專利名稱：一種標準攻擊毒株cvs-11的重組病毒及其制備方法
技術領域：
本發明公開一種標準攻擊毒株CVS-Il的重組病毒(縮寫為rCVS-ll-eGFP)同時還提供了該重組病毒的制備方法，用于動物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗體的檢測抗原，屬于生物技術領域。
背景技術：
狂犬病(Rabies)即瘋狗病，又稱恐水病，是由狂犬病病毒(Rabies Virus)感染溫血動物和人而引起、主要侵害中樞神經系統的一種人畜共患性傳染病。我國人類狂犬病的傳染源中，犬貓占85%-95%，WHO研究表明，70%左右的犬群免疫率能高效阻斷狂犬病的傳播鏈。因此，建立完善的動物狂犬病預防體系，時地監測動物機體抗體水平非常重要。
目前，狂犬病病毒中和抗體檢測方法主要有快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)和熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)。RFFIT主要用于人疫苗接種后血清樣品抗體水平的測定，RFFIT用于檢測動物血清樣品抗體水平時，尤其當抗體水平較低時，存在一定比例的假陽性；并且在結果判定時受主觀因素影響大(需人工準確計算出病毒增殖時形成的熒光灶數量)。OIE推薦采用FAVN對動物血清效價進行測定，檢測結果一致性好外，在結果判定時，FAVN受主觀因素影響較小，且適合于大規模樣品的檢測。兩種方法均應用標準攻擊毒株CVS-11，對實驗室條件、操作人員素質要求較高；熒光抗體價格高昂、熒光發光持續時間短，檢測成本高；需要丙酮固定，操作步驟繁多，對操作人員有微神經毒性和粘膜刺激。反向遺傳學(Reverse Genetics)是從生物的遺傳物質入手,通過有目的、精確地改造基因結構以觀察這些改變對表型和性狀的直接影響。RNA病毒的反向遺傳學技術是指由病毒cDNA克隆獲得RNA病毒的一項技術，通過人為操作cDNA，從而實現對RNA病毒基因組的人工操作。反向遺傳系統為RNA病毒的分子生物學研究提供了強大的工具。自20世紀70年代后期第一例RNA病毒感染性克隆構建成功以來，RNA病毒的分子生物學研究取得了快速進展，這很大程度應歸功于各種RNA病毒反向遺傳系統的建立。目前，國內外尚未有國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統的報道。國內外尚沒有一種真正意義上快速、經濟、高效的狂犬病病毒中和抗體的檢測方法。

發明內容
本發明提供了一種國際標準攻擊毒株CVS-II的重組病毒，用于檢測動物和人抗狂犬病病毒中和抗體效價，建立的一種快速、特異、方便的新型狂犬病病毒中和抗體檢測方法。本發明還公開了國際標準攻擊毒株CVS-Il的重組病毒的制備方法，適用于工業
化生產。本發明進一步建立了國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統。本發明公開的基于國際標準攻擊毒株CVS-Il的重組病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于
以國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統為基礎,在CVS-Il基因組G-L處插入eGFP基因，構建獲得表達eGFP的重組病毒rCVS_ll_eGFP。本發明所述重組病毒rCVS-11-eGFP的制備方法，包括以下步驟1)國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統的建立，具體包括全長質粒pcDNA3. I-CVS-11 及輔助質粒系統 pcDNA3. l_N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. 1_L，4個輔助質粒分別表達CVS-II株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大轉錄蛋白L，以及應用此系統拯救的重組病毒rCVS-11 ；
2)在CVS-Il反向遺傳操作系統基礎上，構建CVS-Il綠色熒光蛋白重組病毒載體pCVS-11-eGFP，拯救獲得重組病毒 rCVS_ll_eGFP ；
3)rCVS-11-eGFP按MOI=O. I接種于BHK-21細胞，經擴大培養，rCVS-11-eGFP病毒滴度可達到IO9 TCID5(l/mL，一 70°C保存備用。根據權利要求I所述重組病毒rCVS-11-eGFP的制備方法，包括以下步驟
O建立國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統
