專利名稱：一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K₂的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)維生素K2的方法，特別涉及一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素1(2的方法。
背景技術(shù)：
維生素K (MK)是一類含有甲蔡醒結(jié)構(gòu)的抗出血性化合物的總稱，又名為凝血維生素或抗出血維生素。維生素K (MK)可分為兩大類，一類為脂溶性化合物KpK2和K3，可在動植物體內(nèi)提取；另一類為水溶性化合物K4,人工化學合成。最重要的為I、K2和K3，商品用維生素K是維生素K3的衍生物。在動物體內(nèi)，具有生物活性的是K2,而維生素K1和K3需要在肝臟內(nèi)轉(zhuǎn)化為K2才能發(fā)揮功能。維生素K2不僅在血液凝固過程中，在骨骼代謝上也有著重要作用，已被廣泛用于 骨質(zhì)疏松等疾病的預防和治療。維生素K2是腸道群細菌的代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵過程后的某些食品中有少量的維生素K2，發(fā)酵納豆食品中維生素K2含量尤其豐富。文獻報道指出目前能夠用于發(fā)酵生產(chǎn)MK的菌種主要是革蘭氏陰性菌的產(chǎn)黃桿菌和屬于革蘭氏陽性菌的納豆芽孢桿菌。Yoshinori T等和Toshiro S等發(fā)現(xiàn)分別對納豆中分離的芽孢桿菌進行誘變處理后可以提高維生素K的產(chǎn)量。原生質(zhì)體融合起源于20世紀60年代，并于70年代逐漸發(fā)展起來的重要基因重組技術(shù)。是通過酶或機械的方法除去細胞壁，使雙親株的微生物菌體細胞形成球狀原生質(zhì)體，經(jīng)過物理、化學或生物方法使雙親株的原生質(zhì)體融合，再發(fā)生染色體基因組間的交換重組，使融合子具有雙親的優(yōu)勢性狀，在適宜的培養(yǎng)條件下再生細胞壁，經(jīng)過合理的篩選，從再生菌體中獲得重組子。近年來，該技術(shù)已成為細胞生物學研究領(lǐng)域迅速發(fā)展的方向之一。該技術(shù)不僅能夠改良菌種遺傳性狀、提升有用代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，還能綜合不同菌株的代謝特性，產(chǎn)生新的有用代謝產(chǎn)物，在工業(yè)生產(chǎn)和遺傳育種上展示出美好的應用前景。實踐證明，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以獲得具有雙親優(yōu)良特性的融合子，并且細菌之間的原生質(zhì)體融合可以克服細菌種屬之間的差異而實現(xiàn)基因重組。谷吉樹等試驗了甘油、葡萄糖、果糖和可溶性淀粉等十幾種碳源對產(chǎn)黃桿菌生產(chǎn)MK的影響，發(fā)現(xiàn)以甘油為碳源的培養(yǎng)基中MK的含量最高。納豆芽孢桿菌發(fā)酵時，盡管以蔗糖為碳源細胞增長最快，但以甘油為碳源時MK的產(chǎn)量最高。以大豆提取物為氮源時，MK-7產(chǎn)量最高，而且由于大豆提取物是納豆加工的副產(chǎn)物，因此價格也很便宜，是一種理想的氮源。酵母膏不適合單獨作氮源，但在另外加有氮源后，適當添加酵母膏會增加MK產(chǎn)量。無機鹽中，K2HPO4對MK特別是MK-4的影響很大，產(chǎn)黃桿菌發(fā)酵時需加入K2HP04、MgS04和NaCl，但是枯草桿菌的培養(yǎng)基中只需加入Κ2ΗΡ04。因此，特別需要一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，以解決上述現(xiàn)有存在的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提高了維生素K2的產(chǎn)量，為實現(xiàn)維生素K2規(guī)模化生產(chǎn)提供了有效方法。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題可以采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步驟(I)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得的高產(chǎn)菌株BKU-6 ；(2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養(yǎng)液中進行恒溫培養(yǎng)，再接種5%的活化培養(yǎng)基于IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；
