專利名稱：一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法
技術領域：
本發明屬于生物發酵技術領域，特別是涉及一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法。
背景技術：
菌種的強弱直接影響到發酵效價。因此選育出一種優質菌種對于紅霉素發酵來說具有非常重要的意義。紅霉素產生菌的常規誘變選育方法是先制備一定濃度的孢子懸浮液，孢子懸浮液是將生長至孢子狀態保存的斜面用無菌水刮取制成混懸液，然后采用各種物理和化學的誘變劑進行誘變處理。該誘變方法針對孢子進行誘變，由于孢子是菌種在生長繁殖過程中所產生的有繁殖和休眠作用的細胞，它的營養細胞通過細胞壁加厚和積存養料而能抵抗不 良環境條件，因此，通常對菌種的保藏均采用保藏其孢子態的細胞，從而達到穩定保存的目的。但是，也正因為孢子的這種生理特性，致使孢子對誘變劑有一定的抗逆性，從而大大減弱了誘變劑對遺傳物質的誘變效應，導致突變率低，無法滿足生產需求。

發明內容
本發明的目的就在于克服上述現有技術的缺陷，提供一種可獲得較高突變率，誘變方法簡便、易控制，且可快速有效地獲得高的正突變率，誘變菌種性狀穩定的含孢子芽體菌種的誘變選育方法。本發明是基于以下原理而設計I、通過多次試驗觀察到在一定的培養條件下將孢子培養至剛剛萌發或生長為菌絲體時，孢子在條件發生變化后萌發首先消耗自身儲存的養料，從而使細胞壁變薄，且結構發生變化，特別是菌絲體，它的細胞膜通透性增加，故而抗逆性會大大減弱，對誘變劑特別敏感。同時我們也觀察到菌絲體對干燥環境和誘變劑都過于敏感，在誘變過程中濃度和死亡率難以控制，不宜操作，容易導致試驗失敗。2、離子注入微生物誘變選育是核技術應用于生物研究，進行物理科學與生命科學交叉學科研究的典型范例，其作用機理是高能量離子體對生物體有兩個沉積作用，即能量沉積和質量沉積。能量沉積指注入的離子與生物體大分子發生一系列碰撞并逐步失去能量，而生物體大分子逐步獲得能量進而發生鍵斷裂，原子被擊出位，生物大分子留下斷鍵或缺陷的過程。質量沉積即注入的離子與生物大分子形成新的分子。這兩種雙重作用，從而使生物體產生死亡，引起自由基間接損傷，染色體重復、易位、倒位或使DNA分子斷裂、堿基缺失等多種生物學效應。所以，離子注入誘變可得到較高的突變率，且突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩定。本發明正是利用菌種自身生理生化特點，結合離子注入誘變得到紅霉素產生菌，具體為
一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征是將培養好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。上述紅色糖多孢菌孢子芽體的培養過程為首先制備孢子懸浮液，用滅菌的濾紙過濾，收集過濾孢子液，然后在過濾孢子液中加入S培養液，在34 37°C條件下培養13 15小時，觀察計數有70 80%的孢子發芽則終止培養，離心收集孢子芽，用無菌生理鹽水洗滌，等體積懸浮。所述S培養基配比為葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏0.4%，MgSO4. 7H20O. 05%, KH2PO4 O. 2%, K2HPO4O. 4%，以 g/100ml H2O 計。所述離子注入誘變采用N離子注入機實現。 所述離子注入誘變具體為將培養好的紅色糖多孢菌孢子芽體放置在空白培養皿內涂布均勻風干，然后放置到N離子注入機中，抽真空，真空度達5*10_4Pa時，充入氮氣，力口速電壓達20KV起弧進行真空環境的離子注入誘變5 500秒。離子注入誘變后，先加無菌水洗脫，稀釋后涂平板培養，挑選形態標準的單菌落試管斜面培養，搖瓶培養，發酵培養，檢測發酵效價，初篩留種。本發明采用將離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌，可得到較高的突變率，并且可快速有效地獲得正突變率高的紅霉素菌株，將該菌株穩定純化，用于生產可有效提高生產效益。
具體實施例方式I選育的步驟出發菌株(挑選生產使用菌株紅色糖多孢菌saccharopolysporaerythraea)，孢子萌發培養，孢子芽體的收集，離子注入誘變，分離培養，挑取單菌落接斜面，搖瓶考察，發酵培養，實驗數據統計分析，初篩留種。2誘變篩選過程2. I挑選大生產使用的生長飽滿的工作細胞庫斜面，加入30ml無菌水，用接種環刮取孢子，將其懸浮在無菌水中，制成混合均勻的孢子懸浮液。用滅菌的濾紙進行過濾，收集過濾孢子液備用。2. 2孢子萌發培養。2. 2. I孢子芽體的生理特點。孢子萌發是先吸水膨脹，然后長出芽管，孢子萌發以芽管長度超過孢子直徑一半為萌發標準。我們統計了孢子的萌發率和萌發時間。使用S培養液(使用S培養基的標準配比液，其配比以g/100ml H2O計，葡萄糖I %，蛋白胨0.4%，酵母膏 0. 4%,MgSO4. 7Η200· 05%，KH2PO4 0. 2%, K2HPO4 0. 4% )培養實驗菌種，其萌發率一般在80%，孢子萌發的時間為13 15小時。2. 2. 2孢子芽體的培養。