衍生出任何所需要的細胞。多潛能性多潛能的細胞是可分化成為一種以上但不是所有細胞類型的細胞。標記如在此所 使用的,標記或標記物是鑒定細胞單元和/或確定接觸細胞單元的培養條件、或培養條件的順序的方式。因此，標記可以是各自在特定的培養步驟加入的一組標記；或在開始階段或實驗中加入的標記，其根據接觸細胞單元的培養步驟進行改進或在培養期間進行追蹤；或只是定位的參考，其容許推導所使用的培養步驟。標記或標記物也可以是在任一時刻報告或記錄細胞單元的位置或同一性，或將獨特的識別器指派給細胞單元的裝置。標記或標記物的實例是單一序列的分子、結構或質量；或熒光分子或物體，例如珠子；或射頻和其他轉發器；或具有獨特標記或形狀的物體。暴露于培養條件當使細胞處于與培養基接觸，或在影響一種或多種細胞過程，例如細胞的生長、分化、或新陳代謝狀態的條件下生長時，該細胞是暴露于培養條件的。因此，如果培養條件包括在培養基中培養細胞，將細胞置于培養基中足夠的時段以使它具有效應。同樣地，如果該條件是溫度條件，在所需要的溫度培養細胞。匯合一個或多個細胞單元群的匯合包括混合群體以產生單個的群體或匯合，其包括一種以上背景的細胞單元，即，已經暴露于一種以上不同種類的培養條件的背景細胞單元?？梢赃M一步隨機或非隨機地重分匯合成為群體；這種群體不是為了現成的目的而本身"匯合"，但是可以通過聯合，例如在暴露于不同種類的培養條件后而自身匯合的。增殖在此細胞生長和細胞增殖是可互換使用的，以表示細胞數目的增加而不是分化成為不同的細胞類型或譜系。換言之，該術語表示活細胞數目的增加。優選地增殖不伴隨有表型或基因型中的明顯變化。分化細胞分化是從不同細胞類型的細胞類型進行發育。例如，雙潛能、多潛能或全能細胞可以分化成為神經細胞。分化可以伴隨有增殖，或可以是獨立的。術語'分化'泛指從較少發育性限定的細胞類型獲得成熟細胞類型的表型，例如神經元或淋巴細胞，但是不排除轉分化，由此一種成熟細胞類型可能轉化成另一種成熟細胞類型，例如神經元到淋巴細胞。分化狀態細胞的分化狀態是細胞沿著特定的途徑或譜系分化的水平。細胞過程的狀態細胞過程的狀態是指無論是否發生或沒有發生細胞過程，以及在復雜的細胞過程中，可能表示該細胞過程中特定的步驟或階段。例如，細胞中的細胞分化途徑可以是非活化的或可能受到誘導，以及可以包括許多不連續的階段或組成，例如由存在特征性種類的酶或中間物而表征的信號事件。基因基因是 編碼基因產物，如多肽或RNA基因產物的核酸。如在此所使用的，基因至少包括編碼基因產物的編碼序列；它可以任選地包括一個或多個為編碼序列的轉錄和/或翻譯所必需的調節區域?；虍a物基因產物一般是由基因以常規的方式編碼的蛋白質。然而，該術語也包括非多肽的基因產物，例如核糖核酸，其由基因編碼。核酸合成可以根據任何可利用的技術合成核酸。優選地，核酸合成是自動的。此夕卜，可以通過生物復制產生核酸，例如通過在細菌或真核細胞中根據本領域已知的方法進行克隆和復制。差異表達可通過基因表達分析，例如在基因芯片上通過本領域已知的方法鑒定應答細胞培養條件而在不同水平表達的基因。在測試條件下的細胞比在備選條件下的細胞中差異表達的基因相對于總的基因表達水平顯示更多或更少數量的mRNA或基因產物。轉染可以通過任何適當的方式將基因轉染到細胞中。在此使用該術語以表示常規的轉染，例如利用磷酸鈣，但是也包括將核酸轉移到細胞中的其他技術，包括轉化、病毒轉導、電穿孔等。調節使用術語調節表示增加和/或減少被調節的參數。因此，基因表達的調節包括增加基因表達和降低基因表達?；诩毎姆治龌诩毎姆治鍪乾F代生物醫學科學的重要部分，包括對涉及使用細胞的步驟的任何分析。基于細胞的分析可用于跨越醫藥藥物發現和開發過程的幾乎所有階段，又在提供關于化合物如何在生物系統中相互作用，以及其如何與分離物中潛在的藥物靶標相互作用的信息中是有價值的。例如，基于細胞的分析可用于鑒定和驗證潛在的藥物靶物。已經開發基于細胞的分析來用于鑒定涉及疾病過程的基因或細胞途徑，用于確定靶基因的功能，或測量在活化某些基因或其產物后誘導的表型變化?；诩毎姆治鲆部捎糜趯ο葘Щ衔锏陌l現、選擇和優化的藥物發現。不同于經常被用于常規高通量篩選分析的生物化學分析，基于細胞的分析可提供關于藥物特性，例如吸收作用、滲透性、選擇性、特異性和代謝的信息。因此，更好地鑒定在基于細胞篩選后所選擇的先導化合物，更可能提供有價值的引導，并且更少可能在藥物發現過程的后繼階段中被除去?；诩毎姆治龅闹饕獞檬窃诙拘院Y選中。藥物發現和開發的決定性部分是藥物候選物的篩選，以除去可能產生副作用的化合物。然而，現在的方法大多是不夠的，特別是利用動物模型用于毒性篩選是費錢且費時的。此外，動物模型可能是不可靠的，因為這些模型中的結果不總是準確預測化合物將在人類中如何進行。因此基于人細胞的篩選是優選的。干細朐在 Stem Cells !Scientific Progress and Future Research Directions 中詳細描述了干細胞。Department of Health and Human Services.2001 年 6 月 http://www.nih.govlnews/stemcell/scireport.htm.在此引入該報告的內容作為參考。干細胞是能夠分化形成至少一種以及有時形成許多特化的細胞類型的細胞。可從干細胞形成的不同細胞的庫被認為是完全的；即它包括組成生物體的所有不同的細胞類型。從干細胞相對充足的早期胚胎到它們相對稀少的成體，干細胞在生物體的終生自始至終都存在。存在于成體動物的許多組織中的干細胞在正常的組織修復和體內平衡中是很重要的。這些細胞的存在增加了提供產生特化的功能性細胞來移植到人中和在疾病組織中替代死的或無功能細胞的方式的可能性。由此可以提供治療的疾病的列表包括帕金森氏癥、糖尿病、脊髓損傷、中風、慢性心臟病、晚期腎病、肝功能衰竭和腫瘤。為了使細胞代替治療成為可行的，在干細胞研究中需要至少兩個主要的突破。首先，需要開發使干細胞生長至足夠數目的條件，以便能夠制備治療相關劑量的細胞。理論上大規模的培養物可能為治療多數患者提供材料。其次，由于移植到動物中的未分化干細胞經常產生腫瘤，設想使干細胞分化成為更特化的細胞對于細胞代替治療將是首要的，因此它對于發現使干細胞分化成為不同疾病需要的特別特化的細胞類型的條件是必需的。很明顯克服這些障礙的關鍵是設計用于干細胞及其衍生物的細胞培養的合適方法。然而，由于上述闡明的理由，即涉及細胞培養技術發展的反復試驗的繁重過程，該任務是特別困難的。