專利名稱：一種利用脂肪酰acp還原酶生物合成脂肪醇的方法
技術領域：
本發明屬于可再生能源和生物質能源以及化工原料生產領域，具體涉及改造異養微生物自身脂肪酸代謝途徑從而生產脂肪醇的方法。
背景技術：
脂肪醇(fatty alcohols)是洗漆劑用表面活性劑的原料之一,在洗漆劑、護膚品、化妝品、藥品中有大量運用。脂肪醇最早是由鯨蠟制取的，所得的混合脂肪醇經磺化中和后成為硫酸鹽，是最早的一種陰離子洗滌劑。其后開發利用來源比較豐富的椰子油、棕櫚油和牛油為原料，水解所得脂肪酸再還原為醇，統稱為天然脂肪醇。石油化學工業發展后，以石油產品為原料，生產的脂肪醇稱為合成脂肪醇。全世界總的脂肪醇消費量大約在250萬噸左右。至20世紀末，天然醇與合成醇的比例大致為4. 9 5.1。近年來由于石油原料價格持續高漲，加上美洲和亞洲地區對脂肪醇的需求增加，以及人們對天然原料脂肪醇的偏好， 增加了對天然脂肪醇的需求。脂肪醇的價格已高達2000美元每噸，目前全球有許多國家依然需要依靠進口滿足脂肪醇的需求。但是依靠石油產品為原料的脂肪醇也大量消耗石油的儲備量，在資源日益稀缺的今天，這種發展方式將會逐漸淘汰，因此，需要一種更環保、可再生的生產方式。如果能夠通過在改造后的脂肪酸代謝通路中異源表達脂肪醇合成酶，即脂肪酰載體蛋白還原酶，即可以通過微生物發酵產生大量的脂肪醇。Michael 等人在 2000 年純化了 jojoba 的 fatty acyl CoA reductase,并證明
該基因-jojoba far能將脂肪酸還原成為脂肪醇,該工作發表在“Plant Physiology”
(James G. Metz, Michael R. Pollard 1，LanaAndersonj Thomas R. Hayes, and MichaelW.Lassner. 2000. Purification of ajojoba embryo fatty acyl-Coenzyme A reductaseand expression ofits cDNA in high erucic acid rapeseed. Vol.122:635 - 644)。Tan等在缺乏合成脂肪醇能力的藍細菌Syn-LY2菌株中分別表達了來自于jojoba，鼠，擬南芥等的脂肪酰輔酶A還原酶FAR，發現異源表達jojoba及其中一種擬南芥FAR的藍細菌能夠合成脂肪醇，而異源表達其他的幾種FAR的藍細菌不能產生脂肪醇。該工作發表在 “Metabolic Engineering，，上(Tan X，Yao L，Lu X. et al. 2010. Photosynthesisdriven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons incyanobacteria. Metabolic Engineering 13 (2011) 169 - 176)。劉天里教授等人開發了一個“cell free”體系，將脂肪酸代謝途徑中的限速步驟進行了研究，指導如何提高微生物體內的脂肪酸含量，該工作發表于“Metabolic Engineering” (Tiangang Liu，HarmitVorajChaitan Khosla. 2010. Quantitative analysis and engineering of fatty acidbiosynthesis in E. coli. Metabolic Engineering 12:378 - 386)。2011 年，石開究人員克隆并鑒定了一個參與單子葉植物水稻花藥及花粉外壁發育的脂肪酰基載體蛋白還原酶DPW，研究揭不，DPW蛋白定位于質體中，重組蛋白可以脂肪酉先基載體蛋白為底物，將碳十六脂肪酸還原為其相應的脂肪醇，從而參與花藥及花粉外壁的合成，并且通過遺傳互補等實驗證明DPW在雙子葉植物擬南芥中具有保守的生物學功能(Shi J, Tan H，YuXH，Liu Y，Liang Wj Ranathunge K，et al. Defective pollen wall is required foranther and microspore development in rice and encodes a fatty acyl carrierprotein reductase.The Plant cell 2011;23:2225-46)。 2010 年，Andreas Schirmer等在Science上發表一項工作，其中證明了來自于藍細菌PCC7942的一段基因序列PCC7942-orfl594 (AAR 基因)和 PCC7942_orfl593 共表達可以產生脂肪烷烴(SchirmerA, Rude MAj Li X，Popova Ej del Cardayre SB. Microbial biosynthesis of alkanes.Science 2010;329:559-62)。脂酰載體蛋白還原酶基因便于進行優化，目前可以進行遺傳操縱的微生物種類繁多，脂肪酸合成代謝途徑又是每種微生物生存的必需條件，并且目前的研究已經對該條途徑認識較為深刻，其限速步驟基本清楚，利于進行改造。眾所周知，由于異養微生物或異養細胞生長迅速并且需要外源補充營養物質，這就便于通過補充培養基或者增加某些營養成分來提高其生產能力，使其在工業上實現大規模產業化生產。并且由于其必須依賴人工補給養料，所以可以嚴格控制其生產的各個階段，防止其肆意生長而造成無法控制的局面。目前工業上已經有許多利用異養微生物生產發酵獲得產品的成功實例，利用脂酰載體蛋白還原酶基因在異養微生物體內通過改造其自身代謝途徑生產脂肪醇有很大的應用前景。

