專利名稱：一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇毒素降解酶及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于酶工程領域，具體涉及一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶及其編碼基因，以及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的應用。
背景技術：
脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON),是由鐮刀菌屬缺乏營養物質時產生的次級代謝產物，主要來自禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌，而禾谷鐮刀菌是小麥赤霉病和玉米穗腐病的重要病原。DON是一種全球性的谷物污染物，污染水平居鐮刀菌毒素之首，該真菌毒素主要發生于小麥、大麥、燕麥、黑麥和玉米，而很少發生于水稻、高粱和黑小麥。脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的污染不僅對人類與動物健康造成巨大危害、導致巨大的經濟損失，而且導致大量國際貿易糾紛。 目前，國內外DON的去毒方法主要有物理去除及吸附、化學處理等。對已經污染真菌毒素谷物的物理、化學處理方法主要有沖洗和漂洗、熱處理、離子輻射、無機吸附、化學試劑的處理及臭氧氧化等。但是，物理化學脫毒效率并沒有預期的高，且改變了食品的品質，易造成營養物質的流失，歐盟不允許在食品生產過程中應用化學方法消除真菌毒素。由于傳統的物理和化學方法有一定的局限性，微生物或酶制劑的降解為成功控制真菌毒素的污染提供了新的思路。生物降解不僅可以高效將毒素轉化為無毒產物、環保安全，而且生物酶催化方法專一性強、轉化效率高。

發明內容
本發明要解決的技術問題是提供一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶及其編碼基因，該酶可以降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)。為解決上述技術問題，本發明所采用的技術方案是本發明所提供的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶被命名為Dasag，來源于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) ACCC No. 36245 (中國農業微生物菌種保藏管理中心,簡稱ACCC)所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中的SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中的SEQ ID NO :I氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇活性的由SEQID NO 1衍生的蛋白質。其中，序列表中的SEQ ID NO 1由454個氨基酸殘基組成。上述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。它可具有下述核苷酸序列之一(a)序列表中SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；(b)編碼序列表中SEQ ID NO :1蛋白質序列的多核苷酸。其中，序列表中的SEQ ID NO 2由1365個堿基組成，其編碼序列為自5’端第I到第1365位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO 1的氨基酸殘基序列的蛋白質。含有本發明基因的表達載體、細胞系、工程菌及宿主菌均屬于本發明的保護范圍。本發明還提供了一種表達所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的方法，是將含有上述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶編碼基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶。其中，所述宿主可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、枯草桿菌、芽孢桿菌或乳桿菌等，優選為酵母菌。所述酵母菌優選為巴氏德畢赤酵母(Pichia pastoris),例如巴氏德畢赤酵母GS115。用于構建所述重組大腸桿菌及重組酵母表達載體的出發載體可為在上述宿主中表達外源基因的表達載體，如可在大腸桿菌中表達的PEB載體，以及在巴氏德畢赤酵母(Pichia pastoris)中表達的 pPIC9K、pPIC9、pPIC3. 5K 等。
上述重組表達載體均可按常規方法構建。本發明還提供了所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應用。本發明的優點進行表達的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶可以對糧食中真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇進行削減，對控制糧食污染起到有效的作用。


圖I重組質粒pPIC9K_Dasag的表達產物的SDS-PAGE圖，泳道1，表達產物；泳道M，蛋白分子量標準，圖2脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶能力測定圖。