(3)發(fā)酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾；(4)濾液經(jīng)揮發(fā)后即可得到維生素K2的油狀物，經(jīng)過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。在本發(fā)明的一個實施例中，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業(yè)大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。在本發(fā)明的一個實施例中，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間采用電融合方式進行融合。在本發(fā)明的一個實施例中，所述種子培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基，它包括如下質(zhì)量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水。在本發(fā)明的一個實施例中，所述恒溫培養(yǎng)的溫度為37°C，時間為12h。在本發(fā)明的一個實施例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的組分甘油5%,大豆提取物 3%,酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2Η200· lg/L 和 MgSO4 · 7H200. 3g/L，余量為水。在本發(fā)明的一個實施例中，所述發(fā)酵的溫度為37°C，時間為4d。 在本發(fā)明的一個實施例中，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中的維生素K2。在本發(fā)明的一個實施例中，所述離心處理的離心時間為15min，離心速率為8000rmpo本發(fā)明的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，通過高產(chǎn)維生素K2的納豆芽孢桿菌BS-53與生長速度快但維生素K產(chǎn)量低的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質(zhì)體融合，篩選具有雙親優(yōu)勢的融合子，利用獲得的高產(chǎn)而且生長速度快的高產(chǎn)菌株在優(yōu)化的發(fā)酵條件下生產(chǎn)維生素K2,并用異丙醇和正己烷來提取分離維生素K2,提高了菌種的生長速度和維生素K2的產(chǎn)量，為實現(xiàn)維生素K2規(guī)模化生產(chǎn)提供了有效方法，實現(xiàn)本發(fā)明的目的。本發(fā)明的特點可參閱以下較好實施方式的詳細說明而獲得清楚地了解。
具體實施例方式為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達成目的與功效易于明白了解，下面進一步闡述本發(fā)明。本發(fā)明的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，它包括如下步驟(I)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得的高產(chǎn)菌株BKU-6 ；(2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養(yǎng)液中進行恒溫培養(yǎng)，再接種5%的活化培養(yǎng)基于IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；(3)發(fā)酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾；(4)濾液經(jīng)揮發(fā)后即可得到維生素K2的油狀物，經(jīng)過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。 在本發(fā)明中，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業(yè)大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供；所述納豆芽孢桿菌BS-5菌株是一種從自然界中分離的可以產(chǎn)MK的革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌,但是產(chǎn)量比較低；納豆芽孢桿菌CICC 10262是一種MK產(chǎn)量低但生長速度快的菌株；納豆芽孢桿菌BS-53是納豆芽孢桿菌BS-5菌株誘變處理后MK產(chǎn)量高但生長速度慢的菌株。在本發(fā)明中，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間采用電融合方式進行融合。在本發(fā)明中，所述種子培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基，它包括如下質(zhì)量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水；所述恒溫培養(yǎng)的溫度為37°C，時間為12h。在本發(fā)明中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的組分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉 O. 6g/L, K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7H20 0. 3g/L，余量為水；所述發(fā)酵的溫度為37°C，時間為4d。在本發(fā)明中，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中的維生
