專利名稱：解淀粉芽孢桿菌Ba168及其發(fā)酵培養(yǎng)方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于利用有益微生物對植物病害進行生物防治的領域，具體涉及解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amylolquefaciens)Bal68菌株，以及該菌株的發(fā)酵生產(chǎn)及其發(fā)酵產(chǎn)物對防治植物病原菌的作用。
背景技術：
植物病害的流行不但引起作物減產(chǎn)，給人類造成重大經(jīng)濟損失，甚至帶來災難性后果。植物病害的危害還會導致農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)低劣，不堪使用或加工，甚至導致人畜中毒。為防治植物病害，化學農(nóng)藥因為具有成本低、見效快、省時省力等優(yōu)點曾一度成為人們的首選，但是，化學農(nóng)藥一般不可降解，隨著化學農(nóng)藥的大量使用，引發(fā)了環(huán)境污染、生態(tài)破壞、食品污染等事件。這使研究開發(fā)利用生物農(nóng)藥成為植物保護工作者的重要研究課題。生物農(nóng)藥是指利用生物活體或其代謝產(chǎn)物針對農(nóng)業(yè)有害生物進行殺滅或抑制的制劑，具有安 全、高效、無污染等特點，與保護生態(tài)環(huán)境和社會協(xié)調(diào)發(fā)展的要求相吻合，是未來農(nóng)藥發(fā)展的必然趨勢。微生物農(nóng)藥是生物農(nóng)藥中應用最為廣泛的一類，也是生物防治的重要材料。微生物源農(nóng)藥的主要成分是微生物活體及其次生代謝產(chǎn)物，由于微生物種類多樣，其活性也很廣泛，包括殺蟲、殺菌、除草以及植物生長調(diào)節(jié)作用等。自然界中用于生防細菌的，主要有芽孢桿菌屬、假單胞菌屬。特別是近幾年，利用微生物防治植物真菌性病害由于對環(huán)境安全，可以減緩病原菌產(chǎn)生抗藥性，已經(jīng)成為當前防治植物病害的主流方法。解淀粉芽孢桿菌是一種嗜溫、好氧、產(chǎn)芽孢的桿狀細菌，其生理特征多樣，該菌在自然界中廣泛存在，對人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強的抗逆能力。解淀粉芽孢桿菌不僅可以在土壤、植物根際體表等外界環(huán)境中廣泛存在，而且是植物體內(nèi)常見內(nèi)生細菌，尤其是在植物的根、莖內(nèi)部。解淀粉芽孢桿菌通過成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)，改變其周圍菌群環(huán)境和種類，與病原菌競爭植物周圍的位點，并且分泌多種抗菌物質(zhì)以抑制病原菌生長，同時誘導植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達到改良土壤和生防的目的。尖孢鐮刀菌是一類既可侵染植物又可在土壤中生存的兼性寄生真菌，用化學農(nóng)藥難于防治，屬于頑固性病害。該類病菌和其他植物病原菌一樣，存在著種下分化，可侵染許多寄主植物，具有多種專化型。其中，侵染中草藥的塊根、塊莖的一部分專化型為尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum Shl,該菌可引起常見中草藥的根腐病等病害,而塊根、塊莖和鱗莖等恰好是許多名貴中藥材的藥用部位，經(jīng)濟價值高，而尖孢鐮刀菌的侵染使中藥材的藥用價值下降，另外，病原菌可以在病殘體和土壤中過冬，一旦發(fā)病，笠年仍會引起作物病害，持續(xù)影響作物產(chǎn)量，給我國中藥材產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于公開了一種解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462。
本發(fā)明的第二個目的在于公開了解淀粉芽孢桿菌Bal68的發(fā)酵方法，以及由該方法制備所得的發(fā)酵液。本發(fā)明的第三個目的在于公開了解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑及其制備方法。本發(fā)明的第四個目的在于公開了上述解淀粉芽孢桿菌Bal68、由解淀粉芽孢桿菌Bal68制備所得的發(fā)酵液以及解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的一種解淀粉芽孢桿菌Bal68，CGMCC No. 6462，該解淀粉芽孢桿菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。解淀粉芽孢桿菌Bal68的發(fā)酵方法，其中，所述發(fā)酵方法是以權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68為原料,包括下述步驟 (I)、菌種活化將解淀粉芽孢桿菌Bal68菌種接種到LB試管斜面上面，于30°C活化培養(yǎng)48h，所述LB培養(yǎng)基配方為酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水1000ml, pH 7. 4 7. 6，連續(xù)轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用。(2)、種子液的制備從斜面上挑取菌接種到裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，即得到種子液，所述的LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g, pH7. O ；(3)、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液先后進行種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；其中種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下種子罐發(fā)酵培養(yǎng)FJ液體培養(yǎng)基，裝料系數(shù)O. 7，培養(yǎng)條件26 28°C，48h，接種量9%，通氣量2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ；大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)FJ液體培養(yǎng)基(2(Γ36Τ)，裝料系數(shù)O. 7，培養(yǎng)條件26 28°C，60 70h，接種量9%，通氣量2. OL/min，攪拌轉速150r/min ；所述的FJ液體培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4O. 05%, MgSO4 · 7H20 O. 25%，F(xiàn)eSO4 · 7H20 O. 25%，其余為水，所列百分比為質(zhì)量分數(shù)。由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵方法制備所得的發(fā)酵液。解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑的制備方法，其中，所述制備方法是以由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液為原料，包括下述步驟(I)、過濾濃縮發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH至4. 