一種用于基因檢測的質量型傳感器及其制備方法和應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及傳感器制造領域，尤其涉及一種用于基因檢測的質量型傳感器。本發明提供一種用于基因檢測的質量型傳感器，包括質量型傳感器本體，其特征在于，所述質量型傳感器本體的非檢測敏感位置表面設有聚乙二醇單分子層，所述質量型傳感器本體的檢測敏感位置表面設有巰基生物素單分子層，所述巰基生物素單分子層上嫁接有鏈親和素層。使用本發明所提供的質量傳感器，主要優點包括實時在線檢測、結果準確、檢測速度快、節約成本和擴展性好。
【專利說明】一種用于基因檢測的質量型傳感器及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及傳感器制造領域，尤其涉及一種用于基因檢測的質量型傳感器。
【背景技術】
[0002]基因檢測技術廣泛應用在傳染性疾病與遺傳性疾病檢測等方面。依賴于DNA序列特異性的基因測序技術、依賴于DNA雜交的DNA芯片技術、依賴于PCR反應的基因擴增技術以及分離不同長度DNA片段的凝膠電泳技術等技術單獨或者聯合應用于基因檢測上。限制性內切酶能夠特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。限制性片段長度多態性分析技術，即經過特異性限制性內切酶酶切DNA基因組而產生的不同長度的DNA片段，通過高壓脈沖電泳分離形成特定圖譜，已經廣泛應用在病原體微生物分型等方面。但是DNA測序、DNA雜交芯片、高壓脈沖電泳等檢測技術都需要專門的實驗室、大型儀器、昂貴的試劑以及專業的操作分析人員，不僅分析時間長、通量小，而且無法滿足快速、高通量基因檢測的需求。
[0003]近幾年發展起來的以DNA雜交技術為基礎的質量型傳感器在基因檢測上具有高分辨率、高靈敏度、快速響應和數字式輸出信號等特點，而且能夠在液相環境中工作，在環境監測、醫療診斷等方面具有廣闊的應用前景。但是由于生物大分子的非特異性吸附，容易造成誤檢。此外雜交系統復雜， 待檢樣品的單鏈DNA樣品制備復雜，還不能在實際檢測中應用。

【發明內容】

[0004]鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種用于基因檢測的質量型傳感器及其制備方法和應用，用于解決現有技術中的問題。
[0005]本發明第一方面提供一種用于基因檢測的質量型傳感器，包括質量型傳感器本體，所述質量型傳感器本體的非檢測敏感位置表面設有聚乙二醇單分子層，所述質量型傳感器本體的檢測敏感位置表面設有巰基生物素單分子層，所述巰基生物素單分子層上嫁接有鏈親和素層。
[0006]本領域技術人員可根據常識確定所述質量型傳感器的檢測敏感位置和非檢測敏感位置。
[0007]所述聚乙二醇單分子層的作用是減少因非特異性吸附對質量型傳感器造成的影響。
[0008]優選的，質量型傳感器本體的非檢測敏感位置表面為二氧化硅表面，質量型傳感器本體的敏感位置表面為鍍金表面。
[0009]優選的，巰基生物素單分子層選自Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin或Sulfο-NHS-(PEG4_bismannose)-SS-biotin。
[0010]優選的，所述聚乙二醇 單分子層為自組裝的聚乙二醇單分子層，所述巰基生物素單分子層為自組裝的巰基生物素單分子層。[0011]優選的，所述質量型傳感器的表面使用BSA封閉。具體是指當巰基生物素單分子層上嫁接有鏈親和素層后，使用BSA封閉，以排除質量型傳感器上吸附生物大分子的可能性，保證了檢測的準確性。
[0012]優選的，所述的質量型傳感器為微懸臂梁傳感器或石英晶體微天平。
[0013]本發明第二方面提供一種用于基因檢測的質量型傳感器的制備方法，包括如下步驟:[0014](a)在質量型傳感器的非敏感位置表面自組裝聚乙二醇單分子層；
[0015](b)在質量型傳感器的檢測敏感位置表面自組裝巰基生物素單分子層；
[0016](c)在步驟b所得的巰基生物素單分子層上嫁接鏈親和素；
[0017](d)使用BSA封閉質量型傳感器表面非特異性位點。
[0018]優選的，所述步驟a中聚乙二醇單分子層的自組裝方法是將質量型傳感器靜置在聚乙二醇硅烷溶液中自組裝生成聚乙二醇單分子層。
[0019]優選的，所述的聚乙二醇硅烷溶液包括聚乙二醇硅烷、無水乙醇和去離子水，所述聚乙二醇硅烷、無水乙醇和去離子水的體積比為1:100:1,浸泡溫度為75°C,浸泡時間為90分鐘。所述聚乙二醇硅烷溶液會選擇性的與表面為二氧化硅表面的非檢測敏感表面結合，形成聚乙二醇單分子層。
[0020]優選的，所述步驟b中，自組裝巰基生物素單分子層的具體方法為:將質量型傳感器放在巰基生物素溶液中靜置生成生物素單分子層。
[0021 ] 優選的，所述巰基生物素溶液選自Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS緩沖液、NHS-SS-Biotin 的 PBS 緩沖液或 Sulfo-NHS-(PEG4_bismannose)-SS-biotin 的 PBS 緩沖液中的一種，濃度為0.1~2.5mM(mmol/L)，所述質量型傳感器放在巰基生物素溶液中靜置的時間為8小時以上。所述巰基生物素會選擇性的與表面為鍍金表面的檢測敏感表面結合，形成巰基生物素單分子層。
[0022]優選的，所述巰基生物素溶液為ImM Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS緩沖液，靜置溫度為4°C。