素K2。在本發(fā)明中，所述離心處理的離心時間為15min，離心速率為8000rmp。實施例菌種復蘇菌種BS-5和CICC10262復壯后，接種于斜面固體培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)18_24h,置于4°C保存。種子培養(yǎng)活化菌種接入液體培養(yǎng)基中(30/250ml)，37 °C，120r/min恒溫培養(yǎng)48h。取種子培養(yǎng)液，按5%的接種量(v/v)接入到液體培養(yǎng)基中(30/250ml)，37°C，120r/min
恒溫培養(yǎng)。BS-5菌株的紫外誘變BS-5菌對數(shù)生長早期的菌懸液，于3500R/min離心收集菌體，用滅菌生理鹽水洗滌菌體2-3次后，制成細胞濃度為I X 108個/mL的菌懸液。在超凈工作臺上，吸取15mL菌懸液于直徑9cm的無菌培養(yǎng)皿中，調(diào)整培養(yǎng)皿至紫外燈(20W)的垂直距離為30cm。在紫外燈下照射45s后，連續(xù)處理兩代，將菌液涂布于抗性平板，37 °C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h，篩選得到BS-52菌。BS-5菌株的紫外誘變?nèi)S-52菌懸液9ml，加入亞硝基弧溶液1ml，使其在菌懸液中的終濃度達到100ug/ml，置于37°C恒溫振蕩30min，取出菌懸液8000r/min離心IOmin,棄去上清液，用生理鹽水洗滌2-3次，再用IOml液體培養(yǎng)基懸浮菌體，于37°C培養(yǎng)24h。制備的菌懸液，適當稀釋，取O. Iml涂布抗性平板，37°C恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24h，篩選得到BS-53菌。BS-53菌和CICC10262原生質(zhì)體制備將2%活化菌株CICC10262接種到20mL新鮮完全培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，加入青霉素O. 6U/mL繼續(xù)培養(yǎng)約2h，取菌液，離心lOmin，棄去上清液，用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. Omg/mL于37°C保溫lh，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質(zhì)體生成，當鏡檢有90%的原生質(zhì)體形成時，3000r/mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用高滲緩沖液(SMM)洗滌2次以除酶，最終懸浮于SMM中。將2%活化菌株BS-53菌接種到20mL新鮮完全培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長前期，加入青霉素2U/mL繼續(xù)培養(yǎng)約2h，取菌液，離心lOmin，棄去上清液，用磷酸緩沖液洗2次，再懸浮于高滲緩沖液(SMM)中。加入溶菌酶I. 4mg/mL于37°C保溫40min，每隔一段時間在倒置顯微鏡下觀察是否有原生質(zhì)體生成，當鏡檢有90%的原生質(zhì)體形成時，3000R/ mim離心lOmin，棄上清液，沉淀用SMM洗滌2次，懸浮于SMM中。原生質(zhì)體電融合BS_53菌(熱滅活法)和CICC10262菌株(紫外滅活法)分別經(jīng)過滅活后，取兩親本滅活原生質(zhì)體懸液各2ml，以I: I等量混合于滅菌離心管中，用SMM離心洗滌2次(3500r/min，IOmin)，并用電擊緩沖液離心洗滌一次，之后懸浮于電擊液中，調(diào)整原生質(zhì)體濃度為108個/ml。用無菌移液器取少量混合懸液注入Icm的融合電極小室中，置于倒置顯微鏡下，之后接通電融合儀，先接通成串電壓和電流，調(diào)整電壓的大小，當電極小室中的原生質(zhì)體在電壓的作用下逐漸形成串珠狀時，維持電壓幾分鐘，使其形成穩(wěn)定的串珠狀。再接通直流融合電壓，直流脈沖可瞬間可逆擊穿相鄰的原生質(zhì)體膜，從而觸發(fā)相鄰原生質(zhì)體的融合。將融合小室取出，放入超凈工作臺內(nèi)，靜置約5-10min，將電融合液用微量移液器接種于再生培養(yǎng)基上，于37°C培養(yǎng)4d,并從再生培養(yǎng)基上分離融合子。融合子的篩選選擇再生平板上生長速度快、菌落直徑大的單菌落，進行維生素K2高產(chǎn)菌株的初步篩選；淘汰菌落偏小、生長速度慢、易老化的菌落。將初篩菌株接種于液體復篩培養(yǎng)基中，37°C，200r/min培養(yǎng)4d，以MK產(chǎn)量作為篩選指標，同時以出發(fā)菌株作為對照，進一步篩選即可獲得MK產(chǎn)量最高的融合菌株BUK-6。納豆芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)納豆芽孢桿菌BUK-6接種至3L液體完全培養(yǎng)基(蛋白胨1%，葡萄糖O. 5%，酵母粉O. 5%，牛肉膏O. 5%和NaClO. 5%，余量為水)中，在恒溫搖床上，180rmp，37°C 條件下培養(yǎng) 10_12h。