專利名稱：Pkib和naaladl2用作前列腺癌治療和診斷的靶基因的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物科學領域，更具體地，涉及癌癥診斷和治療領域。特別地，本發明 涉及用于檢測和診斷前列腺癌的方法，以及用于治療和預防前列腺癌的方法。而且，本發明 涉及用于篩選可用于預防前列腺癌的藥劑的方法。
背景技術：
前列腺癌(PC)是美國和歐洲最常見的男性惡性腫瘤，并且是第二大癌癥相關死 亡的原因(Gronberg H, Lancet 2003 361:859-64.)。由于西式飲食的流行和老齡人口 的爆發性增長，PC的發病率在大多數發達國家顯著增加(Gronberg H，Lancet 2003 361 859-64. and Hsing AW et al.，Epidemiol Rev2001 23 :3_13.)。使用血清前列腺特異抗原 (PSA)進行篩選導致PC的早期檢出大大改善，增加了可通過外科手術和放射治療治愈的局 部化疾病的患者的比例(Gronberg H, Lancet 2003 36 1 :859_64. and Hsing AW et al.， EpidemiolRev 2001 23:3-13.)。然而，有20-30%的這類PC患者仍然受到疾病復發的困 擾(Feldman BJ et al. , Nat Rev Cancer 2001 1 :34-45. and Han M et al. , J Urol2001 166 :416-9.)。雄激素/雄激素受體(AR)信號途徑在PC發生和發展中發揮核心作用，在相對 早期階段，PC的生長通常是雄激素依賴的(Feldman BJ et al.，Nat RevCancer 20011 34-45. and Han M et al.，J Urol 2001 166:416-9.)。因此，大多數具有復發或晚期疾病 的患者對雄激素消減療法(androgen-ablation therapy)響應良好，該療法通過手術或醫 藥去勢抑制睪丸雄激素的產生。雖然如此，但是這些患者最終會獲得不依賴雄激素的和侵 襲性更高的表型，稱作激素難治性前列腺癌(HRPC)。可選擇地，他們最終會獲得對雄激素 消減療法(去勢)的耐受性，以及侵襲性更高的表型，稱作去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)， 這基本上是致死的疾病(Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 200623:8253-61.)。最 近，多烯紫杉醇(docetaxel)和強的松(prednisone)的組合被確立為HRPC患者的新護理 標準(Tannock IF et al.，N Engl J Med 2004351 :1502-12.)，但是它們不能實現治愈， 對HRPC患者的生存益處非常有限。因此，現在許多研究團隊正在嘗試各種方法，鑒定對 HRPC生長起貢獻的新型分子靶標或信號途徑(Scher HI et al.，J Clin Oncol 2005 23 8253-61.)。這種去勢抵抗性進程的機制被假定為可分成兩個途徑，即涉及AR的途徑；和旁 路AR或不依賴AR的途徑。它們并不相互排斥，而往往在CRPC細胞中共存(Feldman BJ, Feldman D. Nat Rev Cancer 20011 :34—45，Scher HI,Sawyers CL. J Clin Oncol 200623 8253-61.)。有報道，許多旁路AR或不依賴AR的途徑在CRPC細胞中被激活，有助于獲得惡 性或侵襲性更高的表型。AR途徑與AR非依賴途徑一例如Her-2/neu和IL-6/STAT3—之 間還會發生對話(Cross-talk) (Feldman BJ, Feldman D.Nat Rev Cancer 20011 34-45, Scher HI, Sawyers CL. J Clin Oncol 200623 :8253_61，Grossmann ME, et al. JNCI 200193 1687-97, Yang L, et al. BBRC 2003305 462-469.)。在獨立途徑中，PTEN-PI3K-Akt途徑可能是可以解釋CRPC表型的最關鍵的途徑 之一。Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其被磷脂肌醇(3，4，5)-磷酸(PIP3)激活，而激 活的或磷酸化的Akt可通過調節GSK3beta、BAD、F0X0和mTOR來促進細胞生長和細胞存 活(Sharma M, et al. J Biol Chem 2002277:30935-41，Pap M, Cooper GM. J Biol Chem 1998273 19929-32, Downward J.1998Curr Opin Cell Biol 10 :262-67, Datta SR, et al. Cell 199791 :231-41, Downward J. Cell Develop Biol 2004 15 177-82, Vivanco I and Sawyers C. NatRev Cancer 20022 :289_501，Hay N. Cancer Cell 20058:179-83)。在正常細胞中，腫瘤阻遏物PTEN- —種可從PIP3除去磷酸的脂質磷酸酶(lipid phosphatase)—可抑制Akt激活，使細胞發生凋亡，而一些腫瘤細胞具有PTEN突變或PTEN 表達缺失，導致Akt激活。除了其抗細胞凋亡功能之外，在前列腺癌細胞中，激活的Akt直 接與AR結合，并且在沒有雄激素的條件下使AR磷酸化，這也有助于CRPC表型(Wen Y，et al. CancerRes 200060 :6841_45)。實際上，在高格里森等級的PC中磷酸化AkT的水平上升，并且與PC進展或CRPC進 展相關(Malik SN，et al. Clin Cancer Res 20028 :1168-71,Kreisberg JI，et al. Cancer Res 200464 :5232_36)。Akt的激活需要Thr308和Ser473殘基的磷酸化。磷酸肌醇依賴的激酶1 (PDK1) 能夠催化Thr308的磷酸化，并且有人提出若干激酶可發揮所謂PDK2的功能，可催化Ser473 的磷酸化，但是它們中是否有一些或全部在癌細胞中發揮生理性PDK2的作用仍然有待確 認(Grossmann ME, et al. JNCI200193 :1687_97，Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67.)。另一方面，cAMP依賴的蛋白激酶A(PKA)經常被認為對于介導由cAMP引發的多 種生理或病理效應以及與G蛋白的偶聯是至關重要的。多種配體-受體系統可激活PKA 信號傳導途徑，并且其激活與細胞生長和分化的控制有關(Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67, Stork PJ，Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212:258-66)。在前列腺癌中，有多項報告稱，PKA參與了雄激素非依賴性生長和神經內分泌分 化(Cox ME,et al.J Biol Chem 2000275 :13812_8，Deeble PD, CoxME,et al. Cancer Res 200767 663-72)。還有人提出PKA途徑與AR途徑的對話參與了 PC細胞的雄激素非依賴性 或去勢抵抗性生長(Stork PJ，SchmittJM. Trends Cell Biol 200212 :258_66，Sadar MD. J Biol Chem 1999274 :7777_83)。該PKA途徑受到多種因子的調節，例如PKA調節亞基(PKA-R)或PKA抑制 ^ (Taylor SS, Kim C, Vigil D, et al. BBA 20051754 :25-37, Dalton GD, Dewey WL. Neuropeptides 200640 :23_34)，在癌細胞中，這些調節因子被異常表達從而改變PKA 途徑，并且其中一些是癌癥治療的靶標(Miller WR. Ann NY Acad Sci 2002968:37-48， 2002)。
先前，為了表征臨床HRPC或CRPC的分子特征和鑒定用于HRPC或CRPC治療的分 子靶標，對通過LMM(激光微束顯微解剖)方法從HRPC或CRPC組織純化的癌細胞進行了全 基因組范圍的cDNA微陣列分析，并且在HRPC或CRPC細胞中鑒定了若干不受調節的基因， 其中一些可能涉及雄激素非依賴性和侵襲性表型(Tamura K et al. ,Cancer Res 2007 67 5117-25.)。