因此在此所描述的本發明的一個應用是說明用于干細胞生長和分化的技術。干細胞的類型關于什么構成干細胞仍然存在相當多的爭論，然而為了這些討論的目的，關鍵特征是能夠分化成為不同的細胞類型。如下列出干細胞的實例。不同的干細胞具有形成多種細胞類型的不同潛能:精子發生干細胞是單潛能的，因為它們只自然地產生精子，但是造血干細胞是多能的，而胚胎干細胞被認為能夠產生所有的細胞類型，是全能性或多潛能的。迄今為止已經分離了 3種類型的哺乳動物多潛能干細胞。這些細胞能夠產生通常來源于胚胎的所有3種胚層(內胚層、中胚層和外胚層)的細胞類型。干細胞的3種類型是:來源于睪丸腫瘤的胚胎性癌(EC)細胞；來源于植入前胚胎(通常為胚囊)的胚胎干(ES)細胞；來源于植入后胚胎(通常為將會成為生殖腺部分的胎兒細胞)的胚胎生殖(EG)細胞。正好因為它們是多潛能的，這些細胞在指導分化的作用中受到特別的注意。干細胞也存在于成 年生物體中。成年干細胞是存在于分化(特化的)組織中，對本身進行更新，并且能夠分化產生更特化細胞的未分化細胞。最近已經表明成年干細胞具有可塑性，即它們能夠分化產生具有不是其駐留的組織或組織起源的實際胚層的特性的細胞類型。例如，已經表明血液干細胞(來源于中胚層)能夠分化成為神經元(通常來源于外胚層)。Toma等人(2001, Nature Cell Biol.3, p778_784)最近已經描述了鑒定和分離來源于皮膚下真皮層的新型干細胞。定義這些干細胞是皮膚衍生的前體(SKP)細胞?？赏ㄟ^在聚賴氨酸上培養和變化培養基中血清的濃度誘導SKP細胞分化。當缺少血清時，它們分化成為神經元和膠質細胞；加入3%血清它們分化成為平滑肌細胞；增加血清至10%導致SKP細胞分化成為脂肪細胞。迄今為止已經報道成年的干細胞存在于各種組織中，如神經系統、骨髓和血液、肝臟、骨骼肌、皮膚和消化系統。除成年的干細胞之外，存在許多類型的祖代或前體細胞。這些細胞部分地限制了其分化潛能并且可能存在于所有的機體組織中，它們能夠分化但是不同于干細胞，因為它們的所有組成成分不是廣泛的，并且由于限制，它們不能自我更新。最近的證據甚至表明分化的細胞類型能夠改變表型。這個現象，被定義為轉分化，是分化的細胞類型在有或沒有介入細胞分裂下轉化為另一個細胞類型。先前普遍接受的是終端分化狀態是固定的，但是現在表明有時候分化可能是逆轉或改變的?，F在體外方法是可利用的，其中可誘導細胞系轉分化(參見Shen,Slack & Tosh 2000,Nature Biol, vol 2,p.879-887 Horb 等人，2003，CurrentBiol.Vol 13，pl05_115)。最后，已經報道特化的細胞類型可能去分化而產生具有分化成為進一步細胞類型的潛能的干樣細胞。干細朐的牛長和分化干細胞的重要特性是它們在培養中對稱分裂，產生2個子細胞的能力，該子細胞是其衍生的干細胞的精確拷貝。這容許干細胞在培養中以其未分化的狀態擴展，產生足夠用于生物研究甚至細胞治療的物質。隨著對個體的深入研究可理解干細胞能夠如此進行的方式，然而對于促進干細胞更新的因子知之甚少。一般地，多潛能的干細胞系保持在成纖維細胞的有絲分裂非活化的滋養層上，或這種細胞的培養基條件中。假定培養的細胞從培養基移出/中和一些未知的因子，和/或它們提供抑制干細胞分化和促進干細胞自我更新的因子。這種因子的一種是白血病抑制因子(LIF)，與IL-6相關的細胞因子家族成員，其當缺少飼養細胞時能夠促進小鼠ES細胞自我更新。在缺乏飼養細胞(和/或LIF)時生長的干細胞經常自然和不規則 地分化，產生分化細胞類型的混合物。影響干細胞自我更新的因子可能是刺激或抑制的，并且可能在胞外或胞內發揮作用。就分泌因子LIF來說，已知其胞外的受體是gpl30，而且該蛋白質的活化足以抑制鼠類ES細胞的分化。在細胞內，gpl30的重要下游效應物是轉錄-3的信號轉導物和活化物(STAT-3)。另一個對保持干細胞多潛能性特別重要的分子是轉錄因子Oct-4，當人工下調時其導致小鼠ES細胞中可塑性狀態的丟失。也已經闡明了天然抑制ES細胞自我更新的其他信號分子，例如促分裂原-活化的蛋白激酶。干細胞研究的主要目的是發現天然和合成的因子、藥物、多肽、基因、寡核苷酸、組織培養基和條件、特定處理的培養基、培養細胞、和對促進多種類型干細胞分化潛能的擴展和保持具有作用的其他刺激。這包括成年干細胞，目前其還沒有以細胞培養的方式進行可觀地擴展。干細胞研究的第二大挑戰是指導分化為特定的功能性的細胞類型，其能替代在多種疾病狀態中丟失的細胞，并且產生積極的臨床結果。誘導干細胞開始分化實際上是相當簡單的過程。例如，從培養的培養物移出并且在附著基質上生長匯合的ES細胞將開始自然地分化。類似地，從培養的培養物移出并且在非附著的基質上生長的ES細胞將從所有的3種胚層形成未分化的和部分分化細胞的胚狀體-簇?？呻S后分離這些細胞，接種為單層的培養物，并且暴露于促進直接分化的因子。與包括許多不同細胞類型的混合物的分化細胞的胚狀體或未處理的培養物相比，很可能通過很少類型的分化細胞增殖暴露于這些因子的培養物。盡管如此，即使有也是極少數設計了產生基本上純的分化細胞培養物的條件。此外還不清楚即使有設計用于干細胞分化產生適于細胞代替治療的細胞的任何方法，可能該細胞不能末端分化成為需要的準確表型，或分化的細胞在體內不再是有生存力的。已經用于誘導干細胞的直接分化的因子包括:視黃酸、表皮生長因子(EGF)、骨形態發生蛋白質(BMPs)、堿性的成纖維細胞生長因子(bFGF)、活化素-A、轉化生長因子β-1 (TFG β-l)、肝細胞生長因子、神經生長因子、sonic hedgehog (SHH)、白介素-3(IL-3)、白介素-6(IL-6)、粒性巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、促紅細胞生成素、維生素D3、地塞米松、β-巰基乙醇、丁基化羥基苯甲醚、5-氮胞苷、DMS0、胰島素、甲狀腺激素(T3)、LIF、胎牛血清、血管內皮生長因子(VEGF)、鋼化因子、氧濃度的變化、抗壞血酸、β-磷酸甘油、煙酰胺、血小板衍生生長因子(TOGF)、cAMP、多種細胞粘附分子和底物等。除這些限定的因子之外，很可能不限定提取物，例如條件培養基、人和動物組織的勻漿物、或植物提取物，都可用于指導干細胞分化。這些不定提取物的漸進性分級分離可以產生活性部份或具有高效力的更純的成分?？蓪⑦@些因子單獨或組合或以對實驗結果至關重要的限定順序的方式加入用于特定實驗的生長培養基。