發明內容
本發明的目的在于提供一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，在異養微生物或異養細胞體內改造其脂肪酸代謝途徑以及表達外源蛋白以生產重要的化工原料一脂肪醇。為實現上述目的，本發明提供的利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因導入異養微生物或異養細胞內，并誘導表達。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白質。或者編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質。優選為DPW基因和AAR基因。本發明所述異養微生物或異養細胞包括哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、細菌細胞和藍細菌細胞。此外，本發明方法還包括通過改造異養微生物或異養細胞的代謝途徑或者根據其密碼子的偏愛性對脂酰載體蛋白還原酶基因進行優化，以提高脂肪醇的產量。此外，本發明方法還包括對轉化脂酰載體蛋白還原酶基因異養微生物進行耐受性篩選，獲得優勢菌株，從而提高脂肪醇的產量。其中，所述改造的異養微生物代謝途徑是該微生物體內的脂肪酸代謝途徑，包括提高脂肪酸產量或者降低脂肪酸產量用以生產脂肪醇的途徑，例如在大腸桿菌中導入PMSD8質粒,過量表達fatty acetyl-CoA carboxylase,提高用以生產脂肪醇的脂肪酸含量；改變該微生物體內脂肪酸代謝途徑中間物用以生產脂肪醇的途徑，例如敲除大腸桿菌中的fadE基因以積累更多脂肪酸代謝途徑中間物的脂肪酰載體蛋白，從而獲得更多的脂肪醇；改變該微生物體內脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產脂肪醇的途徑。其中，所述的菌種改造包括利用脂肪醇耐受性篩選改造獲得的耐受型菌株。
本發明還提供一種異養微生物或異養細胞，其是轉化脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養微生物或異養細胞。以及通過上述改造途徑得到的優選異養微生物或異養細胞。所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼SEQ ID No. 2或SEQ IDNo. 4所示的蛋白質。或者編碼SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列經取代、替換和/或增加一個或幾個氨基酸，具有DPW蛋白和AAR蛋白同等活性的由DPW蛋白和AAR蛋白衍生得到的蛋白質。優選為DPW基因和AAR基因。本發明的優點是在異養微生物中引入外源基因改造其自身的脂肪酸代謝途徑以實現生產工業原料脂肪醇的目的，不需要通過過多的化學合成反應，減少了環境的污染，也減少了對石油儲量的消耗。同時，由于大部分異養微生物生長速度快，便于進行遺傳操作，其抗污染性能優異，且人工可以調節其生長速度和防止其肆意生長破壞環境，種種因素表明改造異養微生物進行工業生產是切實可行的。


圖I為設計構建的pRL108表達載體示意圖。圖2為設計構建的pFASR表達載體示意圖。圖3為大腸桿菌RL6經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ；C14:0 表不 tetradecanol ；C16:0 表不 hexadecanol。圖4為大腸桿菌RL7經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖5為大腸桿菌RL8經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖6為大腸桿菌RL9經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ;C18:1 表不Δ9—octadecanolο圖7為大腸桿菌RLlO經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖8為大腸桿菌RLll經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C18:1表不 Δ 9-octadecanol ο圖9為大腸桿菌RL12經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖10為大腸桿菌RL13經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖11為大腸桿菌RL14經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖12為大腸桿菌RL15經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖13為大腸桿菌RL16經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖14為大腸桿菌RL17經IPTG誘導后，其培養物進行脂肪醇提取后的GC-MS結果圖。