[0023]所述PBS (PBS =Phosphate Buffered Saline)緩沖液為含 0.05% 吐溫一20 的pH7.4的磷酸鹽緩沖液，通過磷酸二氫鉀(KH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4* 12H20)、氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、吐溫-20 [聚氧乙烯(20)失水山梨醇單月桂酸酯，Tween-20, CASN0.9005-64-5]和水配置。
[0024]所述各種生物素溶液均可通過市售途徑獲得。
[0025]優選的，所述步驟c中嫁接鏈親和素的具體方法為:將自組裝巰基生物素后的質量型傳感器放在I~2.5wt%鏈親和素的PBS緩沖液中室溫孵育0.5小時以上。
[0026]優選的，步驟d所述封閉非特異性位點的具體方法為:將嫁接鏈親和素后的質量型傳感器放在I~5wt%BSA的PBS緩沖液中室溫孵育0.5小時以上。
[0027]本發明第三方面提供所述質量型傳感器在基因分析用傳感器制造領域中應用。
[0028]本發明第四方面提供一種試劑盒，包括所述的質量型傳感器、目標DNA上游引物、目標DNA下游引物及限制性內切酶，所述上游引物或下游引物上偶聯有生物素。
[0029]優選的，還包括PCR試劑。
[0030]優選的，所述試劑盒中還包括限制性內切酶酶切所需試劑等各種試驗中可能用到的常規試劑。
[0031]本發明所提供的質量型傳感器使用限制性內切酶在線酶切的基因檢測的具體方法，包括如下步驟:
[0032](a)通過PCR反應擴增目標DNA，PCR過程中所使用的上游引物預先偶聯了生物素；
[0033](b)將步驟a所得的PCR產物中的生物素化DNA特異性地吸附到質量型傳感器的敏感表面,并通過質量型傳感器計算出結合到質量型傳感器的DNA的質量為Hi1 ；
[0034](C)對結合到質量型傳感器表面的DNA進行限制性內切酶在線切割，通過質量型傳感器計算出被切割掉的DNA質量為m2，被切割前目標DNA的總長度I1，而由DNA酶切位點位置決定的理論被切掉的DNA長度I2，將Hi2Ai1和I2Zl1的值比較后得出檢測結論。
[0035]若1?/!? ^ I2Zl1,即可判定被檢測的DNA為目標DNA。
[0036]綜上所述，使用本發明所提供的質量傳感器進行基因檢測的主要優點是:
[0037](I)實時在線檢測:DNA的結合以及DNA酶切直接由傳感器顯示。
[0038](2)結果準確:生物素-鏈親和素結合特異性好,減少了 DNA非特異性吸附，通過特異性限制性酶切位點切割，原理上消除了假陽性結果。
[0039](3)檢測速度快:①PCR產物不需要純化，可直接分析。②由于DNA被固定在質量型傳感器上，緩沖液替換簡單快速。③DNA結合與酶切都在微小空間內完成，化學反應速度更快。
[0040](4)節約成本:使用了微型傳感器，DNA樣品與檢測試劑等都是微量消耗。
[0041](5)擴展性好:本發明還可以應用在石英晶體微天平(QCM)等其它質量型傳感器上。
[0042](質量型傳感器包括微懸臂梁型傳感器、石英晶體微天平等)
【專利附圖】

【附圖說明】
[0043]圖1為本發明實施例1的原理圖。
[0044]圖2為本發明實施例1的檢測結果示意圖。
【具體實施方式】
[0045]以下通過特定的具體實例說明本發明的實施方式，本領域技術人員可由本說明書所揭露的內容輕易地了解本發明的其他優點與功效。本發明還可以通過另外不同的【具體實施方式】加以實施或應用，本說明書中的各項細節也可以基于不同觀點與應用，在沒有背離本發明的精神下進行各種修飾或改變。
[0046]在進一步描述本發明【具體實施方式】之前，應理解，本發明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發明的保護范圍；在本發明說明書和權利要求書中，除非文中另外明確指出，單數形式“一個”、“一”和“這個”包括復數形式。
[0047]當實施例給出數值范圍時，應理解，除非本發明另有說明，每個數值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數值均可選用。除非另外定義，本發明中使用的所有技術和科學術語與本【技術領域】技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據本【技術領域】的技術人員對現有技術的掌握及本發明的記載，還可以使用與本發明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現有技術的任何方法、設備和材料來實現本發明。
[0048]除非另外說明，本發明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本【技術領域】常規的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養、重組DNA技術及相關領域的常規技術。這些技術在現有文獻中已有完善說明，具體可參見SambiOOk等 MOLECULAR CLONING:ALAB0RAT0RY MANUAL, Second edition, Cold Spring HarborLaboratory Press,1989 and Third edition,2001 ；Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York,1987 and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY, Academic Press, San Diego ；ffolffe, CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego,1998 ；METH0DSINENZYM0L0GY, Vol.304, Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.ffolffe, eds.), AcademicPress, San Diego,1999 ；和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, ChromatinProtocols (P.B.Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999 等。