5^5. O后，將發(fā)酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數(shù)為6-7倍；(2)、噴霧干燥向濃縮后的發(fā)酵液中添加發(fā)酵液質(zhì)量I. 0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質(zhì)碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經(jīng)噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進口溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度 60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液，其中，所述解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵所得。解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中，所述解淀粉芽孢桿菌Bal68是以由上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液為原料，通過下述方法制備所得
(I)、過濾濃縮發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)pH至4. 5^5. O后，將發(fā)酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數(shù)為6-7倍；(2)、噴霧干燥向濃縮后的發(fā)酵液中添加發(fā)酵液質(zhì)量I. 0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質(zhì)碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經(jīng)噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進口溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度 60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0上述技術方案所述一種解淀粉芽孢桿菌Bal68、上述技術方案所述的發(fā)酵液以及上述技術方案所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。根據(jù)上述技術方案所述的應用，其中，所述由尖孢鐮刀菌屬引起的作物根腐病為白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病。 本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明的解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462，環(huán)境相容性好，具有很高的生物活性，特別是對由鐮刀菌屬真菌引起的根腐病具有較好的防效，通過實驗證明，該解淀粉芽孢桿菌菌株制劑對西洋參根腐病、白術根腐病菌和三七根腐病菌等都具有很好的防治作用。 2、本發(fā)明為防治由鐮刀菌屬真菌弓I起的根腐病提供了一種新的微生物農(nóng)藥。菌株保藏信息本發(fā)明解淀粉芽孢桿菌Bal68，分類命名Bacillusamyloliquefaciens,已經(jīng)在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)進行保藏，保藏單位地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏編號為CGMCCNo. 6462，保藏日期為2012年8月21日。


圖I為解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462的16SrRNA同源序列比對分析樹狀圖。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對鐮刀菌屬真菌引起的根腐病防治中的應用作進一步的說明。實施例I :解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的分離與純化(I)、土樣采集從秦嶺深山原始森林土壤中選取多個地點，每個地點取3到15cm處土壤,混合過粗篩，取25g做分離用；(2)、培養(yǎng)基平板制備將NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基加熱融化倒入培養(yǎng)皿內(nèi)冷卻，制成NA培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基平板。所述的NA培養(yǎng)基配方為葡萄糖10g，瓊脂15g，牛肉浸膏3g，酵母膏l(xiāng)g，蛋白胨5g，水1L，pH 6. 8 7. O ；LB液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g, NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，pH 7. O ；
(3)、細菌的分離 平板接種分別采用涂抹法和混菌法接種。涂抹法分別取上述5個濃度土壤稀釋液O. 05ml，分別加入已做好的NA、LB平板上，用滅菌的玻璃刮刀將稀釋液均勻的涂布開。放入32°C恒溫箱中培養(yǎng)，設三個重復。混菌法分別取上述5個濃度土壤稀釋液1ml，加入培養(yǎng)皿中，將已熔化的45飛(TC的NA、LB培養(yǎng)基倒入，輕輕搖轉使樣品和培養(yǎng)基混合均勻，待培養(yǎng)基凝固后放入培養(yǎng)箱32°C恒溫培養(yǎng)，設三個重復；(4)、菌種的純化隨時觀察并記錄菌株的原始培養(yǎng)結果，統(tǒng)一編號。根據(jù)細菌的特征及時挑取單個細菌落至LB平板上，采用劃線分離的方法純化。·
實施例2 :解淀粉芽抱桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68 的鑒定對實施例I所得的解淀粉芽孢桿菌Bal68 CGMCC No. 6462的鑒定過程為(I)、形態(tài)特征在LB培養(yǎng)基上菌落呈圓形，表面有明顯光澤，不光滑；邊緣不規(guī)貝U，有擴散，表面褶皺；菌落呈乳白色，不透明，渾濁；具有一定的粘附性；所述的LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，瓊脂18g，水1000ml, pH為7. O。培養(yǎng)前期(5 12h)菌落呈無色透明液滴，有光澤；后期(24h后)呈白色不透明狀，較為暗淡。菌體桿狀，長約2 μ m，單生，周生鞭毛，產(chǎn)芽孢。革蘭氏染色呈陽性。(2)、生理生化實驗通過對解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)Bal68的生理生化特性試驗(如表I所示)并結合該菌株的形態(tài)特征，對照《伯杰氏細菌手冊》(Buchanan & Gibbons，1984)和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠和蔡妙英，2001)進行檢索，鑒定Bal68菌株為芽孢桿菌屬。表I解淀粉芽孢桿菌BA168菌株的生理生化特征