C15:0 表不 pentadecanol ;C14:0 表不 tetradecanol ;C16:0 表不 hexadecanol ；C16:1表不 Δ 9-hexadecanol ;C18:1 表不 Δ 9-octadecanol。圖15為大腸桿菌RL15和RL17經分批補料發酵試驗后的結果。 圖16基因敲除質粒pRL103上下游PCR擴增示意圖。圖17基因敲除菌RL100構建示意圖。圖18為挑取的疑似正確的重組菌RL100進行的PCR驗證結果圖，其中泳道f 10是挑取的不同菌，3、4、6、7、9為經PCR驗證的RL100重組菌，marker為DNA分子量標準。
具體實施例方式本發明的目的通過以下措施來達到在異養微生物體內弓丨入外源基因——脂肪酰載體蛋白還原酶，從而催化自身的脂肪酰載體蛋白還原形成脂肪醇。引入的脂肪酰載體蛋白還原酶還原酶就是來源于水稻的DPW基因和來源于藍細菌PCC7942的AAR基因。大腸桿菌作為異源微生物的一種，遺傳操作背景清楚，生長速度快，培養條件溫和，是進行發酵生產的首選菌株之一，實施例中選用一種大腸桿菌BL21 (DE3)或MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA作為生產菌株，選取其表達質粒pET28，并將其改造為可以表達DPff基因的pRL108載體和可以表達AAR基因的pFASR載體。以下實施例用于進一步說明本發明，但不應理解為對本發明的限制。實施例I將已公布的DPW基因序列(SEQ ID No. 1，由金斯瑞生物科技有限公司合成)，并通過EcoR I和Xho I兩個酶切位點將其克隆于pET28載體上，構建好的質粒被命名為pRL108o將BL21 (DE3)中的脂酰載體蛋白脫氫酶fadE基因敲除，可以減少脂肪酰輔酶A的消耗，從而積累更多的脂肪酰載體蛋白和脂肪酰載體蛋白用于生產脂肪醇。該實例中將敲除fadE基因的大腸桿菌BL21(DE3)命名為TL101。將TL101中的脂肪酰輔酶A合成酶fadD基因敲除，可以中斷脂肪酰輔酶A的形成，使細胞體內只合成脂肪酰載體蛋白。該實例中按照同源重組的原理，構建一敲除質粒用于敲除TL101中的fadD基因。通過兩條引物 pRLl-S(TTAAGCATGC GAAGATTTTA CTGCGGATAT T (Sph I ))和 pRLl-AS(ATATGGATCCGCGTTAAGTC AGTCGTC(BamH I ))PCR擴增一段Ikb左右的左臂——即fadD基因的上游序列，通討另兩備引物 DRL2-S(ATATGGATCC TTCTTCACCT CTAAAATGCG T(BamH I ))和
PRL2-AS (ATATGAGCTC GATGAAAACG GTATCTGGC (Sac I ))擴增一段 Ikb 左右的右臂-即
fadD基因的下游序列，將兩條基因序列拼接并克隆于溫敏質粒PMAK705上，成功構建敲除質粒pRL103。將構建好的敲除質粒PRL103導入大腸桿菌TLlOl感受態細胞，由于敲除質粒PRL103上含有跟大腸桿菌基因組同源的序列，利用同源重組的原理，這段序列能跟大腸桿菌基因組上的fadD基因前后的相同序列發生兩次同源重組，從而可以敲除fadD基因。并且利用敲除質粒PRL103的溫度敏感性質進行反復溫度改變培養，讓其既進行重組又可以自行丟失，從而利用抗生素敏感試驗篩選出疑似正確的重組菌。用兩條引物對(KS AAGCGAAACCCCATGACATC ；KAS :GTCGATGTGAACGGITTTC)進行菌落 PCR 驗證，由于在 RL100 中，fadD基因被敲除，因此其PCR片段比TL101PCR片段小約I. 7kb，恰好為fadD基因大小(圖18)。將在大腸桿菌TLlOl基礎上成功敲除fadD的大腸桿菌命名為RL100并進行保種。John Cronan教授曾構建的質粒pMSD8可以在大腸桿菌中過量表達fatty acetyl-CoA carboxylase(Mark S.Davis, Jose' Solbiati, and John E.Cronan, Jr. 2000.Overproduction of Acetyl-CoA Carboxylase Activity Increases the Rate ofFatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli. THE JOURNAL OF BIOLOGICALCHEMISTRY. 