專利名稱：miRNA 423-5p在前列腺癌血清學診斷試劑盒中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種微小RNA (micro RNA, miRNA, miR) 423_5p在前列腺癌血清學診斷試劑盒中的應用。屬于生物醫學材料技術領域。
背景技術：
前列腺癌(prostate carcinoma, PCa)為歐美國家男性常見惡性腫瘤和主要死亡原因之一。隨著我國人均壽命延長和生活方式的西化，PCa發病率呈逐年增加趨勢，它被列為中國21世紀增長最快的腫瘤之一。本項目在前期工作中篩選出的19個在前列腺癌組織中 表達上調的miRNAs序列的基礎上，進一步檢測其在臨床血清樣本中的含量，尋找人前列腺癌轉移患者的血清學生物標志物。目前前列腺癌診斷指標的研究工作主要集中在以下幾個方面=(I)PSA亞型和其它的激肽釋放酶(如血清KLK2) ; (II)DNA生物標志物，包括一些表觀遺傳學生物標志物(如GSTPi甲基化)，基因融合(如TMPRSS2:ERG融合)和雜合性缺失等；(III)RNA生物標志物，如非編碼的前列腺特異的RNA PCA3 (曾被稱為DD3)和α -甲基酰基輔酶A消旋酶(Alpha-methylacyl CoA racemase, AMACR)mRNA在前列腺癌中的表達；(IV)蛋白分子標志物，如 PSA,前列腺特異膜抗原(prostate-specific membrane antigen, PSMA),前列腺干細胞抗原(prostatestem cell antigen, PSCA)等。盡管許多候選的生物學標志物在不斷地被發現，尚無新的指標和方法應用于臨床檢測。miRNAs是一種新的不編碼蛋白的內源性小RNAs，它們通過抑制蛋白質翻譯過程在細胞增殖、凋亡以及分化等生物學功能方面發揮著重要的調控作用。通過miRNAs微列陣、Northern blot和實時PCR等手段,在多種類型人腫瘤中已經發現了一些miRNAs表達上調和下調的現象。有研究報道了 miRNA在乳腺癌和肝癌轉移中發揮了重要的作用。近年研究發現，人血漿和血清中存在其它組織來源的miRNAs，它們可以以一種可抵抗內源性RNA酶活性的形式存在。測定血漿或血清中腫瘤來源miRNAs的含量可以作為腫瘤檢測的手段之一。近年有研究者報道從血清和其它一些體液中miRNA的水平可以診斷一些處于早期的疾病。2008年Mitchell報道，miR-141在前列腺癌組患者血清中比對照組高46倍，而且其靈敏度為60%，特異性為100%。對于血清中miRNAs的深入研究可為尋找疾病生物標志物提供新的獨特視角。有研究報道，miR-423-5p在肝癌、胰腺癌、膀胱癌、膠質母細胞瘤、甲狀腺乳頭狀癌、黑色素瘤等大部分人腫瘤中頻繁高表達。它通過靶向作用于抑癌基因如p27、p57，PTEN，前凋亡因子Bim、Bmf等，抑制細胞凋亡、促進細胞生長和遷移，參與腫瘤的發生發展過程。目前的研究結果提示miRNA-423-5p可能是一種致癌miRNA，在人類多種腫瘤的發生和發展階段扮演著至關重要的角色
發明內容
本發明的目的是提供檢測血液中miR-423_5p的試劑在制備用于前列腺癌血清學診斷的試劑盒中的應用。本發明利用我們發明的異種移植模型和新一代測序技術，對轉移和非轉移前列腺癌異種移植組織系中miRNAs的轉錄組學進行了深入的研究，初步發現miR — 423_5p與前列腺癌的惡性程度相關(ffatahiki et al. , PLOS One 2011)。我們優化了從血清中提取miRNA的方法以及用實時定量PCR檢測miRNA的方法；整理和收集了百余份前列腺癌患者的病理資料和血清樣本；對用異種移植模型篩選出的在轉移前列腺癌組織中上調的19個miRNA序列進行了臨床血清樣本的檢測，揭示了 miR —423-5p在前列腺癌患者血清中和組織中含量明顯升高。該 發明對開發中國人群前列腺癌的血清學臨床診斷方案中具有重要的應用前景。本發明首先提供了一種檢測血液樣品中微小RNAmiR-423-5p及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應用，所述試劑是對微小RNAmiR-423-5p及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-423_5p及其前體有檢測特異性的PCR引物和雜交探針以及利用該探針制備的基因芯片。所述miR-423-5p 的序列如 SEQ ID NO 1 所示；在一個優選例中，所述特異性引物選自SEQ ID NO: 2所示序列；在一個優選例中，所述特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。