_測試項目_iSM_測試項目_結果
革蘭氏染色Gt脂_+
細胞ft徑>1μ m-BJJ膠液化+
細胞形狀桿狀硫化氫 +_形成芽泡_+_MW_+
權利要求
1.一種解淀粉芽孢桿菌Bal68，CGMCC No. 6462，該解淀粉芽孢桿菌Bal68的16SrDNA如序列表I所示。
2.解淀粉芽孢桿菌Bal68的發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā)酵方法是以權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68為原料,包括下述步驟 (1)、菌種活化將解淀粉芽孢桿菌Bal68菌種接種到LB試管斜面上面，于30°C活化培養(yǎng)48h，所述LB培養(yǎng)基配方為酵母浸膏5g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15 20g，水IOOOml，pH 7. 4 7. 6，連續(xù)轉接3代，確保菌株純度后，再接種到種子液中使用。
(2)、種子液的制備從斜面上挑取菌接種到裝有LB培養(yǎng)基的三角瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)，即得到種子液，所述的LB培養(yǎng)基配方為蛋白胨10g，NaCl 10g，水1L，酵母浸膏5g，ρΗ7· O ； (3)、發(fā)酵培養(yǎng)將種子液先后進行種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；其中種子罐發(fā)酵培養(yǎng)和大規(guī)模エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)步驟如下 種子罐發(fā)酵培養(yǎng)FJ液體培養(yǎng)基，裝料系數(shù)O. 7，培養(yǎng)條件26 28°C，48h，接種量9%，通氣量2. 5L/min，攪拌轉速200r/min ； 大規(guī)模エ業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)FJ液體培養(yǎng)基(2(Γ36Τ)，裝料系數(shù)O. 7，培養(yǎng)條件26 28°C，60 70h，接種量9%，通氣量2. OL/min，攪拌轉速150r/min ； 所述的FJ液體培養(yǎng)基配方為黃豆餅粉2%，葡萄糖1%，淀粉I. 5%，CaCO3O. 25%，K2HPO4.O.05%，MgSO4 · 7H20 O. 25%，F(xiàn)eSO4 · 7H20 O. 25%，其余為水，所列百分比為質(zhì)量分數(shù)。
3.由權利要求2所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵方法制備所得的發(fā)酵液。
4.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑的制備方法，其特征在于所述制備方法是以由權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液為原料，包括下述步驟 (1)、過濾濃縮發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)PH至4.5、. O后，將發(fā)酵液通過截留分子量40000 100000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45°C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數(shù)為6-7倍； (2)、噴霧干燥向濃縮后的發(fā)酵液中添加發(fā)酵液質(zhì)量I.0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質(zhì)碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經(jīng)噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進ロ溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0
5.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑由權利要求I所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵制備所得。
6.解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其特征在于所述解淀粉芽孢桿菌Bal68是以由權利要求3所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68發(fā)酵液為原料，通過下述方法制備所得 (1)、過濾濃縮發(fā)酵液用草酸調(diào)節(jié)PH至4.5、. O后，將發(fā)酵液通過截留分子量4000(Tl00000k的無機陶瓷超濾膜過濾分離，操作溫度為25 45 °C，膜通量為5(T60LMH，被截留在膜的進液側的溶液為芽孢溶液，芽孢溶液濃縮倍數(shù)為6-7倍； (2)、噴霧干燥向濃縮后的發(fā)酵液中添加發(fā)酵液質(zhì)量I.0%的白炭黑、微細滑石粉、輕質(zhì)碳酸鈣或2500目超細重鈣填料；再將芽孢溶液經(jīng)噴霧制成粉末，即得到解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑，其中噴霧干燥的進ロ溫度為17(Tl90°C，出口溫度為65 85°C，進料速度60mL/min，噴頭壓力 O. IOMPa0
7.權利要求I所述ー種解淀粉芽孢桿菌Bal68、權利要求3所述的發(fā)酵液以及權利要求6所述的解淀粉芽孢桿菌Bal68殺菌劑在制備防治由尖孢錸刀菌屬引起的作物根腐病藥物中的應用。
8.根據(jù)權利要求7所述的應用，其特征在于所述由尖孢錸刀菌屬引起的作物根腐病為白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病。
全文摘要
本發(fā)明公開了解淀粉芽孢桿菌Ba168及其制備方法和應用，其目的是提供一種植物病原菌的生物防治方法。該菌株已于2012年8月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號CGMCC No.6462。該菌株從秦嶺原始森林土壤中分離獲得，經(jīng)過菌種活化、搖瓶發(fā)酵、種子液發(fā)酵和大發(fā)酵罐發(fā)酵得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)過過濾濃縮、超濾膜分離、噴霧干燥和包裝后制成殺菌劑。本發(fā)明具有對由尖孢鐮刀菌引起的白術根腐病、西洋參根腐病和三七根腐病等根腐病害有很好的防治作用的優(yōu)點。
文檔編號C12N1/20GK102839142SQ201210342838
公開日2012年12月26日 申請日期2012年9月14日 優(yōu)先權日2012年9月14日
發(fā)明者楊軒, 翟楓, 楊長鎖, 安德榮 申請人:楊凌綠都生物科技有限公司