275(37) :28593-28598.)。在本實例中，本發明使用該質粒提高脂肪醇的產量。用包含有十二醇(dodecanol)、十四醇(tetradecanol)和十六醇(hexadecanol)的LB培養基對TL101進行脂肪醇耐受性篩選，從80mg/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度逐步增加到終濃度為I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)對TL101進行篩選，最終在最高濃度為I. 2g/L的脂肪醇(fatty alcohols)濃度的條件下連續進行一周的篩選,將最終存活的細胞保種，并命名為RL101。將pRL108轉化進入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為 RL6。將pRL108轉化進入MG1655 (DE3) Δ recA Δ endA,利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL7。將PRL108轉化進入TL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL8。將pRL108轉化進入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL9。將pRL108轉化進入RL100，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RLlO。將pMSD8和pRL108共轉化進入RL101，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RLlI。將RL6、RL8、RL10三種菌分別接種于含有相應抗生素的5mLLB培養基中37°C培養約12h后，將其轉入含有相應抗生素的300mLLB培養基中在37°C繼續培養約90min后，待其OD達到0. 6時，加入0. 25mM的IPTG進行誘導表達，繼續37°C培養12h后，再轉入30°C培養6小時。將RL7、RL9、RL11三種菌分別接種于含有相應抗生素的5mLLB培養基中30°C培養約12h后，將其轉入含有相應抗生素的300mLLB培養基中在30°C繼續培養約120min后，待其OD達到O. 6時，加入O. 25mM的IPTG進行誘導表達，繼續30°C培養18小時。誘導表達18h后,取IOOmL培養物進行fatty alcohols提取。RL6、RL8、RLlO的提取方法為向IOOmL培養物中加入100 μ L 10mg/mL的碳十五醇作為內參，使其終濃度為10mg/L，并加入2mL正癸烷。隨后加入200mL的有機液A(hexane: isopranol=3:2),劇烈萃取10分鐘后，靜置10分鐘，去除下層水溶液后，再加入ISOmL硫酸鈉溶液B，繼續劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機層轉入500mL的圓底燒瓶進行旋轉蒸發。條件為50°C水浴，壓力為50psi。待有機液體正己烷和異丙醇被蒸發完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉蒸發)，將溶有產物的正癸烷溶液其轉移入一個帶有內置管的樣品瓶中。RL7、RL9和RLll提取方法為在IOOmL培養物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol 作為內參，再加入 200mT,的溶液 A(hexane: isopranol=3:2),劇烈萃取 IOmin后，靜置IOmin,去除下層水溶液后,再加入180mL的溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續劇烈萃取lOmin，再靜置IOmin中，去除下層水溶液，將上層有機層轉入500mL的圓底 燒瓶進行旋轉蒸發。條件為40°C水浴，壓力為250psi。待有機液體被蒸發完后，分別3次用3mL的正己烷溶解圓底燒瓶內壁的產物，再將這9mL液體轉移到一個25mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進行旋轉蒸發。待有機層蒸發完畢后，用300 μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產物溶出，將其轉移入一個帶有內置管的樣品瓶中。將處理好的樣品進行GC-MS (氣相色譜-質譜聯用儀)檢測。GC-MS為安捷倫的5975C/7890A系統，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速lmL/min，進樣量I μ L，分流比為10:1，RL6、RL8和RLlO的程序溫度為150°C 2分鐘，每分鐘升高5°C至240°C，保持5分鐘。