已經設計用于體外干細胞分化的許多系統是復雜的多階段步驟，其中多種步驟的準確特征以及多種步驟的時序是重要的。例如，Lee等人(2000, Nature Biotechnology,vol.18, p 675-679)使用5階段的方案從小鼠ES細胞衍生出多巴胺能神經元:1)使未分化的ES細胞在涂有白明膠的組織培養表面上在ES細胞培養基中，在存在LIF時擴展；2)在ES細胞培養基中懸浮培養4天產生胚狀體；3)nestin-陽性的細胞選自在組織培養表面上接種8天后的ITSFn培養基中的胚狀體；4)在含有bFGF/層粘連蛋白的N2培養基中擴展nestin-陽性細胞6天；5)最后通過從含有層粘連蛋白的N2培養基取出bFGF誘導擴展的神經元前體細胞分化。在連續細胞培養的第二個實施例 中，Bonner-Weir等人[Proc.Natl.Acad.Sc1.(2000)97 =7999-8004]從人胰管細胞得到產生胰島素的細胞:1)通過在存在血清2_4天時選擇性粘附在固體表面上而從胰島細胞選擇導管細胞；2)隨后取出血清并向成纖維細胞的導管上皮細胞加入角質化細胞生長因子5-10天；以及3)用胞外基質制品'Matrigel'覆蓋細胞3-6周。在連續細胞培養的另一個實施例中，Lumelsky等人[Science (2001) 292:1389-1394]通過直接分化小鼠胚胎干(ES)細胞衍生出分泌胰島素的細胞:1)在存在LIF時擴展ES細胞2-3天；2)在缺乏LIF4天中產生胚狀體；3)利用ITSFn培養基選擇nestin-陽性細胞6_7天；4)在含有B27培養基添加劑和bFGF的N2培養基中擴展胰腺的內分泌前體6天；以及5)通過取出bFGF并加入煙酰胺誘導分化為分泌胰島素的細胞。然而不只是多種步驟的順序和持續時間或加入不同因子的系列對于決定細胞分化是重要的。因為胚胎發育受到透露定位信息的信號因子梯度作用的調節，所以預期單個信號因子的濃度，以及兩個或多個因子的相對濃度在體外和體內指定細胞群體的命運中是重要的。因子濃度在發育期間發生變化，干細胞對于相同分子的不同濃度產生不同的應答。例如，從晚期胚胎的CNS分離的干細胞對不同濃度的EGF產生不同的應答:EGF的低濃度產生增殖的信號，而EGF的高濃度產生增殖和分化為星形膠質細胞。已經被發現體外影響干細胞的自我更新和分化的許多因子是天然存在的分子。這是可以預期的，因為通過沿著信號轉導途徑起作用的信號分子和受體誘導和控制了分化。然而同理，很可能許多合成的化合物對干細胞分化具有影響。通常人工合成這種在信號和信號轉導途徑內具有與細胞靶物(也稱為藥物靶)相互作用的高度可能性的合成化合物，例如用于醫藥公司的藥物篩選。一旦已知這些化合物可用于自體內指導干細胞的分化，或可用于體內給藥，在這種情況下它們將對患者靶器官中的固有干細胞起作用。組織培養中的常見變化在開發用于成功培養特定細胞類型的條件中，或為了實現或調節細胞過程，考慮多種因素通常是很重要的。一個重要因素是判斷是否懸浮增殖細胞或以附著于基質的單層增殖細胞。大多數細胞優選附著于基質，而一些細胞，包括轉化的細胞、造血細胞和來自腹水的細胞可懸浮增殖。假定是貼壁細胞的培養，一個重要因素是選擇粘附基質。大多數實驗室使用一次性的塑料作為用于組織培養的基質。已經使用的塑料包括聚苯乙烯(最常見的類型)、聚乙烯、聚碳酸酯、有機玻璃、PVC、特氟隆、玻璃紙和醋酸纖維素。可使用任何塑料，但是其中許多塑料需要處理以使得它們可潤濕并且適于細胞附著。此外可使用任何適當制備的固體基質提供細胞的支持物，目前已經使用的基質包括玻璃(例如明礬-硅酸硼和鈉鈣玻璃)、橡膠、合成纖維、聚合的葡聚糖、金屬(例如不銹鋼和鈦)等。一些細胞類型，例如支氣管上皮細胞、血管內皮、骨骼肌和神經元需要涂有生物制品的生長基質，通常為胞外基質材料例如纖粘連蛋白、膠原、層粘連蛋白、多溶素等。生長基質和應用方法(濕或干的涂 布、或凝膠)可能對細胞過程，例如細胞的生長和分化特性有影響，而這些必須如上所述憑經驗確定?？赡芗毎囵B中最重要的變化因素是培養基和補充物，例如血清的選擇。這些為細胞生長提供了含水的間隔，以營養物和多種因子實現，其中一些已經在上文列出、其它的則很少有限定。一些因子對粘附是必不可少的，其它對傳遞信息必不可少(例如激素、促分裂原、細胞因子)，而其他的可作為解毒物。通常使用的培養基包括RPMI1640、MEM/Hank' s 鹽、MEM/Earle' s 鹽、F12、DMEM/F12、L15、MCDB 153 等。多種培養基在其成分中具有很大的差別，一些常見的差異包括碳酸氫鈉濃度、二價離子的濃度，例如Ca和Mg，緩沖液組成、抗生素、微量元素、核苷、多肽、合成的化合物、藥物等。已知不同的培養基是選擇性的，指它們只促進一些細胞類型的生長。培養基補充物，例如血清、腦垂體和其他提取物，經常對培養物中細胞的生長是不可缺少的，此外經常對決定培養物中細胞的表型負責，即它們能夠決定細胞的生存或直接分化。例如分化的細胞過程中補充物的作用是復雜的，并且取決于它們的濃度、它們加入培養物的時間點、細胞類型和所使用的培養基。這些補充物的不確定特性及其對于細胞表型影響的潛能刺激了無血清培養基的發展。對于所有的培養基，如上所述主要通過反復試驗進行它們的開發。組織培養的氣相態是同樣重要的，并且應使用的其組成和體積可能取決于所使用培養基的類型、需要的緩沖數量、培養瓶是否是敞開或密封的、以及特定的細胞過程是否需要調節。常見的變化包括二氧化碳和氧的濃度。對組織培養重要的其他條件包括選擇培養容器、罐頂空隙量、接種密度、溫度、培養基變化的頻率、酶處理、振蕩或攪拌的速率和模式。因此變化細胞培養條件是獲得所需要細胞過程的方法。本發明的一個方面認識到連續方式中細胞培養條件的變化可能是獲得細胞效應的卓有成效的方法。在多種應用中，例如在細胞分化的研究中，經常需要特異的連續不同的組織培養條件以作用于細胞過程。不同的條件可包括向/從培養基進行加入或取出或在特定的時間點變化培養基。如下給出這類條件的實施例，通常是如上所述通過反復試驗而發展出來的。細胞單元的形成本發明的一個重要方面是細胞群(細胞集落)能夠在多種條件下生長在細胞培養物中，并且當受到干擾以及當與其他集落混合時該集落可在多種條件下基本上保持其完整性。這種群體或集落在此稱為細胞單元?？山浻衫C說明，通過使細胞在例如載體的固體基質上附著培養生長來實現細胞單元的形成。如果細胞增殖發生在接種于載體上后，子細胞將附著在相同的載體上并且形成相同集落的部分。