提取CVS-Il細胞毒的總RNA，反轉錄獲得cDNA ;分4段擴增CVS-Il全基因組cDNA， 通過引物添加酶切位點，將CVS-Il基因組的G-L處替換為BssH II ,BsiwI和Sac II 3個限制性內切酶序列；4個擴增片段經多步酶切連接插入到pcDNA3. I的Kpn I和Not I處；在cDNA兩端加入錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶序列；通過單鏈合成錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶的部分序列，變性退火后形成雙鏈錘頭狀核酶序列和丁型肝炎核酶序列，并分別插入到pcDNA3. I 的 Nhe I -Kpn I 處和 Not I -Pme I 處，獲得全長質粒 pcDNA3. I-CVS-11 ;構建輔助質粒，克隆CVS-Il的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框(0RF)，分別定向克隆至 pcDNA3. 1，分別得到 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和 pcDNA3. I-L ；pcDNA3. I-CVS-11 和 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L共轉染NA細胞，經免疫熒光染色鑒定，確定成功拯救到重組病毒rCVS-11 ；
2) rCVS-11-eGFP的構建及拯救
從pIRES2-eGFP載體上擴增eGFP基因，上下游引物分別添加BsiW I和Sac II酶切位點；在CVS-11反向遺傳操作系統基礎上，經酶切連接，將eGFP基因定向克隆至pcDNA3. I-CVS-11 的 BsiwI-Sac II 處，得到重組質粒 pCVS-ll-eGFP ；pCVS-ll-eGFP 和pcDNA3. l-N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L 共轉染 BHK-21 細胞，培養后在熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光蛋白的表達，重組病毒rCVS-11-eGFP拯救成功。本發明所構建的重組病毒rCVS-11-eGFP作為檢測抗原，包括以下步驟
滅活待檢血清，于96孔板中操作待檢血清經3X倍比稀釋，做6個稀釋度，每個樣品
4個重復。加入含100 TCID5tl的病毒液rCVS-11-eGFP，與中和抗體感作lh，加入BHK-21細胞培養48h，直接在倒置熒光顯微鏡藍紫光下觀察有無蘋果綠色熒光。結果判定標準同標準FAVN相同孔內有一個以上熒光灶的，記“ ” ;孔內沒有熒光灶的，記“一”。記錄結果，通過Spearman-Karber公式計算出待檢血清的抗體效價。以上測定結果與標準FAVN測定結果相比較，二者一致性良好。FAVcN-eGFP具有快速、特異、便捷等優點。FAVJ-eGFP可作為一種快速、特異、便捷的檢測方法。本發明的標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統，其特征在于
包括全長質粒pcDNA3. I-CVS-11及輔助質粒系統pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和pcDNA3. 1_L，4個輔助質粒分別表達CVS-11株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大轉錄蛋白L，以及拯救的重組病毒rCVS-11。本發明的積極效果在于利用反向遺傳學方法，在國內外首次建立了狂犬病病毒國際標準攻擊毒株CVS-Il的反向遺傳操作系統,為進一步修飾或改造CVS-Il基因組結構提供有效平臺，為從分子水平上研究狂犬病病毒的致病機理、抗原位點及毒力決定位點等奠定了基礎。在CVS-Il反向遺傳操作系統的基礎上，構建拯救了基于國際標準攻擊毒株CVS-Il的重組病毒rCVS-ll-eGFP。rCVS_ll_eGFP在增殖過程中表達eGFP，可用于直接觀察病毒的增殖狀態及擴散。利用eGFP無毒性、可以不需依賴任何輔助因子或其他基質而自主發光等特點，將rCVS-11-eGFP作為檢測抗原，用于測定抗狂犬病病毒中和抗體效價，結果判定時，無需固定染色等操作，經濟便捷。以rCVS-11-eGFP為檢測抗原，建 立了一種新型狂犬病病毒中和抗體檢測方法(FAVcN-eGFP )，與標準FAVN —致性良好。FAVJ-eGFP具有特異性高，經濟便捷等優點。FAVcN-eGFP能夠及時提供準確的免疫監測數據，有助于預防狂犬病，對定量評價疫苗免疫效果具有重要意義。