RL7、RL9和RLll程序溫度為50°C 2min，每分鐘升高10°C至240°C，保持lOmin。實驗結果六株菌中均產生了脂肪醇，產物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇和碳十八烯醇，在大腸桿菌RLll中產量達到最高，約為10. 5mg/L。該實例充分證明了利用DPW蛋白生產脂肪醇的可行性。實施例2將已公布的AAR基因序列經優化后進行全合成(SEQ ID No. 3，由金維智生物科技有限公司合成)，并通過Nco I和BamH I兩個酶切位點將其克隆于pET28載體上，構建好的質粒被命名為PFASR。將pFASR轉化進入BL21 (DE3)，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL12。將pFASR轉化進入MG1655 (DE3) Λ RECA Λ ENDA，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RLl3。將將pFASR轉化進入TL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL14。將pFASR轉化進入RL101，利用卡那霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL15。將pFASR和pMSD8共轉化進入TLlOI，利用卡拉霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RL16。將pFASR和pMSD8共轉化進入RLlO I，利用卡那霉素和羧芐青霉素篩選獲得成功的轉化子，將其命名為RLl7。將以上六種菌分別接種于含有相應抗生素的5mLLB培養基中30°C培養約12h后，將其轉入含有相應抗生素的300mLLB培養基中在30°C繼續培養約120min后，待其OD達到
O.6時，加入O. 25mM的IPTG進行誘導表達，繼續30°C培養18小時。誘導表達18h后,取IOOmL培養物進行fatty alcohols提取。提取方法為在IOOmL培養物中加入100 μ L 10mg/mL的pentadecanol作為內參，再加入200mL的溶液A (hexane:isopranol=3:2),劇烈萃取IOmin后，靜置IOmin,去除下層水溶液后，再加入180mL的溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續劇烈萃取lOmin，再靜置IOmin中，去除下層水溶液，將上層有機層轉入500mL的圓底燒瓶進行旋轉蒸發。條件為40°C水浴，壓力為250psi。待有機液體被蒸發完后，分別3次用3mL的正己烷溶解圓底燒瓶內壁的產物，再將這9mL液體轉移到一個25mL的圓底燒瓶中，同樣條件下進行旋轉 蒸發。待有機層蒸發完畢后，用300μ L的正己烷將圓底燒瓶中的產物溶出，將其轉移入一個帶有內置管的樣品瓶中。將處理好的樣品進行GC-MS (氣相色譜-質譜聯用儀)檢測。GC-MS為安捷倫的5975C/7890A系統，使用柱子為HP-INNOWax，氦氣流速lmL/min，進樣量I μ L，分流比為10:1，程序溫度為50°C 2min，每分鐘升高10。。至240°C，保持IOmin0挑取約為10個成功轉化子RLlOl/pFASR或RL101/pMSD8/pFASR培養于5mL的含有相應抗生素的M9培養基中，30°C過夜培養后，將其轉入IOOOmL含有相應抗生素M9培養基中繼續在30°C培養24小時后，將IOOOmL的菌液分批轉入無菌的80mL離心管中，5000rpm離心5分鐘收集菌體，最后將所有菌體用50mL含有相應抗生素M9培養基懸浮均勻作為種子液上罐發酵，發酵的規模為4L。當罐中OD長到6左右時，以0. 24mL/min的速率補充補料培養基，當OD長到13左右時，加入終濃度0. 25mM IPTG進行誘導，誘導后每隔4小時提取90mL的培養物用液氮迅速冷凍后，保存于_80°C冰箱。在補料前保持融氧為80%以上，補料后由于菌體大量生長融氧自然下降，盡量保持融氧較高。發酵產物提取脂肪醇方法將培養物從_80°C冰箱中取出，自然融化，向40mL培養物中加入40 μ L 100mg/mL的碳十五醇作為內參，使其終濃度為100mg/L，并加入2mL正癸烷。隨后加入200mL的溶液A (heXane:iS0pran0l=3:2)，劇烈萃取10分鐘后，靜置10分鐘,去除下層水溶液后,再加入180mL硫酸鈉溶液B (12g硫酸鈉溶于180mL水中)，繼續劇烈萃取10分鐘，再靜置10分鐘，去除下層水溶液，將上層有機層轉入500mL的圓底燒瓶進行旋轉蒸發。條件為50°C水浴，壓力為50psi。待有機液體正己烷和異丙醇被蒸發完后(在此條件下，正癸烷不能被旋轉蒸發)，將溶有產物的正癸烷溶液其轉移入一個帶有內置管的樣品瓶中。發酵產物脂肪醇檢測方法將提取好的樣品進行GCMS (氣相色譜質譜聯用儀)檢測，GCMS為安捷倫5975C/7890A系統。氣相色譜柱為HP-INNOwax柱，氦氣流速為lmL/min，分流比為10: I。