專利名稱：環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的檢測試劑盒及其引物的制作方法
技術領域：
本發明涉及結核分枝桿菌的檢測技術，尤其涉及一種環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的檢測試劑盒及其引物。
背景技術：
結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis, TB)簡稱為結核桿菌(tuberclebacilli)。早在1882年，德國細菌學家郭霍(Robert Koch，1843-19 10)就已證明結核分枝桿菌是結核病的病原菌。結核分枝桿菌可侵犯全身各組織器官，但以肺部感染最多見。隨著抗結核藥物的不斷發展和衛生生活狀況的改善，結核的發病率和死亡率曾一度大幅下降。20世紀80年代后，由于艾滋病和結核分枝桿菌耐藥菌株的出現、免疫抑制劑的應用、吸毒、貧困及人口流動等因素，全球范圍內結核病的疫情驟然惡化。如今，結核病仍然是影響人類健康流行性最廣、病死率最高的感染性疾病之一。尋求快速、準確的診斷方法一直是結核病學首要研究的領域。目前，肺結核的診斷方法主要包括(I)痰涂片檢查。一般初次就診要查三個痰標本，即夜間痰、清晨痰和即時痰。痰涂片檢查的陽性率受標本質量、處理方法、觀察視野數、鏡檢者的技術水平和經驗等因素的影響。痰涂片鏡檢法操作簡便、出結果快、費用低廉，但只以抗酸性特征為依據，故不能作為結核桿菌種特異性鑒定的依據。(2)痰結核菌培養，結果可信度高，并能做結核菌藥敏試驗，但需時6-8周，應用受到限制。該法至少需要IO3—IO4細菌/ ml才能檢出陽性結果。特別是微量菌、細胞壁缺陷菌和化療后細菌受到損傷培養難以生長，就更突出了培養的局限性。同時由于肺結核屬于呼吸道傳播的烈性傳染病，對實驗室安全要求較高,不利于結核桿菌的普遍篩查。(3)免疫法。此檢測技術快速簡便、成本低廉，但要求高質量高穩定性的單克隆抗體，否則因準確性不夠，目前只能是輔助檢測手段。(4)聚合酶鏈式反應(PCR)。聚合酶鏈式反應法技術因其靈敏、特異、快速，對于難以培養、生長緩慢的結核分枝桿菌檢測有著獨特意義，已成功用于臨床標本結核分枝桿菌的檢測，近年來，該技術在結核分枝桿菌檢測中的應用研究取得很大進展，特別是通過與DNA指紋技術、DNA探針技術結合，進一步提高了檢測的靈敏度和準確性，不但能定性，而且能定量檢測出結核分枝桿菌DNA的含量，該成果將對臨床具有極大的意義。由于目前基因檢測技術的復雜性和結核分枝桿菌的高傳染性，要進行結核分枝桿菌的基因檢測，不僅需要昂貴的儀器設備，而且對實驗室條件也有很高的要求，這給結核病的快速診斷造成許多困難，不利于基層醫療防疫機構及現場快速測定。環介導等溫擴增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是一種新型核酸擴增技術，最初由日本科學家Notomi，T等設計用來檢測病原微生物，具有簡單、快速、特異性強的特點。其基本原理是采用4條引物來識別基因上的6個特異區域，同時利用一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在恒溫條件下進行擴增反應。將樣品、引物、具有鏈置換特性的DNA聚合酶及反應液混合，置于60 65°C的恒溫條件下反應，基因的擴增和檢測即可一步完成。該擴增法擴增效率高，15 60分鐘內DNA擴增可達IO9 101°倍。鑒于其高特異性，可通過擴增產物是否生成來判斷目的基因是否存在。該方法不需要模板的熱變性、長時間溫度循環、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程，LAMP法具有高特異性、高效性、快速、廉價(不需要特定的貴重檢測設備，只需要簡單結構的恒溫箱)、易檢測(直接進行目測判斷)等特點。LAMP具有簡單、快速、特異性強的特點，能代替PCR方法的最新技術?，F已被廣泛用于微生物檢測及胚胎性別鑒定等領域，如何運用環介導等溫擴增技術檢測結核分枝桿菌在臨床診斷技術發展中具有重大意義，因此開發一種簡單快速、檢測效率高的運用環介導等溫擴增技術來檢測結核分枝桿菌的方法迫在眉睫。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的結核分枝桿菌的檢測試劑盒，以及在該試劑盒上應用到的引物。該試劑盒是基于環介導等溫擴增技術來檢測結核分枝桿菌的。本發明環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的引物所采用的技術方案是本發明所述引物包括外引物F3、外引物B3、內引物FIP及內引物BIP，其序列分別如下
外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；
外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；
內引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；
內引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。本發明環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的檢測試劑盒所采用的技術方案是本發明所述試劑盒包括以下成分
權利要求
1.一種環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的引物，其特征在于，包括外引物F3、外弓丨物B3、內引物FIP及內引物BIP，其序列分別如下外引物 F3 :5’ -ACCGAGGTCAAATCGITTGT-3’ ；外引物 B3 :5’ -ATCCGTGGAACGGCAATC-3’ ；內引物 FIP :5’ -CGAGGACACAGCCTTGTTCACAGAACAGCTGACCCACTGG-3’ ；內引物 BIP :5’ -CGTATCGCGGCACGTAAGGCGGGCAATCCACCGATGTC-3’。
2.一種包括如權利要求I所述的環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的引物的檢測試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如下成分
3.根據權利要求2所述的環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌的檢測試劑盒，其特征在于所述擴增體系預混合物中含有2. 5ul 10倍濃縮的Bst DNA聚合酶反應緩沖液、4ul10mmol/L dNTP、lul 100mmol/L 硫酸鎮、5ul 5mol/L 甜菜減。
全文摘要
本發明公開了一種檢測成本低、使用方便、檢測快速高效、靈敏度高的基于環介導等溫擴增技術的結核分枝桿菌的檢測試劑盒，以及在該試劑盒上應用到的引物。所述引物的序列如序列編號SEQ ID NO.1～4所示；本發明所述試劑盒除了包括上述引物外，還包括12.5μl的擴增體系預混合物、1μl 5～15pmol/μl的引物F3、1μl 5～15pmol/μl的引物B3、1μl 20～40pmol/μl的引物FIP、1μl 20～40pmol/μl的引物BIP、2.5μl的無菌雙蒸水；利用所述試劑盒進行環介導等溫擴增檢測結核分枝桿菌，能使檢測成本大大降低，且檢測快速高效，靈敏度高。本發明可應用于結核分枝桿菌檢測領域。
文檔編號C12N15/11GK102888455SQ20121033962
公開日2013年1月23日 申請日期2012年9月14日 優先權日2012年9月14日
發明者孫宜峰, 龔惠勇, 曾冰冰 申請人:珠海市銀科醫學工程有限公司