圖I為狂犬病病毒標準攻擊毒株CVS-II全長cDNA重組質粒 pcDNA3. I-CVS-11的構建示意 圖2為從全長重組質粒pcDNA3. I-CVS-11構建重組質粒pCVS-11-eGFP的策略；
圖3為重組病毒rCVS-11感染NA細胞的免疫熒光照片(200 X )；
圖4為rCVS-11-eGFP感染BHK-21的免疫熒光照片和BHK-21陰性細胞(200 X )；
圖5為rCVS-11-eGFP感染BHK-21后表達eGFP的照片(200 X )；
圖6為rCVS-11-eGFP的電子顯微鏡觀察圖(40KX );
圖7為wtCVS、rCVS-11和rCVS-11-eGFP在NA細胞上的生長曲線；
圖8為FAVeN-eGFP同FAVN對血清效價的測定結果比較。
具體實施例方式為了便于理解本發明，特例舉以下實施例。其作用是對本發明的闡釋而非對本發明的任何形式的限制。實施例I
I.CVS-Il全基因組CDNA重組質粒的構建
按照Simple P Total RNA Extraction Kit說明書，提取CVS-11細胞毒的總RNA。參照AMV反轉錄酶(Promega公司)說明書，獲得病毒基因組cDNA。利用DNAMAN軟件分析CVS-Il全基因組的單一性酶切位點，設計4對引物(如表1)，為方便將分段擴增片段拼接至pcDNA3. I，及后續實驗室改造CVS-II基因組，引物上下游添加了相應酶切位點。以病毒cDNA為模板，參照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase說明書及表I中的引物及其退火溫度，對全基因組分4段進行PCR擴增，同時利用引物將G-L處替換為BssH II ,BsiwI和Sac II 3個限制性內切酶序列。擴增片段Fl和F4連接至平端克隆載體pEASY-Blunt Simplevector, F2、F3 片段連接至 pEASY-Blunt vector。利用 pEASY-Blunt vector 本身存在的酶切位點Kpn I和Not I。將pEASY-Fl和pEASY_F2用Kpn I和Blp I雙切，回收Fl片段和含F2的載體片段，用T4連接酶連接，轉化trans 10感受態，挑取陽性克隆，送上海生工測序正確，得到PEASY-F1-F2。將pEASY_F3和pEASY_F4用Cla I和Not I雙切，回收F4片段和含F3的載體片段，用T4連接酶連接，轉化trans 10感受態，挑取陽性克隆，送上海生エ測序正確，得到 PEASY-F3-F4。將 pEASY_Fl_F2 和 pEASY_F3_F4 用 Bsiw I 和 Not I 雙切，回收F3-F4片段和含F1-F2的載體片段，用T4連接酶連接，轉化trans 10感受態，挑取陽性克隆，得到 pEASY-CVS-11。為了使病毒基因組cDNA轉錄時，能夠產生精確的5’末端和3’末端，在病毒cDNA兩端分別添加錘頭狀核酶(HamRz)和丁型肝炎核酶(HdvRz)。根據兩種核酶的ニ級結構及作用原理，合成部分HamRz和HdvRz序列(如表2)，HamRz-A, B經變性、退火形成兩端為Nhe I、Kpn I 黏性末端的雙鏈 HamRz-AB, Nhe I、Kpn I 雙切 pcDNA3. I 后與 HamRz-AB 連接，得到pcDNA3. 1-HamRz-AB。HdvRz_A、B變性、退火形成兩端為Not I ,Pme I末端的雙鏈HdvRz-AB, Not I、Pme I 雙切 pcDNA3. I-HamRz-AB 后與 HdvRz-AB 連接，轉化 trans 10 感受態，挑取陽性克隆，送上海生エ測序正確，得到pcDNA3. I-HamRz-HdvRz。Kpn I 和 Not I 分別雙酶切 pEASY-CVS-11 和 pcDNA3. I-HamRz-HdvRz,回收病毒基因組cDNA拼接片段(F1-F2-F3-F4)和pcDNA3. I-HamRz-HdvRz載體片段，T4連接酶連 接，轉化trans 10感受態，挑取陽性克隆，送上海生エ測序正確，得到病毒cDNA全長質粒pcDNA3. I-CVS-Il0 用 QIAGEN 公司的 HiSpeed Plasmid Midi Kit 制備中量高純度質粒，于ー 70°C保存待用。表I CVS-Il全基因組分段擴增用引物
U__耐請-"_I Im I ■ Hl
Fl- AOC TQ TAC C C TATA0TCAG5 C TT AAC AAC\Kpm I63で
2399bp I
FJ-SC ATC T TO CATO ATTT TOC T-AOC TTOfCiBiplmv
77-7C G AG G C T G At AAGC Tft AG C AflAA T C&T GC AA ￠-A;日 Ip J5 U
I 2024bp 丨 a .