一般，活的貼壁細胞不是容易地從其生長基質上分離的，因此不管對載體進行任何機械操作、振蕩培養基、或轉移到另一個組織培養系統中都可持續該細胞集落的完整性。類似地，如果任何時候多數載體處于相同的容器中(例如匯合珠子)，將沒有細胞從一個珠子實質性的轉移到另一個珠子。在單元或集落中生長細胞的一個優點是如果將單元連續地置于一組不同的組織培養基中，包括該集落的所有細胞將按相同的順序和相同的時段暴露于相同的系列培養條件。使細胞在不一定本身附著于組織培養容器的單元中生長有下列好處，即能夠隨意移出個別集落并轉入不同的培養容器。該方法的一個優點是能夠最小化組織培養:即使與最小的組織培養瓶相比，只需要相對很少的細胞來建立微載體珠子克隆(參見下文)。在載體上形成生長細胞單元的進一步的優點是能夠擴大細胞培養的規模。在載體上生長干細胞提供了擴大生產規模以提供足夠用于干細胞治療的材料的方法。同樣地，在載體上分化干細胞提供隨分化進行而擴大生產規 模，最后提供足夠用于細胞替代治療的材料。這種細胞培養的規模擴大需要至少50g (干重)的微載體，優選100g、500g、lkg、10kg或以上。在固體基質上形成細胞單元的另一個重要優點是可通過多種方式標記由于締合而附著細胞的基質。已經廣泛使用3_和5_的玻璃珠作為細胞粘附的基質，特別是在使用玻璃珠生物反應器(例如由Meredos Gmbh制造)來擴大細胞培養的規模時。這些珠子一般被用于分層包裝而不是分批培養，避免對貼壁細胞造成機械損傷。相比之下，當細胞在較小的載體上生長時它們可當做懸浮培養物。在小的載體上生長細胞的常見方法被稱為微載體細胞培養(參見'Microcarrier cell culture,Principles and Methods1 , Edition AA,可從Amersham Biosciences (18-1140-62)獲得；在此全部引入作為參考)。商業上使用微載體培養用于在多達4000升的發酵罐中生產抗體和干擾素。各種微載體都是有效的，無論其形狀和大小以及由不同的材料制成。其中由聚苯乙烯(Biosilon, Nunc)、玻璃(Bioglass, Solohill Eng)、膠原(Biospheres, SolohillEng)、DEAE 交聯葡聚糖凝膠(Cytodex-1, Pharmacia)、葡聚糖(DormacelI, Pfeifer &Langen)、纖維素(DE-53, Whatman)、白明膠(Gelibead, Hazelton Lab)、和 DEAE 葡聚糖(Microdex7Dextran Prod.)制成的微載體珠子是可商業購買的。根據珠子的相對密度、直徑和適于細胞生長的表面積可很好表征這些載體。此外可利用許多具有極大增加細胞生長的表面積的多孔(微)載體。這些多孔載體的進一步特征是它們適合于錨定依賴性的細胞以及懸浮細胞的生長，這些細胞通過滯留在開放的連通的孔的網絡中而被攜帶。多孔載體可利用的材料是例如白明膠(Cultispher G, HyClone)、纖維素(CytocelI, Pharmacia)、聚乙烯(Cytoline I 和 2, Pharmacia)、娃橡膠(Immobasi I, Ashby Scientific)、膠原(Microsphere, Cellex Biosciences),和玻璃(Siran, Schott Glassware) 這些載體是分別適合于攪拌、流化或固定床培養系統的。由于載體的物理性能是已知的，很容易計算用于實驗的載體的數目。所述的一些載體和除此之外的許多載體有效的，其作為干制品可準確地稱重，并隨后通過在液體培養基中膨脹而制備。此外用于接種在微載體培養中的細胞數目是可以計算并進行變化的。例如，以每個珠子接種6個細 胞的Cytodex 3 (2g/升)的培養將產生包含8百萬個微載體的培養物，其中以5X IO4個細胞/cm2的密度生長4千8百萬個細胞/升?？赏ㄟ^細胞的酶促脫附，和/或通過合適的載體消化來收獲在微載體上生長的細胞，或從微載體釋放標記(參見下文):可通過胰蛋白酶和/或EDTA溶解白明膠載體，利用膠原酶溶解膠原載體以及利用葡聚糖酶溶解葡聚糖載體。除固體或多孔的微載體之外，可通過禁閉，即限制在培養基可滲透屏障物的范圍內來分群細胞。已經開發了膜培養系統，其中可滲透的滲析膜保留細胞群體，但是容許培養基及其成分在內部和外部的間隔進行自由交換。也已經開發了在空心纖維柱體中的細胞培養，大量的纖維以及全部完整的系統都是可商業購買的(例如來自Amicon，CellexBiosciences)。也已經開發了在半固體基質中的細胞包封，其中通過吸附、共價鍵、交聯或滯留在聚合物基質中使細胞固定。已經使用的材料包括白明膠、聚賴氨酸、藻酸鹽和瓊脂糖。一般的方法是在40°C將5%瓊脂糖與在正常生長培養基中的細胞混合，利用等體積的石蠟油使該混合物乳化，在冰浴中冷卻產生直徑為80-200 μ M的球狀物?？蓮挠皖惙蛛x這些球狀物并轉入組織培養容器中的培養基中。細胞截留是用于固定細胞群的簡單方法，類似于利用微載體或多孔的基質。簡單的技術是使細胞陷入纖維素纖維，例如DEAE、TLC、QAE、TEAE (所有的都獲得自Sigma)中。其他更改進的裝置是如Opticel培養系統(Cellex Biosciences)中的適合于懸浮細胞的陶瓷柱體。除上述產生細胞單元的方法之外，本領域的技術人員將設想其他產生細胞群的方法，包括形成細胞的3D培養物，例如神經的球狀物或胚狀體、或利用組織和實際上完整的生物體，例如果蠅或秀麗線蟲。細胞單元或包括細胞單元的基質可能與特定的因子相關，包括但不限于蛋白質、核酸或其他化學品，例如藥物。可通過許多途徑實現基質的預處理，例如僅僅通過使基質與目標因子孵育，或通過共價或非共價地使因子附著于基質?？赏ㄟ^浸透使可溶性因子結合到干燥材料中。這個技術依賴于攜帶可溶性因子的液體快速進入干燥的多孔材料，其附隨地變得溶脹而隨時可使用?？稍谛纬珊幸蜃拥睦w維蛋白凝塊時，通過在凝血酶溶液的纖維蛋白原中混合因子而摻入固體因子。除浸滲之外可設計使因子與細胞群締合的多種其他方法來截留或包封與細胞一起的因子。