本發明通過檢測血液中miR-423_5p的含量來診斷對象是否患有前列腺癌。在一個優選例中，通過實時定量PCR方法對miR-423-5p進行測定，包括(I)提取對象血液樣品中的RNA，并添加人工合成的線蟲miR-39寡聚核苷酸作為參照物；(2)利用反轉錄方法合成cDNA ；(3)采用實時定量PCR方法檢測樣品中miR-423-5p的含量；(4)用線蟲miR-39的含量作為參照進行標準化。如果對象血清中miR — 423_5p含量與正常對照組相比明顯升高，則診斷該對象罹患前列腺癌。當檢測結果顯示對象血液中微小RNA miR-423_5p或其前體的水平高于對照血清中的水平，則提示所述對象罹患前列腺癌。其次，本發明同時提供了一種前列腺癌診斷試劑盒，該試劑盒檢測的目標核酸為具有SEQ ID NO 1所示多核苷酸序列的miR-423-5p，具體包括(I)聚合酶鏈反應試劑；包括熱啟動Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR-423-5p特異性引物；在一個優選例中，所述miR-423_5p特異性引物選自SEQ IDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’ (SEQ IDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。本發明的優點和有益效果利用本試劑盒中提供的試劑，結合本領域研究人員熟知的RNA提取試劑和通用miRNA反轉錄試劑，本發明可以特異性地檢測血清中miR-423-5p的含量，有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。


圖I為內參miRNA和目的miRNA的實時PCR擴增曲線和溶解曲線，可見溶解曲線均為單峰，無非特異性峰出現；圖2為qRT-PCR檢測miR-423_5p在正常人和前列腺癌患者血清中的表達量柱高=x>SE ；圖3為miR-423_5p在前列腺癌患者血清中相對表達量ROC曲線分析。圖4 為前列腺組織的miR-423-5p FISH照片(200X )A :Normal prostate B PCa-l(gleason score :6 分)C :PCa_2 (gleason score :9 分)。
具體實施例方式
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實施例I本發明首先提供了一種檢測血液樣品中微小RNA miR-423_5p及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應用，所述試劑是對微小RNAmiR-423-5p(如SEQ ID NO 1所示)及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-423_5p及其前體有檢測特異性的PCR引物和探針及使用該探針制備的基因芯片。所述的特異性引物選自SEQ ID NO:2所示序列；所述的特異性探針選自SEQ ID N0:5所示序列。實施例2、前列腺癌診斷試劑盒本發明所述試劑盒檢測的目標核酸為具有SEQ ID NO :I所示多核苷酸序列的miR-423-5p，具體包括(I)聚合酶鏈反應試劑；包括熱啟動Taq DAN聚合酶(2. 5U/ul)及其反應緩沖液，dNTP (IOmM)；(2)miR-423-5p特異性引物；在一個優選例中，所述miR-423_5p特異性引物選自SEQ IDNO: 2所示序列；(3)線蟲 miR-39 參照寡核苷酸序列5’ -UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG-3’ (SEQ IDN0:3)；(4)線蟲 miR-39 特異性引物5’-CCGGGTGTAAATCAGCTTGAAA-3’ (SEQ ID N0:4)；(5)熒光染料 SYBR-GREEN I ;(6)使用說明書。實施例3、診斷效果實驗I、利用我們發明的異種移植模型(即將前列腺癌組織移植到免疫缺欠小鼠的腎包膜中，所得到的組織系與臨床腫瘤的病理特征高度相關)和新一代測序技術，對轉移性和非轉移性前列腺癌異種移植組織系(來自于同一個前列腺癌患者的手術標本)中miRNAs的轉錄組學進行了深入的研究。通過比較我們鑒定出104個表達差異的miRNAs，除了一些已知的miRNAs和它們的異型體(isomiRs),還有一部分是尚未被發現的新的miRNAs。