專利名稱：一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法
技術領域：
一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法，本發明涉及一種快速高效構建點突變重組質粒的方法，屬于微生物基因工程領域。
背景技術：
PCR技術類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱至94°C左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退 火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的“半保留復制鏈”。通過巧妙設計單點突變，將質粒定點突變技術變得簡單有效。設計一對包含突變位點的引物(正、反向)，和模板質粒退火后用高保真DNA聚合酶“循環延伸”，(所謂的循環延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端終止，再經過反復加熱褪火延伸的循環，這個反應區別于滾環擴增，不會形成多個串聯拷貝。)正反向引物的延伸產物退火后配對成為帶缺刻的開環質粒。之后用DpnI酶切延伸產物，由于原來的模板質粒來源于常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的，對DpnI敏感而被切碎(DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質粒中都會出現，而且不止一次)，而體外合成的帶突變序列的質粒由于沒有甲基化而不被切開，因此在隨后的轉化中得以成功轉化，即可得到突變質粒的克隆。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法。本發明的具體步驟如下I)把兩個突變位點分別設計在兩條延伸方向相向的引物上；2) PCR擴增步驟與普通PCR —致，但是延伸溫度的時間設定與該重組質粒的長度有關，一般含7000b堿基數的重組質粒延伸時間約為5-8min ；3) PCR擴增步驟與普通PCR —致，但是PCR擴增循環數一般約為15_20次；4) PCR擴增完成后經DpnI酶消化模板質粒3h后直接轉化感受態細胞；5)選擇陽性克隆測序。本發明所述PCR擴增步驟與普通PCR —致，只是延伸溫度的時間設定要根據重組質粒的長度而定，PCR擴增循環數也要盡量少一些，一般15-20次為宜，盡量減少因PCR擴增循環數過多而引起的其它突變。本發明的詳細的步驟為
I)把兩個突變位點分別設計在兩條延伸方向相向的引物上突變位點設計的時候要注意，突變引物5 ‘端離突變位點的堿基數比3 ‘端離突變位點的堿基數要多一些，一般5 ‘端離突變位點的堿基數為15-30bp，而3 ‘端離突變位點的堿基數為6-15bp。2)設定PCR擴增程序PCR反應條件
預變性94°C4 min 變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最后延伸72°C5 min“變性-退火-延伸”這個過程進行15-20個循環。3) PCR擴增完成后經DpnI酶消化模板質粒3h后直接轉化感受態細胞PCR擴增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有弱的條帶就可以了。再用DpnI酶消化模板質粒3h，之后可直接轉化克隆宿主菌或表達宿主菌。4)選擇陽性克隆測序本發明的有益效果本發明提供了一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法。
圖I.快速高效構建兩點突變重組質粒的原理
具體實施例方式材料和檢測方法臆水合酶基因B (GenBank U89363. I)來自惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)NRRL-18668 ( “A stereoselective cobalt-containing nitrile hydratase”發表在 1997的 Biochemistry)。模板質粒 pET24a(+)_B。實施例II)根據腈水合酶基因序列B(GenBank U89363. I)設計引物2)把兩個突變位點分別設計在兩條延伸方向相向的引物上突變位點設計的時候要注意，突變引物5 ‘端離突變位點的堿基數比3 ‘端離突變位點的堿基數要多一些，一般5 ‘端離突變位點的堿基數為15-30bp，而3 ‘端離突變位點的堿基數為6-15bp。本實例希望突變腈水合酶第10位的丙氨酸為半胱氨酸和第172位的丙氨酸為半胱氨酸，根據上述引物設計原則，設計上游突變引物5 <-tggcattcacgatactggcggat￡ccatggttat-3> (如 SEQ ID NO. I所示)；下游突變引物5 <-gggctgctcgccctttccgtgtgc￡ca￡gtgtcc-3> (如 SEQ ID NO. 2所示)；下劃線的核苷酸為突變位點。
3)設定PCR擴增程序PCR反應條件
預變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min 最后延伸72°C5 min“變性-退火-延伸”這個過程進行15-20個循環。4) PCR擴增完成后經DpnI酶消化模板質粒3h后直接轉化感受態細胞PCR擴增完成后，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有弱的條帶就可以了。然后再用DpnI酶消化模板質粒3h，之后直接轉化E. coli BL21 (DE3)表達宿主菌。5)選擇陽性克隆測序選擇陽性克隆送生工生物工程上海股份有限公司測序，測序結果(如SEQ ID NO. 3所示)顯示成功突變了第10位和第172位兩個位點。
權利要求
1.一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法，是采用把兩個突變點分別設計在兩個特異性引物片段上，通過一步PCR獲得含兩點突變的重組質粒的方法。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，一步PCR擴增得到含兩點突變的重組質粒，不需要酶切、連接等傳統的質粒構建方法。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，PCR擴增的模板是已經構建好的重組質粒。
4.如權利要求I所述的方法，其特征在于，兩個突變點分別設計在兩個特異性引物上。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，兩個引物擴增的方向相向。
6.如權利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR延伸時間為延伸整個重組質粒長度的時間，一般含7000bp堿基數的重組質粒延伸時間約為5-8min。
7.如權利要求5所述的方法，其特征在于，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR擴增循環數一般約為15-20次。
8.如權利要求I所述的方法，其特征在于，PCR擴增完成后經DpnI酶消化模板質粒3h后直接轉化感受態細胞。
全文摘要
本發明公開了一種快速高效構建兩點突變重組質粒的方法，是采用是把兩個突變點分別設計在兩個特異性引物片段上，通過一步PCR獲得含兩點突變的重組質粒的方法，屬于基因克隆技術領域。本發明方法操作簡單，具有非常高的效率和成功率。
文檔編號C12N15/64GK102899345SQ20121034524
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者周哲敏, 劉義, 崔文璟, 周麗, 周月涵 申請人:江南大學