發明概要根據HRPC或CRPC細胞的全基因組范圍表達譜，有兩個分子靶標PKIB(GenBank 登錄號匪181795)和NAALADL2 (GenBank登錄號匪207015andAK021754)，被鑒定為可用 于PC治療和診斷。此外，該蛋白可用作分子靶標，用于開發新的HRPC治療方法。PKIB是PKA途徑中的調節因子之一，是CRPC中的一種過表達基因。本發明人證 明，它藉由PKA途徑與Akt途徑之間的功能聯系對PC細胞的生存力及其惡性表型起貢獻。PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制物)家族。PKIA被認為通過直接與PKA-C結合來 抑制蛋白激酶A催化亞基(PKA-C) (GenBank登錄號匪002730)的激酶活性，并將PKA-C 從細胞核外排到細胞質(Glass DB etal.，J Biol Chem 1986261 12166-71. and Wen ff et al.，J Biol Chem 1994269:32214-20.)。蛋白激酶 A (PKA)，cAMP 依賴的蛋白激酶 A, 經常被認為對于介導由cAMP引發的多種生理或病理效應以及與G蛋白的偶聯是至關重要 的，多種配體和受體系統可激活PKA信號途徑，并且PKA激活與細胞生長和分化的控制有關 (Tasken K, Aandahl EM. Physol Review 200484 137-67, Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212:258-66)。在前列腺癌中，有多項報告提示，它參與了雄激素非依賴性生 長和神經內分泌分化(Cox ME，et al. J Biol Chem 2000275 :13812_8，Deeble PD，Cox ME, et al. Cancer Res 200767 663-72)，PKA途徑與AR途徑的對話也被提示參與了 PC細胞 的雄激素非依賴性或去勢抵抗性生長(Stork PJ, Schmitt JM. Trends Cell Biol 200212 258-66，Sadar MD. J Biol Chem 1999274 :7777_83)。NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。GCPII的 前列腺形式稱作前列腺特異膜抗原(PSMA)，在前列腺癌中表達，并且PSMA水平增加與PC進 展和HRPC有關(Rajasekaran AK et al.，AmJ Physiol Cell Physiol 2005 288 :C975_81. and Murphy GP et al.，Prostate 200042:145-9.)。考慮到它與 PSMA 的同源性和相似的 表達模式，NAALADL2應當被稱作“PSMA2”。PSMA是FDA批準的前列腺癌顯像劑一lllln標 記7E11單克隆抗體(Prostascint, Cytogen, Princeton, NJ)的靶標。PSMA是單克隆抗體 如J591的靶標，J591正在臨床試驗中用于將顯像劑或治療劑特異性投遞到PSMA表達細
(Murphy GP et al. ， Prostate 200042 145-9. andHolmes EH, Expert Opin Investig Drugs 200110:511-9.)。除了其作為腫瘤標志的特征之外，PSMA具有GPC活性，其底物 包括多聚-Y-谷氨酸化葉酸鹽(poly-y-glutamated folates) (Zhou J et al. , Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.)。PSMA的酶活性可被利用來設計前體藥物，其中僅在 表達PSMA的細胞中藥物的無活性谷氨酸化形式被選擇性切裂并從而被激活(DermyWA et al.，Eur J Med Chem 200136 :577_95.)。然而，人們對于PSMA如何與前列腺癌進程相關聯 一無所知，靶定PSMA功能或其活性自身的可能性仍然不知曉。本發明突出提供一種通過確定來源于受試者的生物樣品中PIKB和NAALADL的表
7達水平來診斷或確定受試者的前列腺癌或前列腺癌傾向的方法。任何上述基因的表達水平 與該基因的正常對照水平相比的增加表明受試者罹患前列腺癌或者具有前列腺癌發病的危險。本發明至少部分地基于如下的發現，即包含特定序列(尤其是SEQ IDN0 16,17 和19)的雙鏈分子可有效抑制前列腺癌細胞的細胞生長。具體地，本發明提供了以PIKB和 NAALADL2基因為靶標的小干擾RNA(siRNA)。根據本發明的一個方面，雙鏈分子可以被編碼在載體中，并從所述載體表達。因此，本發明提供了通過施用本發明的雙鏈分子或載體來抑制細胞生長和治療前 列腺癌的方法。這種方法包括向受試者施用包含一種或多種所述雙鏈分子或載體的組合 物。本發明的另一個方面涉及用于治療癌癥的組合物，其含有至少一種本發明的雙鏈 分子或載體。