其中21個miRNAs已經被發現和前列腺癌的發生有關，5個miRNAs已經被報道在前列腺癌轉移中發揮作用，這也從側面證明了我們采用的研究手段的有效性。除了那些已經被證明和前列腺癌轉移相關的miRNAs外，我們還發現了 36個迄今為止尚未被報道的miRNAs (ffatahiki etal.，PLOS One 2011)，這其中可能存在著潛在的可作為中國人群前列腺癌患者血清學生物標志物的miRNAs。2、血清中微量miRNA的提取由于miRNA在血清中的含量很少，在實驗前期，我們參閱了大量的文獻，嘗試了純化柱試劑盒提取法和液相Trizol提取法提取miRNA。發現Trizol法提取的miRNA的量和純度更好一些(miRNA的蛋白含量及鹽分含量更少)。在用Trizol法中我們進行了兩方面的優化(I)血清中含蛋白量較多，可以加大Trizol的含量，以使所含的蛋白質得到充分的變性；并用酚/氯仿/異戊醇進行多次抽提，以將所含的蛋白質進行充分的去除；(2)因為miRNA分子量很小,在加入異丙醇沉淀這步中，不容易沉淀下來,可以適量的延長沉淀時間，以使miRNA充分的沉淀下來增加miRNA的得率。3、血清中微量miRNA的檢測方法 米用All-in-One miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit反轉錄合成cDNA。根據miRNA的特點和PCR擴增原則，采用所發明的試劑盒在MJ Opticon II定量PCR儀上檢測miR-423-5p和線蟲miR-39的含量。miRNA的相對表達量使用2_Δ "ct法計算。4、檢測在前列腺癌組織中表達上調的miRNAs在前列腺癌患者血清中的含量(I)我們對天津醫科大學第二附屬醫院泌尿研究所提供的百余份臨床資料和病人病歷信息等進行了整理工作，篩選出了 37例正常人，67例高分級(7-9分)前列腺癌患者病歷，13例低分級前列腺患者病歷，并取得其血液樣本。(2)對這些臨床樣本進行miRNA提取，QRT-PCR檢測得到如下結果從所收集的血清樣品中提取RNA，利用特異于miR — 423_5p的PCR引物，采用反轉錄一實時定量PCR的方法檢測該miRNA的表達水平。所使用的PCR弓I物能夠特異、有效地擴增待檢測序列(圖I)。所得到的數據用SPSS軟件對其進行獨立樣本T檢驗分析，miR-423-5p在前列腺癌患者血清中表達升高(圖2)。表ImiR - 423_5p在正常組和前列腺癌組血清中的相對表達倍數
權利要求
1.檢測血液樣品中微小RNAmiR-423-5p及其前體的試劑在制備用于對對象前列腺癌診斷和治療方案選擇的試劑盒中的應用，所述試劑是對微小RNA miR-423-5p及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-423-5p及其前體有檢測特異性的PCR引物和探針以及利用該探針制備的基因芯片。
2.如權利要求I中所述的應用，其特征在于，所述miR-423-5p的序列如SEQID NO 1所示。
3.一種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒檢測的目標核酸為具有SEQ ID NO:I所示多核苷酸序列的miR-423-5p,具體包括 (1)聚合酶鏈反應試劑； (2)miR-423-5p特異性引物，如SEQID N0:2所示; (3)線蟲miR-39參照寡核苷酸序列，如SEQID N0:3所示； (4)線蟲miR-39特異性引物，如SEQIDN0:4所示； (5)熒光染料SYBR-GREEN I ； (6)使用說明書。
全文摘要
本發明涉及一種微小RNA(miR-423-5p，如SEQIDNO1所示)在前列腺癌血清學診斷試劑盒中的應用，具體涉及檢測血液樣品中miR-423-5p的試劑在制備用于對象前列腺癌診斷試劑盒中的應用。所述試劑是對微小RNAmiR-423-5p及其前體具有特異性的試劑，具體是對miR-423-5p及其前體有檢測特異性的探針和PCR引物。本發明還涉及一種前列腺癌診斷試劑盒，包括聚合酶鏈反應試劑；miR-423-5p特異性引物；線蟲miR-39參照寡核苷酸序列；線蟲miR-39特異性引物；熒光染料SYBR-GREEN1；使用說明書。當檢測結果顯示對象血液中miR-423-5p或其前體的水平高于對照血清中的水平，則提示所述對象罹患前列腺癌，該試劑盒可有效用于臨床前列腺癌的輔助診斷。
文檔編號C12Q1/68GK102816861SQ20121035168
公開日2012年12月12日 申請日期2012年9月19日 優先權日2012年9月19日
發明者張琚, 石建黨, 王玉琢, 成颯, 楊闊, 杜小玲, 原輝, 徐勇, 羅飛 申請人:南開大學