專利名稱：水稻根尖特異表達啟動子Pro-Os02g54880及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學、基因工程技術領域，具體地說，涉及一種水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880及其應用。
背景技術：
通過轉基因方法研究基因功能甚至改變重要作物的農藝性狀已經成為一種常用手段。以往人們利用組成型啟動子啟動相關基因的表達，但這種方法不僅過分消耗了植株能量，而且可能得不到期望的表型。將目標基因以期望的水平在特定組織中表達對于研究基因功能、改良植物性狀是切實可行的。因此，選擇合適的器官特異啟動子，有利于控制基 因在時間及空間上不同水平的表達，以減少過多的能量消耗以及不期望的其它性狀。植物根系在土壤養分吸收中起重要作用，并且能與土壤微生物相互作用、分泌抗病蟲物質以抵抗病菌對植物的侵襲。更重要的是，根系能夠在各種非生物脅迫條件下保護地上部分，如干旱、酸性條件及重金屬。當與養分吸收和耐脅迫相關的基因被特異的表達在根部細胞后，植物則會在營養匱乏及脅迫條件下正常生長。近些年，為了調控外源基因在轉基因株系中不同時間及空間的表達，研究者已經克隆了很多具有不同器官或組織特異性的啟動子。例如，從種子貯藏蛋白基因及非種子貯藏蛋白基因都克隆到了種子特異表達的啟動子。幾種花器官特異的啟動子也已被鑒定。雖然已有少數根部特異表達的啟動子被克隆并應用于基因功能的研究，但這些啟動子中大部分只是在根部表達較強，并不完全特異在根中表達。另外，能夠在水稻根尖特異表達的啟動子更是鮮為人知。

發明內容
本發明的目的是提供水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880及其應用。為了實現本發明目的，本發明的水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880，其具有i) SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或ii) SEQ ID No. I所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。本發明還提供含有上述啟動子的載體、含有上述啟動子的轉基因細胞系以及含有上述啟動子的工程菌。本發明還提供含有上述啟動子的轉基因株系。本發明還提供水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880在調控下游基因表達中的應用，優選下游基因為GUS基因、GFP基因、LUC基因等報告基因，或CKX基因、OsNAC IO基因等目標基因。優選下游基因為CKX基因或OsNACIO基因。當下游基因為CKX基因或OsNACIO基因時，可促進水稻根系生長并提高水稻抗旱能力。將水稻基因0s02g54880的起始密碼子ATG上游2. 273kb序列擴增后，連接到⑶S表達載體PCAMBIA3301上，將構建好的載體轉化水稻，獲得轉基因株系，并用GUS顯示底物x-gluc對轉基因植株染色,觀察根尖部位的著色情況。本發明首次提出一個新的能夠在水稻根尖部位特異表達啟動子Pro-0s02g54880，該啟動子適用于啟動目標基因(如GUS基因或GFP基因)在水稻根尖的特異性表達。由于該啟動子的特異性很強，因此為后續進一步確定根尖特異表達的順式作用元件奠定了基礎，且為植物抗逆基因工程研究提供了新的啟動子元件。


圖I為本發明實施例2中構建的Pro-0s02g54880_GUS載體圖譜。圖2為本發明實施例2中轉基因水稻不同組織器官的染色結果；其中，A為根系染色結果，B為葉片染色結果。圖3為本發明實施例2中多個獨立轉基因株系的根和葉片中GUS活性測定結果。
具體實施例方式
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以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。以下實例中未注明具體的實驗方法，均可按照常規方法進行或按照制造生產廠商的使用說明。實施例I水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880的克隆I. I生物材料I. I. I植物材料水稻轉基因受體材料為日本品種‘kitaake’。I. I. 2菌株和載體使用的農桿菌菌株為EHA105，載體為pCAMBIA3301。I. 2 方法I. 2. I水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880的克隆及Pro-0s02g54880_GUS載體的構建以水稻日本晴葉片為材料，用天根植物基因組提取試劑盒提取水稻總DNA，進行PCR 擴增。登錄 http://rice, plantbiology. msu. edu/analyses_search_locus. shtml 網站，找到水稻轉錄因子0s02g54880基因，根據其上游2. 273kb序列設計PCR擴增引物，并分別在兩條引物的5’端添加與載體pCAMBIA3301線性化位點同源的15個堿基。