或者，本發明進一步提供了一種篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方 法，其包括如下步驟使測試化合物與表達PIKB或NAALADL2蛋白的細胞接觸，然后選擇可 降低PIKB或NAALADL2蛋白的表達水平的測試化合物。進一步，本發明提供了一種篩選用 于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，其中檢測PIKB和蛋白激酶A催化亞基(PKA-C)之 間的結合。我們預期，可抑制PIKB與PKA-C之間結合的化合物可以減輕前列腺癌的癥狀。 而且，本發明提供了篩選用于檢測癌癥的抗體的方法，其中檢測細胞表面中的NAALANDL2。 將識別NAALANDL2的抗體用于檢測前列腺癌。附圖簡述

圖1A半定量RT-PCR確認，與同樣經顯微解剖的正常前列腺上皮細胞(NPmix)、 完整的正常前列腺組織和生命器官(心、肺、肝和腎)相比，PKIB在HRPC細胞(5/5)中過 表達，但在HSPC細胞中則不然。cDNA含量的定量都使用ACTB。B針對PKIB表達的多組 織Northern(MTN)印跡分析顯示，在成人器官中，胎盤顯示大約1. 5kb條帶，而在生命器官 (心、肺、肝和腎)則沒有。PKIB表達的Northern印跡分析顯示，數個PC細胞系(22Rvl和 PC-3)強烈表達PKIB，而其它正常成人器官沒有表達PKIB。C-F顯示了 PC組織的免疫組化 分析。C前列腺上皮內瘤(PIN)顯示微弱的PKIB染色(+)。DGleason 3級的PC顯示微弱 的染色(+)，而正常前列腺上皮(N)顯示陰性染色。E Gleason 5級的PC顯示強烈的PKIB 陽性染色(+++)。F HRPC也顯示強烈的PKIB陽性染色(+++)。圖2A半定量RT-PCR確認，與同樣顯微解剖的正常前列腺上皮細胞(NPmix)、完整 的正常前列腺組織和生命器官(心、肺、肝和腎)相比，NAALADL2在HRPC細胞(7/11)中過 表達。cDNA含量的定量都使用ACTB。B NAALADL2表達的MTN印跡分析顯示，在成人器官 中，僅在PC細胞系中存在大約10kb、6kb和5kb的三個條帶，而在生命器官(心、肺、肝和 腎)則沒有。圖3PKIB_siRNA對PC細胞生長的影響。A RT-PCR確認在22Rvl細胞(左)和 LNCaP (HP)細胞(右)中，sil和si2對PKIB表達具有敲低作用(knockdown effect)，但 si3和陰性對照siEGFP都沒有。B用表達針對PKIB的指定siRNA(siUsi2和si3)的載體 和陰性對照載體(siEGFP)轉染的22Rvl細胞(左)和LNCaP (HP)細胞(右)的各自的MTT 測定。與遺傳霉素(Geneticin)溫育20天后，對每次的平均值作圖，誤差線指示SD (標準偏 差)。Y軸上的ABS表示490nm吸光度，以630nm為參比，用微滴定板讀數器測量。這些實驗重復三次。用sil和si2轉染22Rvl (左)和LNCaP(HP)細胞(右)導致存活細胞數目大 大減少，而與此相比的是用si3和siEGFP轉染沒有觀察到敲低作用(P < 0. 01, Student t 檢驗)。C用針對PKIB的指定siRNA表達載體(sil,si2和si3)和陰性對照載體(siEGFP) 轉染的22Rvl細胞(左)和LNCaP(HP)細胞(右)的集落形成測定。用遺傳霉素溫育20 天后，用結晶紫染色(crystalviolet staining)使細胞可視化。圖4NAALADL2-siRNA對PC細胞生長的影響。A RT-PCR確認，在22Rvl細胞中， si#690對NAALADL2表達有敲低作用，但si#913, si#1328和陰性對照siEGFP沒有。利用 ACTB 定量 RNA。B 用針對 NAALADL2 的指定 siRNA 表達載體(si#690，si#913 和 si#1328)和 陰性對照載體(siEGFP)轉染的22Rvl細胞的MTT測定。與遺傳霉素溫育20天后，對每次 的平均值作圖，誤差線指示SD (標準偏差)。Y軸上的ABS表示490nm吸光度，以630nm為 參考，用微滴定板讀數器測量。這些實驗重復三次。用si#690轉染22Rvl細胞導致存活細 胞數目大大減少，而相比之下其它siRNA處理沒有觀察到敲低作用(P < 0. 01，Student t 檢驗)。C用針對NAALADL2的指定siRNA表達載體(si#690, si#913和si#1328)和陰性對 照載體(siEGFP)轉染的22Rvl細胞的集落形成測定。與遺傳霉素溫育20天后，用結晶 紫染色(crystal violet staining)細胞使之可視化。