用于使細胞群與許多不同因子締合的方法是預先形成因子的混合物，隨后與特定的細胞群締合。第二個方法是以許多因子連續地處理細胞群。利用細胞群生長基質的干燥制劑舉例來說，這個方法包括首先在包含第一因子的溶液中部分地溶脹該基質，隨后進一步地在包含第二因子的溶液中進行相同溶脹，使兩個因子都與基質締合。通過設計使細胞群與不同因子的不同組合締合的系統性方法，可能取樣檢查任何組合的一組因子對細胞群的影響。不考慮用于處理細胞單元與因子的方法，該因子被包括細胞單元的細胞吸收。稀釋滲入生長培養基的因子達到這樣的程度以至它們的濃度低于生理學相關的限制并且它們對任何接觸的附加細胞群無效。在例如基質外分散的因子成為細胞單元的一部分取決于下列參數，例如材料的特性和大小、平均孔徑、以及因子的分子量和濃度。必要時為了校準該過程，可通過物理的分析，例如HPLC分析或標記因子到培養基中的釋放、或通過生物測定，例如針對神經營養 性因子的脊神經后根神經節長出的生物測定來測量因子的釋放。細胞的組合連續培養分開-匯合的細胞培養此外形成細胞單元(特別是顯微的細胞單元)可用于取樣多重組織培養條件，因為各個細胞單元構成可暴露于各種細胞培養條件的容易處理的單元。為簡單起見，在討論中我們假定細胞群是通過在微載體培養中生長而產生的，并且術語細胞單元、細胞群、集落和珠子可互換地使用。然而，所述的方法同樣地適用于任何細胞單元，例如如上所述的細胞單元。用于取樣大量細胞培養條件的特別有效的方法被稱為組合的細胞培養或分開-匯合的細胞培養(圖1和2)，在一個實施方案中，包括為了取樣多重組合的細胞培養條件連續的重分并組合細胞單元群。在本發明的一個方面，操作方法為將最初的起始培養物分成Xl數目等分的細胞單元(或不同的起始培養物)，其各自包含分別在不同的培養條件下生長的多個珠子(群體/集落/載體)。細胞培養給定的時間后，通過組合和混合來自不同等分的珠子而匯合細胞單元。這個匯合可再次分開成為X2數目等分，各自在不同的條件下培養一段時間隨后再匯合。這個分開、培養和匯合細胞單元(或匯合，分開和培養；取決于在何處進入循環)的重復步驟容許系統取樣許多不同細胞培養條件的組合。實驗的復雜性，或換言之不同待測試細胞培養條件組合的數目等于在每輪中取樣的不同條件的數目的產物(X1XX2X...Xn)。注意在隨后的分開前匯合所有細胞單元的步驟可以是任選的，其中匯合有限數目的細胞單元，這可能具有如圖3和4中所說明的相同的效應。因此本發明包含許多系統地取樣細胞培養條件的多重組合的相關方法，其中成批地處理細胞單元群。不考慮用這種方法取樣多種細胞培養條件的精確方式，該方法都是有效的，因為多重細胞單元可共享單個容器，它們在相同條件下培養，并且可在任一時刻只利用少量的培養容器進行培養(所使用的培養容器的數目等于分開取樣的數目)。在許多方面這個方法的原理相似于大型化學文庫的分開合成(被稱為組合化學)，其中取樣在化學品結構單元群之間結合的所有可能的組合(參見例如！Combinatorial Chemistry, OxfordUniversity Press (2000), Hicham Fenniri (Editor))?？芍貜头珠_-匯合的細胞培養許多輪，并且可在每一輪中取樣任意數目的條件。只要細胞單元的數目(或在這個實例中為集落化的珠子)大于或等于所有輪中取樣的不同條件的數目，并且假定細胞單元的分開完全隨機發生，預計通過實驗將取樣到至少一個已經按照多種培養條件組合中的一種培養的細胞單元。這個方法可用于取樣對于任何細胞類型的生長或分化條件，或由任何細胞類型生產生物分子(例如生產促紅細胞生成素或干擾素)的效率。因為該方法是重復的，理論上它適合于測試多級的組織培養方法，例如如上所述與干細胞分化相關的方法。利用這個技術可取樣的變化包括細胞類型、細胞群(例如微載體培養、細胞包封、完整的生物體)、生長基質(例如微載體上有纖粘連蛋白)、細胞培養一輪的持續時間、溫度、不同的培養基(包括成分的不同濃度)、生長因子、條件培養基、多種細胞類型的共培養(例如飼養細胞)、動物或植物提取物、藥物、其他的合成化學品、用病毒感染(包括轉基因的病毒)、加入轉基因、加入反義或抗基因的分子(例如RNA1、三鏈螺旋)、感覺輸入(就生物體來說)、電、光、或紅外刺激等。分開-分開的細胞培養對細胞單元進行分開匯合過程的目的是將這些細胞單元有系統地暴露于預定的條件組合。本領域的技術人員將設想許多不同的方式來達到這些結果。除分開-匯合過程及其變化之外，也值得簡要地論述分開-分開過程。分開-分開過程包括至少重分細胞單元群兩次，而不插入細胞單元的匯合(圖5)。如果將分開-分開過程進行很多輪，產生的分離樣品的數目按指數增加。在這種情況下重要的是使用一些自動操作水平，例如利用機器人平臺和改進的取樣追蹤系統。分開-分開步驟的優點是(因為不組合細胞單元)有可能根據細胞培養歷史分離多種細胞單元的譜系。因此分開-分開步驟可用于推導是否特定的細胞培養條件決定了任何產生的細胞過程并因此用于推導細胞單元的培養歷史(在圖6中說明，并且在'細胞單元培養歷史的確定'下詳細說明)。預定的方法可完全隨機地或可按照預定的方法完成細胞單元的分開和/或匯合。細胞單元在何處隨機分開和/或匯合，給定細胞單元在何處分離成為任何群體不是能以任何方式預定或預見的。為了產生使至少一個細胞單元暴露于細胞培養條件可能組合的每一種的高可能性，使用大于待測細胞培養條件組合的總數的細胞單元數目是有利的。因此在某些情況下根據預定的方法分開和/ 或匯合細胞單元是有利的，防止了組合的偶發重復或遺漏的總的效應?？深A先選擇性地計劃細胞單元的預定處理并且記錄在電子數據表或計算機程序上，利用自動方法，例如機器人執行分開和/或匯合的操作?？赏ㄟ^任何方式標記細胞單元(參見下文)，例如通過RFID、光學標記物或空間編碼進行標記。機器人裝置能夠確定取樣的同一'I"生，因此根據預定的方法區分樣品，這已經有描述(參見'Combinatorial Chemistry,Apractical Approach' , Oxford University Press (2000), Ed H.Fenniri)。備選地，標準的實驗室流體處理和/或組織培養機器人(例如由Beckman Coulter Inc,Fullerton,CA ；The Automation Partnership, Royston, UK制備)能夠空間地編碼多重抽樣的同一性，并根據既定程序的方法對其進行加入、除去或移位。細胞單元的分析和/或分離在每輪細胞培養后，或在限定的輪數后，可研究細胞單元以觀察可能受到組織培養條件影響而產生的任何細胞過程。下文的實例是例證性的而非意在限制本發明的范圍。在每輪細胞培養后，或在限定的輪數后，可分析細胞單元以確定是否存在成員顯示增加的細胞增殖。這可通過各種技術實現，例如在顯微鏡下目測檢查細胞單元，或測定細胞的標記產物特征。