[0049]懸臂梁的基態固有諧振頻率可以從梁振動方程中解出，表示為
[0050]
【權利要求】
1.一種用于基因檢測的質量型傳感器，包括質量型傳感器本體，其特征在于，所述質量型傳感器本體的非檢測敏感位置表面設有聚乙二醇單分子層，所述質量型傳感器本體的檢測敏感位置表面設有巰基生物素單分子層，所述巰基生物素單分子層上嫁接有鏈親和素層。
2.如權利要求1所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器，其特征在于，質量型傳感器本體的非檢測敏感位置表面為二氧化硅表面，質量型傳感器本體的敏感位置表面為鍍金表面。
3.如權利要求1所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器，其特征在于，巰基生物素單分子層選自 Sulfo-NHS-SS-Biotin、NHS-SS-Biotin 或 Sulfo-NHS-(PEG4_bismannose)-SS-biotin。
4.如權利要求1所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器，其特征在于，所述聚乙二醇單分子層為自組裝的聚乙二醇單分子層，所述巰基生物素單分子層為自組裝的巰基生物素單分子層。
5.如權利要求1所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器，其特征在于，所述質量型傳感器的表面使用BSA封閉。
6.如權利要求1-5任一權利要求所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器，其特征在于，所述的質量型傳感器為微懸臂梁傳感器或石英晶體微天平。
7.如權利要求1-6 任一權利要求所述的一種用于基因檢測的質量型傳感器的制備方法，包括如下步驟: (a)在質量型傳感器的非敏感位置表面自組裝聚乙二醇單分子層； (b)在質量型傳感器的檢測敏感位置表面自組裝巰基生物素單分子層； (c)在步驟b所得的巰基生物素單分子層上嫁接鏈親和素； Cd)使用BSA封閉質量型傳感器表面非特異性位點。
8.如權利要求7所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟a中聚乙二醇單分子層的自組裝方法是將質量型傳感器靜置在聚乙二醇硅烷溶液中自組裝生成聚乙二醇單分子層。
9.如權利要求8所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述的聚乙二醇硅烷溶液包括聚乙二醇硅烷、無水乙醇和去離子水，所述聚乙二醇硅烷、無水乙醇和去離子水的體積比為1:100:1，浸泡溫度為60-80°C，浸泡時間為60-120分鐘。
10.如權利要求7所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟b中，自組裝巰基生物素單分子層的具體方法是將質量型傳感器靜置在巰基生物素溶液中生成生物素單分子層。
11.如權利要求10所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述巰基生物素溶液選自含Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS緩沖液、含NHS-SS-Biotin的PBS緩沖液或含Sulfο-NHS-(PEG4_bismannose)-SS-biotin 的 PBS 緩沖液中的一種，濃度為 0.1 ~2.5mM,所述質量型傳感器在巰基生物素溶液中靜置的時間為8小時以上。
12.如權利要求11所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述巰基生物素溶液為ImM Sulfo-NHS-SS-Biotin的PBS緩沖液，靜置溫度為0_20°C。
13.如權利要求7所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，所述步驟c中嫁接鏈親和素的具體方法為:將自組裝巰基生物素后的質量型傳感器放在I~2.5wt%鏈親和素的PBS緩沖液中室溫孵育0.5小時以上。
14.如權利要求7所述的質量型傳感器的制備方法，其特征在于，步驟d所述封閉非特異性位點的具體方法為:將嫁接鏈親和素后的質量型傳感器放在I~5wt%BSA的PBS緩沖液中室溫孵育0.5小時以上。
15.如權利要求1-6任一權利要求所述的質量型傳感器在基因分析用傳感器制造領域中應用。
16.一種試劑盒，包括如權利要求1-6任一權利要求所述的質量型傳感器、目標DNA上游引物、目標DNA下游引物及限制性內切酶，所述上游引物或下游引物上偶聯有生物素。
17.如權利要求16所 述的一種試劑盒，其特征在于，還包括PCR試劑。
【文檔編號】C12M1/34GK103667039SQ201210332526
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優先權日:2012年9月10日
【發明者】徐鐵剛, 李昕欣, 許鵬程, 于海濤 申請人:中國科學院上海微系統與信息技術研究所