D RT-PCR確認在另一種NAALADL2 表達型的C4-2B細胞中，對應于si#690的合成RNA雙鏈體(duplex)對NAALADL2表達有敲 低作用，但si#913, si#1328和陰性對照siEGFP則沒有。利用ACTB定量RNA。E與對照RNA 雙鏈體siEGFP相比，對應于si#690的合成RNA雙鏈體抑制了 C4-2B細胞的細胞生存力(P < 0. 01, Student t 檢驗)。圖5PKIB蛋白(A)和NAALADL2蛋白(B)的亞細胞定位。使用抗標簽抗體進行免 疫細胞組化分析顯示，外源PKIB定位于細胞質，外源NAALADL2蛋白主要定位于細胞質膜。 C PKIB-Myc和HA-PKA-C表達載體共轉染22Rvl細胞，用每種標簽抗體免疫沉淀它們的細胞 裂解物。PKIB-Myc與PKA-C免疫共沉淀，反之亦然，表明PKIB與PKA-C間的直接相互作用。 D免疫細胞組化分析觀察到，當對照siRNA轉染PC-3細胞時，大多數PKA-C定位于細胞質， 一些PKA-C信號位于細胞核(左)。另一方面，當siRNA敲低PC-3細胞中的內源PKIB時， 免疫細胞組化分析顯示在細胞核中沒有或者有非常少的PKA-C信號(右)。E在PC細胞中 用siRNA雙鏈體處理后，將細胞分級為細胞核和細胞質級分，以便更加定量地分析細胞核 PKA-C。使用30微克經分級的細胞裂解物，用抗PKA-C抗體和作為上樣和細胞核級分對照 的抗核纖層蛋白B抗體進行western印跡。與對照siRNA相比，由siRNA導致的PKIB敲低 可明顯降低細胞核中的PKA-C量，而細胞質中的PKA-C量在PKIB敲低中僅略微增加。圖 6A RT-PCR 確認了 PKIB 在 DU145 來源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、#3)中 的組成性表達。B Western印跡確認了 PKIB在DU145來源(deribed)的克隆(PKIB#1、#2、 #3)中的組成性表達。C表達高水平的外源PKIB的DU145克隆(克隆1_3)和用模擬(Mock) 載體轉染的克隆(#1、#2、#3混合物)的體內生長速度。X和Y軸分別表示接種后的日數點 和用直徑吸光度(absorbance of the diameter)計算的、與作為對照的第1天的吸光度值 比較的相對生長速度。PKIB過表達細胞比模擬細胞生長更快速，提示PKIB在前列腺癌中的 促生長作用。D將2X106個穩定表達PKIB的DU145來源的克隆(右)或者模擬細胞(左) 接種在雄性裸鼠的脅部(frank)。接種15周后，僅在右脅部建立了腫瘤(PKIB++ ；箭頭)， 而在左脅部(模擬)沒有。E基質膠侵襲測定(Matrigel invasion assay)顯示了 NIH3T3細胞在被PKIB表達載體轉染后的侵襲性質。Y軸表示遷移通過基質膠包被膜的細胞數目。 試驗重復三次，對每次的平均值作圖，誤差線表示SD (標準偏差)。PKIB的過表達顯著促進 7 NIH3T3細胞的侵襲性(P = 0. 0052)。圖7A在LNCaP和PC-3細胞中用siRNA雙鏈體(siPKIB)敲低PKIB導致Akt的Ser 473磷酸化減弱。用siEGFP雙鏈體轉染作為陰性對照。用RT-PCR確認PKIB的敲低，使用 ACTB作為上樣對照。B PKIB在PC-3和22Rvl細胞中的過表達提高了 Akt的Ser 473磷酸 化。PKIB過表達通過使用HA標簽抗體進行western印跡加以確認。C PKA-C在PC-3細胞 中的過表達也提高了 Akt的Ser 473磷酸化。PKA-C的過表達通過使用HA標簽抗體進行 western印跡加以確認，以Akt總量作為上樣對照。D使用重組PKIB和PKA-C蛋白進行Akt 的體外激酶測定。Akt-Ser473的磷酸化通過抗磷酸-Akt (Ser473)抗體(Cell Signaling) 進行檢測，Akt總量作為上樣對照。用抗Akt抗體檢測Akt總量。在PKA-C的基礎上添加 PKIB在體外顯著增加了 Akt-Ser473的磷酸化。圖8在臨床PC組織中，PKIB表達與Akt磷酸化關聯。圖片代表了在PC組織的面 對面切片(face-to-face slides)上進行的A PKIB和B磷酸化Akt的免疫組織化學。發明的公開定義除非具體指出，否則詞語“一”、“一個(一種)”和“該”在本文中的意思是“至少 一個，，。如本文使用的，術語“生物樣品”是指整個生物體或由其組織、細胞或組成部分 (例如體液，包括但不僅限于，血液、粘液、淋巴液、滑液、腦脊液、唾液、羊水、羊膜臍帶血、陰 道分泌物和精液)構成的子集。“生物樣品”還指從整個生物體，或從由其細胞、組織或組 成部分、或級分或部分構成的子集，所制備的勻漿、裂解物、提取物、細胞培養物或組織培養 物。