II Qsm II
12-T1 AAACO TAC^TTAOCe CO C AA 0 T TTT て T TT 各 0 TTAIX C T3OSU
_ __\ 0 55 H Q__」
II Bsm I1
f3~ TC 0 C- TAA6 I C C- C O-C T6C 0 TC A.TC TA AS j09 TT
m _a TAAC A CI T4 C C T TC TC TC MAO TG _I| CIa I 7QV
r ~rTToccctt< caaccsatgtottapctcsaac| cia i mv
2047b I
fa-S^CSOCCGCICCG AC C CftC^C rTAAC AAAftAftAC[ Hots__0 C J
表2合成的核酶序列
鯪鐵鬆稗mT
H SmRfA C- T-feQTO t TAAOC QTC TQ AO TCCOTy ACTA T ft 0 C- ^ TO AOO T A. C Hhrl ,
HC I C AC C C TATA4 f t TC 0 IC C T C AC C'^ftt TI Al C At^CfTAACftf
H <-<- C C <-C Q <n t C ACC TC CtC^C TC CvftCC- T'X-OCATCC 0-
兵 AO GA 奪 C*AC OC-AC C* rCC AC lC5J0/iT0^CQ 旮 ft.C.C.C,
Hot i
TC C C TTAC- C C ATC— C A C* 1" な. C 奪 TC* C *5 TCCTC C T C—O AT 6 C-
N dvRr Bfmt I
■ C C AC'* 5 TCO<5 ACCdC C*A<>0AC^> T <3-C A C C C T 0 C
2.輔助質粒的構建
設計引物(如表3),以病毒cDNA為模板，參照TransStart Fast Pfu DNA Polymerase說明書及表3中的引物及其退火溫度，對CVS-Il的N、P、G和L基因的開發閱讀框(ORF)進行PCR擴增。由于L基因太長，分兩段擴增后進行拼接。擴增產物經酶切連接，克隆至真核表達載體pcDNA3. 1，轉化trans 10感受態，挑取陽性克隆，送上海生エ測序正確，得到輔助質粒 pcDNA3. 1-N、pcDNA3.トP、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3.トし用 QIAGEN 公司的 HiSpeedPlasmid Midi Kit制備中量高純度質粒，于ー 70°C保存待用。表3 N、P、G和L基因擴增引物
權利要求
1.一種基于國際標準攻擊毒株CVS-Il的重組病毒rCVS-11-eGFP，其特征在于 以國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統為基礎,在CVS-Il基因組G-L處插入eGFP基因，構建獲得表達eGFP的重組病毒rCVS_ll_eGFP。
2.根據權利要求I所述重組病毒rCVS-11-eGFP的制備方法，包括以下步驟 1)國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統的建立，具體包括全長質粒pcDNA3. I-CVS-11 及輔助質粒系統 pcDNA3. l_N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. 1_L，4個輔助質粒分別表達CVS-II株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大轉錄蛋白L，以及應用此系統拯救的重組病毒rCVS-11 ； 2)在CVS-Il反向遺傳操作系統基礎上，構建CVS-Il綠色熒光蛋白重組病毒載體pCVS-11-eGFP，拯救獲得重組病毒 rCVS-11-eGFP。