這可以是內源的標記物，例如特定的DNA序列、或可通過配體或抗體檢測的細胞蛋白質。備選地可將外源的標記物，例如綠色熒光蛋白(GFP)導入細胞單元進行測試以提供特定(活)細胞讀數?？衫酶鞣N活體染色劑顯像活的細胞，或相反地利用各種方法，例如利用碘化丙錠標記死細胞。此外可通過各種技術人工和自動化的從未標記的細胞單元分離標記的細胞單元，包括親合純化('淘選')，或通過突光激活細胞分揀法(FACS)或廣泛相似的技術(圖16)。根據應用可使用標準的實驗室設備，或可能使用特殊的測試設備是有利的.例如，某些分析和分揀儀器(例如參見Union Biometrica Inc.,Somerville MA,USA)具有達到I毫米的流通細胞直徑，其容許流通分揀直徑達到500微米的珠子。這些儀器提供珠子大小和吸光度以及來自標記物例如GFP、YFP或DS-紅的2種熒光發射波長的讀數。每小時180，000個珠子的分揀速度和分配進入多孔平板或進入批量受體都是可能的。在每輪細胞培養后，或在限定的輪數后，可測試細胞單元以確定是否存在成員顯示特定的基因型或表型?？衫霉募夹g進行基因型確定，例如聚合酶鏈式反應(PCR)、熒光原位雜交(FISH)、DNA測序等?？赏ㄟ^各種技術進行表型確定，例如在顯微鏡下目測檢查細胞單元，或檢測細胞的標記產物特征。這可以是內源的標記物，例如特定的DNA或RNA序列，或可通過配體、酶底物的轉化、或識別特定表型的標記物而檢測的細胞蛋白質(例如看見 Appendix E of Stem Cells !Scientific Progress and Future ResearchDirections.Department of Health and Human Services.2001 年6 月；附錄在此引入作為參考)。遺傳標記也可以是外源的，即已經例如通過轉染或病毒轉導而導入細胞群體的遺傳標記。外源標記物的實例是熒光蛋白質(例如GFP)或通常不在特定細胞譜系中表達或修飾表位、或來自不同種屬的細胞表面抗原。與轉錄調控元件結合的轉基因或外源標記基因可以反映代表內源基因特征的模式的方式表達。這可通過使基因與最小的細胞類型特異的啟動子締合，或將轉基因整合到特定的基因座中而實現(例如參見歐洲專利號EP 0695351)?？赏ㄟ^各種技術人工和自動化的從未標記的細胞單元分離標記的細胞單元，包括親合純化('淘選')，或通過突光激活細胞分揀法(FACS)。Nishikawa等人(1998,Development vol125，pl747-1757)使用由抗體識別的細胞表面標記物追蹤全能性鼠ES細胞的分化。利用FACS能夠鑒定和純化處于各種分化階段的造血系統的細胞。

用于富集特定基因型或表型的細胞單元的備選或補充技術是遺傳選擇所需要的群體。這可例如通過將可選擇的標記物導入到細胞單元中并分析在選擇性條件下的存活力而實現，例如參見Soria等人(2000, Diabetes vol 49, pl_6),其使用這種系統從分化的ES細胞選擇分泌胰島素的細胞。Li等人(1998，Curr Biol vol 8，p 971-974)通過在鼠ES細胞中經同源重組將雙功能的選擇標記/報告子β geo (提供β -半乳糖苷酶活性和G418抗性)整合到Sox2位點中來鑒定神經祖代。因為神經祖代的一個特征是表達Sox2，因此可在利用視黃酸誘導分化后通過添加G418而從非神經元系統選擇整合標記基因的這些細胞?？赏ㄟ^在顯微鏡下觀察，或通過監測β-gal活性來確定細胞成活力。不同于可通過利用合適的配體或抗體的基于表型的選擇方式，遺傳選擇可應用于任何差異表達的基因。確定細胞單元的同一性或細胞培養歷史當處理大量細胞單元時，它們的同一性和/或細胞培養歷史(例如任何一個群體或單元可能已經接觸的一系列培養條件的時序和準確特性)可能變得混亂。例如，細胞培養的分開-匯合方法必定包括在每輪中混合細胞單元，使得難以追隨個別單元。確定已經經受多重培養條件的細胞單元混合物中細胞單元的細胞培養歷史有時被稱為細胞培養歷史的，反演，。進行這個過程的一個方法是標記細胞單元，因此標記細胞單元是有利的?？稍趯嶒為_始時，或在每輪實驗期間進行標記，并且可以包括獨特的標記(在實驗的過程中可以或未必進行改進)或包括獨特聚集物的一系列標記。類似地，在每輪實驗期間或僅僅在實驗結束時進行標記的讀取。優選地，在每輪期間讀取獨特的標記，例如RFID標記，而在實驗結束時讀取在每一輪連續加入的標記。可通過各種方式實現細胞單元的標記，例如標記細胞本身，或細胞附著或與之關聯的任何物質。任何化學品和用于編碼合成的組合文庫的非化學方法可能適宜這個目的，一些在 Methods in Enzymology Vol 267(1996), 1 Combinatorial Chemistry1 ,John N.Abelson(Editor) ；Combinatorial Chemistry, Oxford University Press (2000),Hicham Fenniri (Editor) ;K.Braeckmans 等人，'Scanning the code' , Modern DrugDiscovery (2003 年 2 月)；Κ.Braeckmans 等人，'Encoding microcarriers:Present andFuture Technologies' ；Nature Reviews Drug Discovery, vol.1, p.447-456 (2002)中有描述，其所有的在此引入作為參考。下列是一些標記法的實例。一個標記細胞單元的方法包括使細胞單元與標記物聯合，該標記物在處于不同的培養條件中時序貫發生變化。這可能包括例如向標記物加入或減少進一步的單元以使得其立體化學、序列或質量發生改變；或讀寫RF轉發器的電子儲存發生變化(參見下文)。另一個標記細胞單元的方法包括每當在不同的條件下培養時連續地使獨特的標記物與細胞單元聯合，以使得標記物的后繼檢測和鑒定提供已經接觸細胞單元的細胞培養條件的時序和同一性的明確記錄。標記物可能由細胞吸收，或通過吸附作用、或合適的配體或抗體、或結合細胞-締合的基質，例如吸附的載體、膠體力或各種結合，例如共價鍵或非共價鍵，例如生物素-鏈霉抗生物素結合而附著于細胞表面。例如，可導入細胞或附著于與細胞締合的基質的一個簡單標記物是限定長度和/或序列的寡核苷酸。寡核苷酸可包括任何種類的核酸(例如RNA、DNA、PNA、線性的、環狀的或病毒的)，并且可能包含用于擴增的特異序列(用于PCR的引物序列)或用于檢測的標記(例如熒光基團或淬滅劑、或同位素標記物)。這些標記的檢測可以是直接的，例如通過對oligos進行測序或使其與互補序列雜交(例如在陣列或芯片上)，或是間接的，例如通過監測編碼寡核苷酸的基因產物、或核苷酸對細胞活性的干擾(例如特定基因的反義抑制)。擴增核酸的有利方法是滾動循環擴增(RCA ；2002,V.Demidov, Expert Rev.Mo 1.Diagn.2 (6), p.89-95)，其中核酸標記物可包括RCA模板、延伸引物、或幫助環化小環模板的支持物)。