最后，“生物樣品”指這樣的介質，例如其中已有生物體繁殖的營養液或凝膠其含有細 胞成分，例如蛋白質或多核苷酸。術語“多核苷酸”和“寡核苷酸”在本文中若無具體指出可交換使用，并且用它們 公認的單字母編碼指示。這兩個術語適用于這樣的核酸(核苷酸)聚合物，其中有一個或 多個核酸通過酯鍵連接。多核苷酸或寡核苷酸可以由DNA、RNA或其組合構成。雙鏈分子術語“分離的雙鏈分子”是指可抑制靶基因的表達的核酸分子，包括例如短干擾 RNA(siRNA ；例如雙鏈核糖核酸(dsRNA)或小發夾RNA(shRNA))和短干擾DNA/RNA(siD/ R-NA ；例如DNA和RNA的雙鏈嵌合體(dsD/R-NA)或DNA和RNA的小發夾嵌合體(shD/ R-NA))。如本文所使用的，術語“siRNA”是指可阻止靶mRNA翻譯的雙鏈RNA分子。使用將 siRNA引入到細胞中的常規技術，包括以DNA為RNA轉錄模板的技術。siRNA包括PKIB或 NAALADL2有義核酸序列(也稱作“有義鏈”)、PKIB或NAALADL2反義核酸序列(也稱作“反 義鏈”)、或兩者。siRNA可以被構建成使單個轉錄本同時具有靶基因的有義核酸序列和互 補的反義核酸序列，例如發夾。siRNA可以是dsRNA或shRNA。如本文所使用的，術語“dsRNA”是指兩個RNA分子的構建體，兩個RNA分子包含彼 此互補的序列，并通過互補序列退火在一起形成雙鏈RNA分子。兩條鏈的核苷酸序列可能不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義” RNA,還包括具有從靶基因非 編碼區選出的核苷酸序列的RNA分子。如本文所使用的，術語“shRNA”是指具有莖環結構的siRNA，包括彼此互補的第一 和第二區，即有義和反義鏈。所述區域的互補程度和方向足以使得兩個區域間形成堿基配 對，其中第一和第二區通過環區連接，該環是由于環區內核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺 乏堿基配對產生的。shRNA的環區是介于有義和反義鏈之間的單鏈區，也可以稱作“間插單 鏈”。如本文所使用的，術語“siD/R-NA”是指同時包含RNA和DNA的雙鏈多核苷酸分子， 包括RNA和DNA的雜交體和嵌合體，其可阻止靶mRNA的翻譯。這里，雜交體指示這樣的分 子，其中一個由DNA構成的多核苷酸與一個由RNA構成的多核苷酸彼此雜交形成雙鏈分子； 而嵌合體是指構成雙鏈分子的一條鏈含有或兩條鏈都含有RNA和DNA。使用將siD/R-NA引 入細胞內的常規技術。siD/R-NA包括PKIB或NAALADL2有義核酸序列(也稱作“有義鏈”)、 PKIB或NAALADL2反義核酸序列(也稱作“反義鏈”)或兩者。siD R-NA可以被構建成使單 個轉錄本同時具有靶基因的有義和互補核酸序列，例如發夾。siD/R-NA可以是dsD/R-NA或 shD/R-NA。如本文所使用的，術語“dsD/R-NA”是指由兩個包含彼此互補的序列的分子所成的 構建體，兩個分子通過互補序列退火在一起從而形成雙鏈多核苷酸分子。兩條鏈的核苷酸 序列不僅包括從靶基因序列蛋白編碼序列選出的“有義”或“反義”多核苷酸，還包括具有 從靶基因非編碼區選出的核苷酸序列的多核苷酸。構成dsD/R-NA的兩個分子中的一個或 兩個都由RNA和DNA 二者構成(嵌合分子)，或者，其中一個分子由RNA構成，另一個由DNA 構成(雜交雙鏈)。如本文所使用的，術語“dsD/R-NA”是指具有莖環結構的siD/R-NA，包括彼此互補 的第一和第二區，即有義和反義鏈。所述區域的互補程度和方向足以使得兩個區域間形成 堿基配對，第一和第二區通過環區連接，環是由于環區內核苷酸(或核苷酸模擬物)之間缺 乏堿基配對而形成的。siD/R-NA的環區是介于有義和反義鏈之間的單鏈區，可以稱作“間 插單鏈”。如本文所使用的，“分離核酸”是指從其原始環境(例如其自然存在的天然環境) 被取出，因此從其自然狀態發生了人工改變(synthetically altered)的核酸。在本發明 中，分離核酸包括DNA、RNA和其衍生物。針對PKIB或NAALADL2的雙鏈分子，是與靶mRNA雜交的分子，可通過與基因的在 正常情況下為單鏈的mRNA轉錄本結合(associate)，干擾蛋白翻譯進而抑制蛋白的表達， 從而降低或抑制由PKIB或NAALADL2基因編碼的PKIB或NAALADL2蛋白的產生。PKIB在前 列腺癌細胞系中的表達被1或2不同的dsRNA抑制(圖3) ；NAALADL2在前列腺癌細胞系中 的表達被dsRNA抑制(圖4)。因此，本發明提供了具有下述性質的分離的雙鏈分子它們在被引入到表達PKIB 或NAALADL2基因的細胞內時可抑制該基因的表達。雙鏈分子的靶序列通過下文提到的 siRNA設計算法加以設計。PKIB靶序列包括，例如，核苷酸SEQ ID NO 16,