引物序列分別為prol-F:5’-CCATGATTACGAATTCTCCCCCGTGTCAACTGGATA-3 ' ;prol_R:5’-CTCAGATCTACCATGGGGACGACGTACGACGATGGT-3’。PCR 擴增體系為PCR 反應緩沖液 25 μ l，dNTP 4 μ 1，ddH20 17. 5 μ I，PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(購自 Takara 公司)O. 5 μ I。反應程序為熱啟動98°C 10秒，57°C 5秒，72°C 2. 5分鐘，30個循環后72°C延伸10分鐘，最后25°C反應結束。PCR結束后，用凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收PCR產物。載體pCAMBIA3301線性化通過常規酶切。限制性內切酶EcoR I和Nco I購自Fermentas公司，反應體系為5 μ I IOX反應緩沖液，2μ I EcoR I ,2μ I Nco I，質粒2yg，用ddH20補足至50μ I。PCR儀上37 °C反應20分鐘。反應結束后，用凝膠回收試劑盒(Axygen公司)回收PCR產物。用丨n-Fusion HD Cloning KitCClontech公司)連接載體與目的片段。吸取2 μ I反應體系直接轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞(北京全式金生物技術有限公司)，并對重組質粒進行測序，所構建的載體Pro-0s02g54880-GUS圖譜見圖1，載體序列如SEQ ID No. 2所
/Jn οI. 2. 2轉基因水稻植株的獲得取水稻‘kitaake’成熟種子，人工或機械脫殼，挑選飽滿光潔無菌斑的種子經消毒之后接種到誘導培養基上進行誘導培養。選擇外觀良好，生長力好的水稻愈傷組織為受體材料，采用農桿菌介導法將Pro-0s02g54880-GUS轉入水稻愈傷組織中，用含有100 μ M的乙酰丁香酮和O. D.值為O. 7的農桿菌的AAM轉化液進行轉化，將轉化液浸泡過的愈傷組織置于共培養基上進行共培養，25°C暗培養3d后置于篩選培養基上培養約30d,每IOd繼代一次。然后將篩出的抗性愈傷轉移到分化培養基上分化約20d，每IOd繼代一次。將分化出綠色小苗的抗性愈傷轉移到生根培養基上生根，待約7d長出發達根系后煉苗，并計算轉化所 獲轉基因苗數。煉苗7d后轉移至大田生長。用Basta篩選轉基因水稻，長出4片幼葉后開始噴灑Basta(1:1000，V :V)，隔I天噴I次，共噴灑3次。共獲得轉基因水稻18株。其中，誘導培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。共培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+2. 5mg/L 2，4D+0. 5g/L谷氨酰胺+0. 6g/L酸水解酪蛋白+10g/L葡萄糖+30g/L鹿糖，以水配制,調pH至5. 2后加入植物凝膠4g/L。滅菌后，50°C左右加入乙酰丁香酮lOOlOOyg/mL。篩選培養基配方為N6大量+B5微量+NB有機+鐵鹽+銅鈷母液+2. 5mg/L2，4D+0. 6g/L酸水解酪蛋白+2. 878g/L脯氨酸+0. 5g/L谷氨酰胺+30g/L蔗糖，以水配制，調PH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。滅菌后加入35mg/L潮霉素(購自上海紐津生物技術有限公司)或5mg/L Bialaphos (購自北京拜爾迪生物技術公司)。分化培養基配方為MS無機+MS-B5微量+MS有機+鐵鹽+MS-銅鈷母液+0. 05mg/L NAA+2. 0mg/L Kinetin (激動素)+30g/L山梨醇+2g/L水解酪蛋白+30g/L蔗糖，以水配制，調pH至5. 8^5. 9后加入植物凝膠4g/L。實施例2水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880調控下游基因⑶S的表達I. I⑶S組織染色確定啟動子的表達模式用⑶S顯示底物x-gluc對實施例I中獲得的轉基因植株根部及葉片進行染色。GUS 染色液配方0. 05mmol/L 鐵氰化鉀,0. 05mmol/L 亞鐵氰化鉀,2mmol/L EDTA, 10mmol/L磷酸緩沖液，0.1% Triton X-100,0. 5mg/ml X-gluc，以水配制。黑暗下37°C染色8 12個小時后拍照。結果如圖2所示，只有水稻主根根尖、側根生長點和側根根尖被特異染色(圖2A)，而葉片及根的其他部位都未被染色(圖2B)，表明該啟動子只在根尖表達，且特異性強。I. 2⑶S酶活定量I. 2. I蛋白定量I.標準蛋白稀釋用蛋白提取液將10mg/ml BSA標準蛋白母液分別稀釋為0、5、10、20、50、100呢/1111，用于制作標準曲線。2.考馬斯亮蘭G-250染料試劑稱IOOmg考馬斯亮蘭G-250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1L。3.將G-250溶液按照I :4稀釋，200ul稀釋溶液各加5ul不同梯度BSA。測定各樣品在595nm處的光吸收值A595，不加蛋白的G-250為對照。NANO繪制標準曲線，并測定各蛋白樣品的蛋白濃度。I. 2. 2⑶S蛋白的提取、測定I.取一定量材料于I. 5ml離心管中，加入液氮，打成粉末，加入適量蛋白提取液；2. 13000rpm 4°C離心 IOmin,取上清后，13000rpm 4°C離心 IOmin,去除細胞碎片；3.取適量的上清，用考馬斯亮藍法測定蛋白的含量；4. 4-MU標準曲線配制4-MU梯度濃度液(由反應終止液配制)10 μ mol/L,·