進樣量為I μ L0程序溫度為50°C 2分鐘，每分鐘升高10°C至240°C，保持10分鐘。實驗結果六株菌中均產生了脂肪醇，產物包括碳十四飽和醇、碳十六飽和醇、碳十六烯醇和碳十八烯醇。將大腸桿菌RL15和RL17進行分批補料發酵實驗，結果表明RL15的產量最高達到0. 8g/L，產率達到I. 6g/L/day，RL17的產量最高達到0. 65g/L，產率達到2gL/day。該實例充分證明了利用AAR蛋白生產脂肪醇的可行性，并且該蛋白有很大的工業化生產脂肪醇的潛力。 序列表說明SEQ ID No. I和2分別為DPff基因序列和蛋白序 列；SEQ IDNo. 3和4分別為經優化后的AAR基因序列和蛋白序列；SEQ ID No. 5&6是擴增fadD左臂的引物；SEQID No. 7&8是擴增fadD右臂的引物；SEQ ID No. 9&10是檢驗為RLlOO陽性克隆的引物。
權利要求
1.一種利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，其是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因導入宿主細胞體內，并使該基因在該宿主細胞體內表達。
2.根據權利要求I所述的方法，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個或幾個氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
3.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，將脂肪酰載體蛋白還原酶基因克隆于表達載體上，導入相應的宿主體內或插入宿主細胞的基因組內，并誘導表達。
4.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括通過改造宿主細胞脂肪酸合成和降解的代謝途徑或者根據宿主細胞密碼子的偏愛性對脂肪酰載體蛋白還原酶基因進行優化，以提高脂肪醇的產量。
5.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，還包括對轉化脂肪酰載體蛋白還原酶 基因異養微生物進行耐受性篩選，獲得優勢菌株，從而提高脂肪醇的產量。
6.根據權利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述宿主細胞選自哺乳動物細胞、植物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、真菌細胞、絲狀真菌細胞、細菌細胞和藍細菌細胞。
7.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細胞代謝途徑是該宿主細胞體內的有關脂肪酸合成和代謝的相關途徑。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，改造的宿主細胞代謝途徑是該宿主細胞體內提高脂肪酸的產量或者降低脂肪酸的產量用以生產脂肪醇的途徑。
9.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，改造的宿主細胞代謝途徑是改變宿主細胞體內脂肪酸代謝途徑中間物用以生產脂肪醇的途徑。
10.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，改造的異養微生物代謝途徑是改變該異養微生物體內脂肪酸代謝途徑衍生物用以生產脂肪醇的途徑。
11.一種異養微生物或異養細胞，其是接受轉脂肪酰載體蛋白還原酶基因的異養微生物或異養細胞。
12.根據權利要求11所述的異養微生物，其特征在于，所述脂肪酰載體蛋白還原酶基因為j/f基因或基因，其編碼如下蛋白1)SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸序列組成的蛋白；或，2) SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 4所示氨基酸插入、取代和/或增加一個或幾個氨基酸組成的與I)所述蛋白具有同等功能的蛋白。
全文摘要
本發明公開了利用脂肪酰ACP還原酶生物合成脂肪醇的方法，該方法是將脂肪酰載體蛋白還原酶基因導入宿主細胞體內，并使該基因在該宿主細胞體內表達，從而改造異養微生物或異養細胞體內的脂肪酸代謝途徑以生產脂肪醇。本發明還進一步通過代謝改造，提高脂肪醇的產量。本發明實現了在微生物體內通過生物合成的方法合成脂肪醇，該技術是一種可再生的、低消耗的技術，且這種環保的生產方式能夠減少對稀缺資源石油的消耗，也不需要再進行化學改造就可以直接生產脂肪醇，在工業上有很大的應用前景。
文檔編號C12N9/02GK102827880SQ201210330969
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年7月9日
發明者劉天罡, 劉然, 付愛思 申請人:武漢大學