SEQ ID NO 17NAALADL2靶序列包括，例如，核苷酸SEQ ID NO 19具體地，本發明提供了如下的雙鏈分子[1]_[16][1] 一種分離的雙鏈分子，其在被引入到細胞內時，可抑制PKIB或NAALADL2基因 的表達和細胞生長，該分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分 子，并且其中有義鏈包括從SEQ ID NO :16、17和19的組中選出的靶序列；[2] [1]所述的雙鏈分子，其長度小于大約100個核苷酸；[3] [2]所述的雙鏈分子，其長度小于大約75個核苷酸；[4] [3]所述的雙鏈分子，其長度小于大約50個核苷酸；[5] [4]所述的雙鏈分子，其長度小于大約25個核苷酸；[6] [5]所述的雙鏈分子，其長度為大約19-大約25個核苷酸；[7] [1]所述的雙鏈分子，其由單個多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過間插單 鏈連接起來的有義鏈和反義鏈；[8] [7]所述的雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]_3’，其中[A]是包含選自 SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3-23個核苷酸組成的間插單鏈，[A，]是 包含與[A]互補的序列的反義鏈；[9] [1]所述的雙鏈分子，其包含RNA ；[10] [1]所述的雙鏈分子，其包含DNA和RNA ；[11] [10]所述的雙鏈分子，其是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜交體；[12] [11]所述的雙鏈分子，其中有義鏈和反義鏈分別由DNA和RNA構成；[13] [10]所述的雙鏈分子，其是DNA和RNA的嵌合體；[14] [13]所述的雙鏈分子，其中反義鏈3’端側翼的區域由RNA構成，或者有義鏈 5’端側翼的區域和反義鏈3’端側翼的區域均由RNA構成；[15] [14]所述的雙鏈分子，其中側翼區域由9-13個核苷酸組成；和[16] [1]所述的雙鏈分子，其包含3’突出端。
下面將更詳細地介紹本發明的雙鏈分子。具有抑制細胞內靶基因表達的能力的雙鏈分子的設計方法是已知的。(見例如，美 國專利No. 6，506，559，本文援引并入其全部內容)。例如，可以從Ambion網站訪問一種用于 設計 siRNA 的計算機程序(http //www, ambion. com/techlib/misc/siRNA finder, html)。該計算機程序根據如下方案選擇雙鏈分子的靶核苷酸序列。靶位點的選擇1.從轉錄本的AUG起始密碼子開始，向下游搜尋AA 二核苷酸序列。記錄每個AA 的出現以及3’毗鄰的19個核苷酸，作為潛在的siRNA靶位點。Tuschl等推薦避免在5’和 3’非翻譯區(UTR)以及臨近起始密碼子的區域(75個堿基內)設計siRNA，因為這些區域 可能更富含調節蛋白結合位點，并且UTR結合蛋白和/或翻譯起始復合體可能干擾siRNA 內切酶復合體的結合。2.比較潛在靶位點與合適的基因組數據庫(人、小鼠、大鼠等)，將任何與其它 編碼序列具有顯著同源性的靶序列排除在考慮之外。基本上使用BLAST，其可通過NCBI服各器訪問www. ncbi. nlm. nih. rov/BLAST/(Altschul SF et al.，Nucleic Acids Res 1997S印 1,25(17) 3389-402)3.選擇合格的靶序列用于合成。典型地，沿著基因的長度選擇數個靶序列進行評 估。通過這個方案，本發明分離雙鏈分子的靶序列設計如下SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 17 用于 PKIB 基因；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 基因；核苷酸對于靶定上述靶序列的雙鏈分子，分別檢查它們抑制表達所述靶基因的細胞的生 長的能力。因此，本發明提供了以選自下組的任何序列為靶標的雙鏈分子SEQ ID NO 16 和 SEQ ID NO 17 用于 PKIB 基因；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 基因；核苷酸本發明的雙鏈分子針對單個靶標PKIB或NAALADL2基因序列，或者可以針對多個 PKIB或NAALADL2基因序列。