可使用任何分子或大分子的標記物，只要其能被檢測，包括肽標記物、顏色或熒光化合物、仲胺、鹵化碳、穩定同位素的混合物等。標記物可以直接或借助于中間物而附著于細胞單元，例如針對細胞單元成分產生的抗體，或借助于相互作用的對，例如生物素-鏈霉抗生物素。此外可以通過細胞培養的成分，例如化學品或其他修飾或通過包封而防止標記物降解?？稍谠S多不同的培養基，例如在珠子中進行標記物的包封，許多類型的珠子可從例如Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN, USA)的供應商獲得,并且除提供用于標記物擴增和/或檢測(例如提供為DNA標記所用的PCR引物)的成分之外，包封可用于標準化標記物的劑量。標記細胞單元的優選方法是使用突光珠子，例如由LuminexCorporation (Austin, TX, USA)制造的珠子。Luminex系統包括聚苯乙烯珠子,其可以或未必是外部衍生化的(例如用抗生物素蛋白或抗體)，其內部用不同比率的2種光譜的不同熒光基團染色，以及能夠表征每個珠子的光譜特征的閱讀儀。進一步優選的方法是使用例如由Bangs Laboratories Inc.(Fishers IN,USA)制造的珠子。Bangs系統包括能夠根據不同大小而鑒別的珠子種類(例如4.4μ M和5.5 μ M直徑的珠子種類)。而且每套內的珠子相互之間根據由于差異負載有單個的熒光染料產生不同的熒光強度而可以是不同的。有可能使用許多具有不同吸收作用或發射特性的不同染料，其可以是通過許多方式內部加載或外部附著于載體的。而且可使用，量子點^以獲得可方便讀取的極高數量的不同熒光。細胞生長基質，例如所述的與形成細胞單元有關的基質可以是衍生化的或涂有便于標記并且不防礙細胞生長的物質。衍生化載體的優選方法是用生物素共價或非共價地加以修飾，使標記物能夠借助于鏈霉抗生物素或抗生物素蛋白進行附著。通常使用本身不會誘導細胞效應(即惰性標記物)，而且能夠不同于存在于細胞單元或培養基中的分子，能夠附著于其靶物并且隨后在這種分子的背景中被檢測到的標記物是很重要的。為了便于檢測，從細胞單元有選擇地洗脫標記物或利用選擇性的條件從細胞單元脫落細胞可能是有利的。也可預計更復雜的分子標記策略，包括^雙體編碼，的策略，其中通過指定到一組分子標記物及其混合物的一組雙體密碼子來記錄信息。標記物的檢測可伴隨有本領域技術人員已知的各種方法。這些方法包括質譜、核磁共振、測序、雜交、抗原檢測、電泳、分光術、顯微術、圖像分析、熒光檢測等。特別感興趣的是其中只進行一次標記或標記和/或檢測是非身體性的而因此是非侵入性的標記或編碼策略。射頻鑒定(RFID)是顯示這些特性的系統的實例。RFID使用轉發器(RF標記物)、天 線和讀取儀。RF標記是小的電子線路，通常包裹在玻璃或塑料中，其中以最簡單的形式通過合適的電子設備提供可以，讀取，的獨特代碼的入口，而不需接觸或視線。標記也可儲存由使用者產生的信息，也不需要接觸或觀測線。'讀取儀'是往返于一個或多個標記物轉移信息的電子單元(應該注意到術語讀取儀可互換地用于指只讀和讀/寫單元)。讀取儀的大小和構造可以進行相當大的變化，并且可以分離或連接遠程計算機系統的方式進行操作。使用天線來將信息從讀取儀傳送到標記物，并且接收由RF標記物發送的信息。天線的大小和規格形式將反映特定的應用，可以從小的圓形線圈變化到大的平面構造。RFID系統可以分離或連接遠程計算機的方式進行操作，來用于對來源于標記物的同一性和相關數據進行更廣泛的譯碼和操作。用于組合化學的一個RFID策略在 Nicolaou 等人(1995, Angew Chem Intl Ed Engl, vol.34p.2289)中有描述，并且包括:
(i)包含合成基質和半導體標記物的多孔包裹體；(ii)固相合成樹脂；(iii)玻璃-包裹的單個或多個可訪問的射頻標記半導體單元，其能夠接收，儲存和發射射頻信號。僅僅通過用組織培養微載體或合適的細胞單元替代固相合成樹脂的類似裝置可適合于生長和追蹤細胞單元?？深A計這個策略的更多變化，包括但不限于其上直接生長細胞的(涂覆或未涂覆的)RF標記物、或植入到細胞單元或生物體中的射頻標記物。這種標記物最初未必通過其化學或分子結構而加以鑒別?？稍O計非化學標記策略的多重變化以確定混合物中給定細胞單元的同一性或推導包括混合物的不同細胞單元的身份。例如已經描述了標記的光學或目測法，其中以不同形狀的物體、編碼圖形的物體或不同的顏色表示樣品的身份(例如參見1998, Guiles等人，Angew.Chem.1ntl Ed Engl,vol.37, p926 ；Luminex Corp, Austin TX, USA ；BD Biosciences ；Memobead Technologies,Ghent, Belgium)，或其中將圖案或條碼蝕刻到例如陶瓷棒的基質上并且利用圖形識別技術進行識別(例如參見 1997,Xiao 等人,Angew.Chem.1ntl Ed Engl, vol 36,p780 ；SmartBeadTechnologies, Babraham,英國)。追蹤或標記細胞單元的進一步方法是空間地，即通過其空間位置編碼它們的身份。在這個方法中，在限定的相對位置分離不同的細胞單元，這些位置表示或編碼單元的身份。例如，可以在陣列中培養細胞單元，借此了解每個單元的身份和/或培養歷史并且使其與陣列中特定的位置相關。通過其最簡單的形式，這種陣列能夠包括組織培養瓶、多孔平板的孔或載玻片或其他表面上定位的采集。可在Geysen等人(1984,Proc Natl Acad SciUSA vol.81，ρ.3998-4002)、Fodor 等人(1991，Science vol.251，p.767-773)、Ziauddin和 Sabatini (2001，Nature，Vol.411，ρ.107-110)、以及 Wu 等人(2002, Trends Cell Biol.Vol.12(10，p.485-8)中發現定位編碼策略的實例。