3.根據權利要求I所述重組病毒rCVS-11-eGFP的制備方法，包括以下步驟 O建立國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統 提取CVS-Il細胞毒的總RNA，反轉錄獲得CDNA ;分4段擴增CVS-Il全基因組cDNA，通過引物添加酶切位點，將CVS-Il基因組的G-L處替換為BssH II ,BsiwI和Sac II 3個限制性內切酶序列；4個擴增片段經多步酶切連接插入到pcDNA3. I的Kpn I和Not I處；在cDNA兩端加入錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶序列；通過單鏈合成錘頭狀核酶和丁型肝炎核酶的部分序列，變性退火后形成雙鏈錘頭狀核酶序列和丁型肝炎核酶序列，并分別插入到pcDNA3. I 的 Nhe I -Kpn I 處和 Not I -Pme I 處，獲得全長質粒 pcDNA3. I-CVS-11 ;構建輔助質粒，克隆CVS-Il的核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、糖蛋白(G)和聚合酶蛋白(L)基因的開放閱讀框(0RF)，分別定向克隆至 pcDNA3. 1，分別得到 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和 pcDNA3. I-L ；pcDNA3. I-CVS-11 和 pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L共轉染NA細胞，經免疫熒光染色鑒定，確定成功拯救到重組病毒rCVS-11 ； 2)rCVS-11-eGFP的構建及拯救 從pIRES2-eGFP載體上擴增eGFP基因，上下游引物分別添加BsiW I和Sac II酶切位點；在CVS-II反向遺傳操作系統基礎上，經酶切連接，將eGFP基因定向克隆至pcDNA3. I-CVS-11 的 BsiwI-Sac II 處，得到重組質粒 pCVS-11-eGFP ；pCVS-1 Ι-eGFP 和pcDNA3. l-N、pcDNA3. l_P、pcDNA3. I-G 和 pcDNA3. I-L 共轉染 BHK-21 細胞，培養后在熒光顯微鏡下觀察到有綠色熒光蛋白的表達，重組病毒rCVS-1 Ι-eGFP拯救成功。
4.權利要求I所述重組病毒rCVS-11-eGFP作為檢測抗原，用于檢測動物和人血清中抗狂犬病病毒中和抗體效價，由此建立的一種新型狂犬病病毒中和抗體檢測方法。
5.—種國際標準攻擊毒株CVS-Il反向遺傳操作系統,其特征在于 包括全長質粒pcDNA3. I-CVS-11及輔助質粒系統pcDNA3. 1_N、pcDNA3. 1_P、pcDNA3. I-G和pcDNA3. 1_L，4個輔助質粒分別表達CVS-Il株的核蛋白N、磷酸蛋白P、糖蛋白G和大轉錄蛋白L，以及拯救的重組病毒rCVS-11。
全文摘要
本發明提供一種標準攻擊毒株CVS-11的重組病毒及其制備方法，利用反向遺傳學方法建立了狂犬病病毒國際標準攻擊毒株CVS-11的反向遺傳操作系統，為進一步修飾或改造CVS-11基因組結構提供有效平臺，為從分子水平上研究狂犬病病毒的致病機理、抗原位點及毒力決定位點等奠定了基礎。在CVS-11反向遺傳操作系統的基礎上，構建拯救了基于國際標準攻擊毒株CVS-11的重組病毒rCVS-11-eGFP。rCVS-11-eGFP在增殖過程中表達eGFP，可用于直接觀察病毒的增殖狀態及擴散。利用eGFP無毒性、可以不需依賴任何輔助因子或其他基質而自主發光等特點，將rCVS-11-eGFP作為檢測抗原，用于測定抗狂犬病病毒中和抗體效價，結果判定時，無需固定染色等操作，經濟便捷。
文檔編號C12N7/01GK102864126SQ201210346779
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者夏咸柱, 楊松濤, 薛向紅, 鄭學星, 高玉偉, 馮娜, 王化磊, 王承宇, 黃耕, 王鐵成, 趙永坤 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院軍事獸醫研究所