2.5 μ mol/L, I μ mol/L, 500nmol/L, lOOnmol/L, lOnmol/L (0-10 μ M),在激發光 365nm,發射光455nm，狹縫3nm條件下，測定各樣品的熒光值，繪制標準曲線；4.將 180ul 的 0. 2Mm Na2CO3 預熱；5.將提取的蛋白與4-MUG I 1混合，使總體積達到80ul，37°C反應，并在反應30分鐘后取50ul反應液加入到Na2CO3中終止反應,保持黑暗；6.采用Tristar LB941測定各樣品熒光值，并依據4-MU標準曲線計算4-MU濃度，根據公式“⑶S活力(pmol · μ g *min) =4_MU量/蛋白量/反應時間”計算⑶S酶活。結果如圖3所示，根中的⑶S活性顯著高于葉片中的⑶S活性，進一步表明Pro-0s02g54880啟動子在根部特異表達。溶液配制如下200ml lmol/L Na2HPO4 溶液稱取 71. 628g Na2HPO4 · 12H20 溶于 200ml 水中；200ml ImoI/LNaH2PO4 溶液稱取 31. 202g NaH2PO4 · 2H20 溶于 200ml 水中；0. IM磷酸緩沖液(pH7. 0) :28.85ml lmol/L Na2HPO4 和 21. 15mllmol/L NaH2PO4 混合后加水至500ml ；0.5M EDTA (pH8. 0):在 80ml 水中加入 18. 61gNa2EDTA ·2Η20，用 NaOH 調 pH 至 8· 0，溶解后定容至IOOml ；⑶S酶提取液50ml 0. IM 磷酸緩沖液(ρΗ7· 0)，2ml 0. 5MEDTA, IOOul TritonX-100，100 μ I β -巰基乙醇，加 ddH20 至 100ml ；MUG溶液取4-MUG 3. 5mg溶解于5ml提取緩沖液中，終濃度為2mM ；反應終止液(0.2mol/L Na2CO3) :10. 6g Na2CO3 溶于 500ml 水；4-MU溶液配制稱0. 14096g 4-MU固體溶于40ml反應終止液(0. 2M Na2CO3)中，配制成20mM的4-MU溶液，然后再稀釋到ImM濃度，貯存于_20°C，用于繪制MU標準曲線。通過染色體步移、生物信息學分析、構建植物表達載體及缺失片段載體的研究，可進一步確定水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880的核心元件，為水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880功能的研究奠定了基礎。另外，本發明還驗證了當水稻根尖特異表達啟動子Pro_0s02g54880控制的下游基因為CKX基因或OsNACIO基因時，可促進水稻根系生長并提高水稻的抗旱能力。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
權利要求
1.水稻根尖特異表達啟動子Pro-0s02g54880，其特征在于，其具有 i)SEQ ID NO. I所示的核苷酸序列；或 ii)SEQID No. I所示核苷酸序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由i)衍生的核苷酸序列。
2.含有權利要求I所述啟動子的載體。
3.含有權利要求I所述啟動子的轉基因細胞系。
4.含有權利要求I所述啟動子的工程菌。
5.權利要求I所述的啟動子在調控下游基因表達中的應用。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，下游基因為GUS、GFP、LUC、CKX或NAC基因。
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，下游基因為CKX基因或OsNACIO基因。
全文摘要
本發明涉及水稻根尖特異表達啟動子Pro-Os02g54880及其應用，該啟動子具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或該序列經取代、缺失和/或添加一個或幾個核苷酸且同等功能的由其衍生的核苷酸序列。本發明從克隆水稻根尖特異表達啟動子Pro-Os02g54880入手，通過對水稻根尖特異表達啟動子Pro-Os02g54880的功能分析，從實驗水平上驗證了該啟動子適用于啟動目標基因在水稻根尖的特異性表達。
文檔編號C12N1/21GK102839178SQ20121033089
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月7日 優先權日2012年9月7日
發明者劉斌, 張春雨, 李宏宇, 趙濤, 劉軍, 林辰濤 申請人:中國農業科學院作物科學研究所