本發明具有具有許多方面，每個可能具有許多形式，可以將其合并形成本發明的許多改變。顯而易見的是，為了能夠推導關于來自細胞培養方法組合的輸出結果的信息而標記所有細胞單元不是必需的。因此不標記細胞單元仍然可以根據本發明分析細胞培養條件的大量組合，并且確定這些組合的一種或多種是否能夠產生特定的細胞效應。然而優選細胞單元是標記的。細胞單元的標記容許與所有的細胞單元對照，從考慮到通過標記細胞單元而取樣的特定條件結果的實驗推導有用的信息。備選地，有時標記全部暴露于某一培養方法的一個或幾個細胞單元群體是有利的，例如在特定的分開或匯合步驟期間，已經分離到相同培養基中的細胞單元群。明顯的是，標記某些細胞單元容許推斷其他細胞單元(或許是未標記的)的身份。類似地，顯然進行省略了多種條件的細胞培養試驗可以產生關于相對于特定實驗性結果的那些條件的應用的信息。因此在某種意義上可能根據本發明通過許多次地重復實驗，每次省略不同類的條件來評估每個取樣的條件。也可使用分開-分開的細胞培養步驟來確定特定種類的條件對實驗性結果的效應。有效的分開-分開步驟導致已經在分支的時候各自暴露于獨特細胞培養條件的細胞單元形成特定的譜系。通過 研究不同的譜系，有可能相對于特定的實驗性結果確定在分支點研究的組織培養條件的用途(圖6)。在下文的實施例中進一步描述本發明。實施例實施例1-利用分開-匯合的細胞培養分化ES細胞單元為了分析可能產生多巴胺能表型的神經元的組織培養條件，利用未分化小鼠ES細胞的起始培養物進行分開-匯合的培養試驗。在存在1，400U πιΓ1的白血病抑制因子(LIF ;Chemicon)時，在由補充有15% FCS、IOOmM MEM非必需氨基酸、0.55mM 2-巰基乙醇、L-谷氨酰胺、和抗生素(所有的都來自GIBC0/BRL)的敲除(knockout) Dulbecco' s 基本培養基(DMEM ；GIBC0/BRL)組成的 ES 細胞培養基中，在涂有白明膠的組織培養平板上生長未分化的ES細胞。為了誘導胚狀體(EB)形成，通過含有0.05%的胰蛋白酶和0.04%的EDTA的PBS將細胞分離成為單細胞懸液，并且在如上所述的培養基中以2-2.5 X IO4個細胞cm_2的密度接種到非粘附的細菌培養皿上。形成EBs 4天，然后在ES細胞培養基中接種到粘附性的組織培養表面上。培養24h后，伴隨通過無血清的胰島素/轉鐵蛋白/硒/纖連蛋白(ITSFn)培養基替代ES細胞培養基并且培養10天來選擇nestin-陽性細胞。使用這些nestin-陽性細胞作為分開-匯合培養試驗的起始材料。具體地,通過
0.05 %胰蛋白酶/0.04 % EDTA離解細胞，并且以大約1.5_2 X IO5個細胞/cm_2接種在>10，000個玻璃生物球上(Whatman，英國)。此后所使用的組織培養皿由非粘附材料制成。用聚鳥氨酸(ISmgmr1)和層粘連蛋白(lug πιΓ1,兩者都來自Becton Dickinson Labware,Bedford, MA)預涂層無菌的玻璃珠。將珠子隨機地分為4組，每組在4種組織培養基(表示為A1、A2、A3或A4)中的一種中培養，下列表I中給出了這些培養基的組成。這些培養基是根據Johe等人(1996，Genes Dev, vol 10，p 3129-3140)基于N2培養基而改進的，并且此后被簡稱為N2培養基。表I
權利要求
1.體外從干細胞或雙潛能、多潛能或全能祖細胞獲得分化的細胞的方法，包括下列步驟: (a)使附著于微載體或珠子、限制在培養基可滲透屏障物的范圍內或截留的干細胞或祖細胞在培養基中生長； (b)將步驟(a)中的細胞從一種培養基轉移到另一種培養基； (C)重復步驟(b);以及 (d)獲得分化的細胞。
2.根據權利要求1的方法，其中通過酶促的脫附作用從微載體或珠子分離分化的細胞。
3.根據權利要求1或2的方法，其中通過消化微載體來分離分化的細胞。
4.體外誘導細胞中的細胞過程的方 法，包括下列步驟: Ca)培養附著于微載體、珠子、限制在培養基可滲透屏障物的范圍內或截留的細胞； (b)將所述細胞暴露于三種或更多種不同的細胞培養條件，所述細胞培養條件包括培養基的變化；和 (c)誘導所述細胞過程。
5.用于培養干細胞和來源于干細胞的分化的細胞的方法，包括使所述附著于微載體或珠子或限制在培養基可滲透屏障物的范圍內或截留的細胞生長，其中所述細胞經受至少兩種培養條件的變化，所述培養條件的變化包括培養基的變化。
6.根據權利要求5的方法，其中產生細胞的匯合物并反復重分。
7.根據權利要求5或6的方法，其中所述方法包括: Ca)組合在不同條件下生長的一個或多個細胞培養物；以及 (b)在普通的條件下培養所述細胞。
8.根據權利要求5至7中任一項的方法，其中所述方法包括: Ca)培養所述細胞培養物； (b)將所述培養物分為兩個或更多個細胞群；以及 (C)在兩種或更多種不同種類的培養條件下培養所述的細胞群。
9.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述微載體包括塑料、大分子如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖或丙烯酰胺、或無機材料如玻璃。
10.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述細胞截留在纖維素纖維如DEAE、TLC、QAE、TEAE或陶瓷柱體中。
11.根據前述任一項權利要求的方法，其中所述細胞是多潛能細胞。
全文摘要
本發明涉及細胞培養。具體地，涉及一種用于確定多種培養條件對細胞的影響的方法，包括下列步驟a)提供第一組各自包括一個或多個細胞的細胞單元群，并且將所述的群體暴露于所需要的培養條件；(b)匯聚兩個或多個所述的群體以形成至少一個第二組；(c)再重分該第二組以產生進一步的細胞單元群；(d)將所述的進一步的群體暴露于所需要的培養條件；(e)任選地，根據需要反復地重復步驟(b)-(d)；以及(f)任選地評估已經接觸細胞的培養條件對所述的給定細胞單元的影響。
文檔編號C12N5/0735GK103205393SQ20121029080
公開日2013年7月17日 申請日期2003年10月3日 優先權日2002年10月3日
發明者蔡延 申請人:可塑細胞有限公司