準確吸取5ml過濾孢子液加入25ml的S培養液中，在35°C搖瓶柜內振搖培養至13 15小時，觀察計數約有70 80%的孢子發芽則終止培養。2. 2. 3離心收集孢子芽體。將培養好的發芽孢子的S液吸入離心管內2000轉離心沉降，用無菌生理鹽水洗滌3遍，等體積懸浮。2. 2. 4孢子芽體的離子注入誘變的處理。吸取一定量的孢子芽體懸浮液放置在90mm的空白培養皿內涂布均勻風干，打開離子機真空箱體，放置培養皿開蓋，關上箱體門，對小靶室進行抽真空，真空度達到5*104Pa時，開充氣閥，充入氮氣，調節各模塊參數穩定起弧后，加速電壓達20KV起弧進行真空環境的離子注入誘變5 500秒，操作結束，取出平板，用無菌水進行洗脫，將洗脫的懸浮液稀釋涂平板進行培養(瓊脂培養基)。培養至6 8天后，觀察菌落生長成熟(有明顯的形態分化)后，將其終止培養，放置在冷藏箱內保存備用。3搖瓶篩選過程。取出保存備用的分離平板，挑選分離平板上生長的形態標準的單菌落接試管斜面(瓊脂培養基)，放置在恒溫室內培養，培養成熟后冷藏，配置搖瓶培養基(黃豆餅粉2. 5 %、糊精2. O %、葡萄糖I. 90 %、碳酸鈣O. 5 %、硫酸銨0.1%、玉米漿1.2%、磷酸二氫鉀O. 04%，以g/100mlH20計)，進行搖瓶接種，將生長成熟的搖瓶種子培養液移種到發酵搖瓶培養基(同搖瓶培養基)內進行發酵培養，檢測發酵搖瓶效價單位，初篩留種。4使用設備的特點。
4. I該N離子注入設備的設計采用雙潘寧工作原理。具有會切磁場的雙潘寧源產生的N離子經過磁場和放電室幾何結構的雙重約束，并且離子運動路程加長，增加了離子間的碰撞幾率，使得離子的能量均一，離子密度提高，且離子的運動方向基本一致。4. 2該設備采用氮氣為離子源。因為N離子為DNA堿基的重要元素之一，N離子注入不僅可以直接引起堿基分子結構的變化，還可以參與細胞結構的重組和修復。所以使我們的離子注入誘變可得到較高的突變率，且突變譜廣、死亡率低、正突變率高、性狀穩定。4. 3該設備離子注入在真空腔室內進行，模仿太空環境。本次試驗獲得3株菌株提高率在15%以上。初篩搖瓶結果如下
菌株編號效價(u/ml)平均值(u/ml)對照(u/ml) 提高率％
^5532~ 49996082 5538477116. 076
O
~36# 5586 5423 5509 5506477115.41^
103# 4822 4986 5036 4948419218.0權利要求
1.一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征是將培養好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。
2.按照權利要求I所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征在于上述紅色糖多孢菌孢子芽體的培養過程為首先制備孢子懸浮液，用滅菌的濾紙過濾，收集過濾孢子液，然后在過濾孢子液中加入S培養液，在34 37°C條件下培養13 15小時，觀察計數有70 80%的孢子發芽則終止培養，離心收集孢子芽，用無菌生理鹽水洗滌，等體積懸浮。
3.按照權利要求2所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征在于所述S培養基配比為葡萄糖1%，蛋白胨O. 4 %，酵母膏O. 4 %,MgSO4. 7H20 O. 05%,KH2PO4O. 2%, K2HPO4O. 4%,以 g/100ml H2O 計。
4.按照權利要求I所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征在于所述離子注入誘變采用N離子注入機實現。
5.按照權利要求I或4所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征在于所述離子注入誘變具體為將培養好的紅色糖多孢菌孢子芽體放置在空白培養皿內涂布均勻風干，然后放置到N離子注入機中，抽真空，真空度達5*10_4Pa時，充入氮氣，力口速電壓達20KV起弧進行真空環境的離子注入誘變5 500秒。
6.按照權利要求5所述的離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征在于離子注入誘變后，先加無菌水洗脫，稀釋后涂平板培養，挑選形態標準的單菌落試管斜面培養，搖瓶培養，發酵培養，檢測發酵效價，初篩留種。
全文摘要
本發明涉及一種離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌的選育方法，其特征是將培養好的紅色糖多孢菌孢子芽體采用離子注入誘變方法誘變。本發明采用將離子體注入孢子芽體誘變紅霉素產生菌，可得到較高的突變率，并且可快速有效地獲得正突變率高的紅霉素菌株，將該菌株穩定純化，用于生產可有效提高生產效益。
文檔編號C12R1/645GK102851276SQ201210308738
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月28日 優先權日2012年8月28日
發明者李學兵, 郭惠芬, 陳荔, 楊玉芳, 蔣鴻 申請人:寧夏啟元藥業有限公司