向3(T60L種子罐中加入無菌種子培養(yǎng)基(甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉O. 6g/L，K2HPO4 O. 3mol/L, CaCl2 · 2H20 O. lg/L 和 MgSO4 · 7Η200· 3g/L，余量為水)，種子灌液的滅菌溫度121°C，時間為15min，冷卻至37°C ;將納豆芽孢桿菌BUK-6活化菌液接種至種子罐中，溫度控制在37°C左右，罐壓為O. 5kg/cm2，種子罐轉(zhuǎn)速為180-220轉(zhuǎn)/分，通風量為10m3/h，生產(chǎn)周期4d。第九步維生素K2的分離純化發(fā)酵液中加入異丙醇和正已燒混合物,在搖床上220r/min震蕩IOmin后,8000rmp離心15min,取上清液過濾。
維生素K2的濃縮干燥濾液經(jīng)揮發(fā)后即可得到維生素K2的油狀物，經(jīng)過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。
權(quán)利要求
1.一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，它包括如下步驟 (1)用納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體融合后篩選獲得的高產(chǎn)菌株BKU-6 ； (2)納豆芽孢桿菌菌株BUK-6復合后，接種于20ml的種子培養(yǎng)液中進行恒溫培養(yǎng)，再接種5%的活化培養(yǎng)基于IOOml發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵； (3)發(fā)酵液中加入異丙醇和正已烷混合物處理，處理后進行離心處理，取上清液過濾； (4)濾液經(jīng)揮發(fā)后即可得到維生素K2的油狀物，經(jīng)過真空冷凍干燥后即可得到黃褐色維生素K2的成品。
2.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌BS-5是合肥工業(yè)大學食品學院微生物實驗室提供的，所述納豆芽孢桿菌CICC10262由中國微生物菌種保藏管理中心提供。
3.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述納豆芽孢桿菌BS-5突變體BS-53原生質(zhì)體和納豆芽孢桿菌CICC10262原生質(zhì)體之間采用電融合方式進行融合。
4.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基，它包括如下質(zhì)量百分比的組分蛋白胨1%，葡萄糖0. 5%，酵母粉0. 5%,牛肉膏0. 5%和NaCl 0. 5%,余量為水。
5.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述恒溫培養(yǎng)的溫度為37°C，時間為12h。
6.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下質(zhì)量百分比的組分甘油5%，大豆提取物3%，酵母粉0. 6g/L，K2HPO40.3mol/L, CaCl2 2H20 0. lg/L 和 MgSO4 7H20 0. 3g/L，余量為水。
7.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述發(fā)酵的溫度為37°C，時間為4d。
8.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述異丙醇和正已烷混合物中異丙醇和正已烷的體積比為I :2，處理方式為在搖床上以220r/min的速度震蕩lOmin，用于提取納豆芽孢桿菌發(fā)酵液中的維生素K2。
9.如權(quán)利要求I所述的利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，其特征在于，所述離心處理的離心時間為15min,離心速率為8000rmp。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于公開一種利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)維生素K2的方法，通過高產(chǎn)維生素K2的納豆芽孢桿菌BS-53與生長速度快但維生素K產(chǎn)量低的納豆芽孢桿菌CICC10262進行原生質(zhì)體融合，篩選具有雙親優(yōu)勢的融合子，利用獲得的高產(chǎn)而且生長速度快的高產(chǎn)菌株在優(yōu)化的發(fā)酵條件下生產(chǎn)維生素K2，并用異丙醇和正己烷來提取分離維生素K2，提高了菌種的生長速度和維生素K2的產(chǎn)量，為實現(xiàn)維生素K2規(guī)模化生產(chǎn)提供了有效方法，實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
文檔編號C12P7/66GK102808005SQ20121033941
公開日2012年12月5日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月14日
發(fā)明者劉國慶, 趙肖, 胡衛(wèi)華, 錢曉勇 申請人:上海紅馬飼料有限公司