具體實施例方式以下實施例中的實驗方法如無特別說明均為常規方法。實施例I脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因Dasag的獲得及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的表達脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因質粒文庫的建立(I)將標準菌株尖孢鐮刀菌ACCC No. 36245 (購自中國農業微生物菌種保藏管理中心)活化后接入PDA液體培養基(馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L，pH自然)，然后將菌株的懸浮液接入IOOml同樣的培養基，搖床條件為220轉/分鐘，30°C，72小時。培養完成后用離心機12000轉/分鐘離心收集菌體。提取RNA (Trizol法)；(2)以RNA為模板逆轉錄合成cDNA序列；2、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因的獲得以步驟I中獲得的cDNA序列為模板，在引物I和引物2的引導下進行PCR反應，
擴增脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因的序列。引物I :5’ GGAATTCCATATGACTGCACTAAACGTTACAAAC3’ (劃線部分堿基為 Nde I 識別位點)和引物2 :5’ CCCAAGCTTCTAGCCAATGAATTGCCCATAC3’ (劃線部分堿基為 Hind III識別位點)
在PCR反應中，PCR反應條件為94°C，保持5分鐘，接著按以下的溫度變化程序循環30次升溫至94°C，保持I分鐘，降溫至54°C，保持I分鐘，升溫至68°C，保持2分鐘；然后于68°C，保持10分鐘，最后于4°C保溫10分鐘，結束擴增反應。通過瓊脂糖電泳分析獲得約I. 4kb的單一帶，擴增之后的PCR產物檢測之后將目的帶大小的擴增產物用DNA凝膠回收試劑盒進行回收，并檢測其濃度。回收PCR產物連接pMD19-T Vector轉化大腸桿菌JM109,獲得重組質粒pMD19-Dasag測序鑒定。則該脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因DNA序列為序列表SEQ ID NO :2，其對應的氣基酸序列為序列表SEQ ID N0:1。3、含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶編碼基因序列的重組表達載體的構建所獲得的PCR產物兩端具有Nde I和Hind III限制性內切酶位點，用(Nde I)和(Hind III)限制性內切酶對PCR產物和質粒pPIC9K同時進行雙酶切反應，酶切體系50yL :目的片段或質粒 20 μ L，10 X K Buffer 5 μ L, Nde I 2 μ L，Hind III 2 μ L, ddH20 21 μ L，酶切條件是37°C反應3h。酶切產物經柱回收后進行連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，經卡那霉素抗性篩選，挑取陽性菌落培養，重組表達載體經PCR鑒定、酶切鑒定，測序驗證。經瓊脂 糖電泳后載體。回收的目的片段和載體片段定量并按摩爾比為3:1的比例用T4DNA連接酶進行體外連接，連接反應體系10 μ L :目的片段5 μ L，pPIC9K載體2 μ L 10XT4DNA連接緩沖液lμL，T4DNA連接酶(350U/μL)lμL，ddH20 I μ L。16°C連接過夜，連接產物轉化大腸桿菌JM109，經卡那霉素抗性篩選，挑取菌落37°C振蕩培養6-8h，分別進行PCR鑒定和重組質粒的酶切鑒定。獲得的重組表達載體命名為后pPIC9K_Dasag。超聲波破碎，離心收集上清，取15 μ L上清用SDS-PAGE電泳進行檢測。對pPIC9K_Dasag進行測序，證明融合連接入質粒PPIC9K的DNA序列與序列表SEQ ID NO :2相同，構建含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶基因序列的重組表達載體pPIC9K-Dasag正確。4、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶在畢赤酵母中的表達將重組表達載體pPIC9K_Dasag用Sal I限制性內切酶酶切使之線性化后，采用電擊方式，將線性化的載體pPIC9K-Dasag導入畢赤酵母GS115 (北京茂健聯星科技有限公司)中，經選擇性培養基培養，篩選His+和抗G418的高表達菌株。挑取選擇性培養基上長出的單菌落接種于5ml YPD液體培養基(酵母膏10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)中，30°C培養12-24小時后，轉入500mlBMGY培養基(1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源(YNB) I. 34%、IOOmM磷酸緩沖液PH6. 0,4X10-5生物素，1%甘油)中繼續培養至菌液的0D600=2_3，離心收集菌體，再用無碳源BMMY培養基(1%酵母膏、2%蛋白胨、酵母氮源(YNB)L 34%、100M磷酸緩沖液PH6. 0,4X10-5生物素，O. 5%甲醇)將稀釋至0D600=1后加入O. 5%甲醇進行誘導培養，培養期間每隔24小時補加甲醇至終濃度為O. 5%，培養至118小時即可停止培養。離心收集上清，取15 μ L上清用SDS-PAGE電泳進行檢測。結果如圖I所示泳道I為蛋白標準分子量(97KDa，66KDa, 45KDa, 31KDa, 21KDa, 14KDa);泳道2、3為表達產物，箭頭表示目的條帶，這表明重組菌株在甲醇誘導下表達的蛋白質的分子量約52. 3KDa，與從氨基酸推段出的理論分子量(52. 3kDa)大小一致。5、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶表達產物的純化宿主為大腸桿菌時進行表達的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶使用GE公司組氨酸標記親和柱純化目的蛋白。具體的方法參照HisTrap FF組氨酸標簽融合蛋白純化實驗流程的說明書進行；而在畢赤酵母中表達的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶可以直接分泌到培養液的上清中，直接用于酶活性測定。實施例2脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的活性檢測樣品處理重組的畢氏酵母ASAG2菌株(實驗組)和野生型畢氏酵母GS115菌株(對照組，空質粒整合菌株)誘導表達。5天后，取上清液800 μ L置I. 5mL離心管中，再加入200 μ L IOOppm的D0N，使終濃度達到20ppm。添加后30°C反應0h_5h后處理。取處理好的樣品10 μ L進高效液相色譜檢測DON的殘留。檢測方法按照GB/T 23504-2009方法進行。高效液相色譜檢測條件Agilent Eclipse X DB-C18, 150mmX4. 6mm(5 μ m)色譜柱，流動相水/甲醇=80%/20%，紫外檢測器檢測，柱溫30°C，流速I. Oml/min,進樣量10 μ L。通過高效液相色譜檢測得知經過在Tuner中誘導表達的上清液液與DON處理后，DON最高降解率為30% (圖2)。可以表明，Dasag基因克隆表達出的降解酶具有降解DON的活性。顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而并非是對本發明的實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬于本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明的保護范圍之列。
權利要求
1.一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶，是如下(a)或(b)的蛋白質 (a)由序列表中的SEQID NO I的氣基酸殘基序列組成的蛋白質； (b)將序列表中的SEQID NO: I氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇活性的由SEQ ID NO :1衍生的蛋白質。
2.權利要求I所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因。
3.根據權利要求2所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因，其特征在于，所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因具有下述核苷酸序列之一 (a)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列； (b)編碼序列表中SEQID NO 1蛋白質序列的多核苷酸。
4.含有權利要求2或3所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的編碼基因的表達載體、轉基因細胞系或宿主菌。
5.權利要求I所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應用。
6.權利要求2或3所述脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶編碼基因在降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇中的應用。
7.—種表達權利要求I所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶的方法，是將含有權利要求2或3所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶編碼基因的重組表達載體導入宿主細胞，表達得到脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶。
8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于所述宿主為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、枯草桿菌、芽孢桿菌或乳桿菌；用于構建所述重組表達載體的出發載體為pEB、pPIC9K、pPIC9、pPIC3. 5k。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于所述宿主為巴氏德畢赤酵母。
10.根據權利要求9所述的方法，其特征在于所述宿主為巴氏德畢赤酵母GS115。
全文摘要
本發明公開了一種脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶及其編碼基因與應用，該酶來源于尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)，是如下(a)或(b)的蛋白質(a)由序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列組成的蛋白質；(b)將序列表中的SEQ ID NO1氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加具有降解脫氧雪腐鐮刀菌烯醇活性的由SEQ ID NO1衍生的蛋白質。本發明所述的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇降解酶對脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)具有高效降解作用。
文檔編號C12N15/63GK102816745SQ20121033579
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月11日 優先權日2012年9月11日
發明者吳子丹, 伍松陵, 孫長坡, 任保中 申請人:國家糧食局科學研究院