所謂PKIB或NAALADL2靶序列，意思是與PKIB基因或NAALADL2基因的一部分 (即PKIB或NAALADL2基因內的多核苷酸，其與siRNA長度相等并且與之互補)相同的 核苷酸序列。靶序列可包括人PKIB或NAALADL2基因的5’非翻譯(UT)區、開放閱讀框 (0RF)或3’非翻譯(UT)區。或者，siRNA是與PKIB或NAALADL2基因表達的上游或下游調 節子(modulator)互補的核酸序列。上游和下游調節子的實例包括與PKIB或NAALADL2 基因啟動子結合的轉錄因子，與PKIB或NAALADL2多肽相互作用的激酶或磷酸酶，PKIB或 NAALADL2啟動子或增強子。以上述的PKIB或NAALADL2基因靶序列為靶標的本發明雙鏈分子包括這樣的分離 的核苷酸，它們包括靶序列的任何核酸序列和/或與靶序列互補的序列。靶定PKIB基因的 多核苷酸的實例包括含有SEQ ID NO 16或17的序列和/或這些核苷酸的互補序列的多 核苷酸；靶定NAALADL2基因的多核苷酸包括含有SEQ ID NO 19的序列和/或這些核苷酸 的互補序列的多核苷酸。然而，本發明并不僅限于這些實例，前述核酸序列的微小修飾也是 可以接受的，只要經過修飾的分子仍保持抑制PKIB或NAALADL2基因表達的能力即可。這 里，核酸序列中的“微小修飾”是指對序列進行1、2或數個核酸的替換、刪除、添加或插入。 典型地，微小修飾是對序列進行4個或者更少，有時是3個或者更少，經常是2個或者更少 核酸的替換、刪除、添加或插入。根據本發明，可以用實施例中采用的方法對本發明雙鏈分子的能力進行測試。在 實施例中，對于包含PKIB或NAALADL2基因不同部分的有義鏈和與之互補的反義鏈的雙鏈 分子，根據常規方法體外測試了它們降低前列腺癌細胞系(例如使用22Rvl、LNCaP(HP)和 C4-2B)中PKIB或NAALADL2基因產物的產生的能力。而且，例如，與不存在候選分子時培養 的細胞相比，與候選雙鏈分子接觸的細胞中PKIB或NAALADL2基因產物的減少，可以通過例 如RT-PCR方法，使用實施例1，題目“半定量RT-PCR”中提到的PKIB或NAALADL2mRNA引物 進行檢測。然后，對于可在體外細胞測定中降低PKIB或NAALADL2基因產物的產生的序列， 測試它們對細胞生長的抑制作用。然后，對于在體外細胞測定中抑制細胞生長的序列，用患 有癌癥的動物，例如裸鼠異種移植模型，測試它們在體內的能力，以確認PKIB或NAALADL2 產物生成的減少和癌細胞生長的降低。
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當分離的多核苷酸是RNA或其衍生物時，核苷酸序列中的堿基“t”應當用“U”代 替。如本文所使用的，術語“互補”是指多核苷酸的核苷酸單位之間的Watson-Crick或 Hoogsteen堿基配對，術語“結合”的意思是兩個多核苷酸之間的物理或化學相互作用。當 多核苷酸包含經過修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯聯結時，這些多核苷酸也可以用相同的 方式彼此結合。一般地，互補多核苷酸序列在合適的條件下雜交，形成穩定的、含有極少錯 配或沒有錯配的雙鏈體。而且，本發明的分離多核苷酸的有義鏈和反義鏈可以通過雜交形 成雙鏈分子或者發夾環結構。在優選實施方案中，這種雙鏈體每10個配對含有不超過1個 錯配。在特別優選的實施方案中，雙鏈體的鏈完全互補，這種雙鏈體不含有錯配。多核苷酸的長度，對于PKIB小于1909個核苷酸，對于NAALADL2小于4912個核苷 酸。例如，對于所有這些基因，多核苷酸的長度小于500、200、100、75、50或25個核苷酸。本 發明的分離多核苷酸可用于形成針對PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分子，或用于制備編碼 這樣的雙鏈分子的模板DNA。當使用所述多核苷酸形成雙鏈分子時，多核苷酸的長度可以超 過19個核苷酸，優選地超過21個核苷酸，更優選地，長度為大約19-大約25個核苷酸。本發明的雙鏈分子可以含有一個或多個經過修飾的核苷酸和/或非磷酸二酯聯 結。本領域中眾所周知的化學修飾能夠提高雙鏈分子的穩定性、利用度和/或細胞攝取。技 術人員知道可用于本發明分子的其它類型的化學修飾(W003/070744 ；W02005/045037)。在 一個實施方案中，可利用修飾來提高對降解的抵抗性或者改善攝取。這些修飾的實例包括 硫代磷酸酯聯結(phosphorothioate linkage), 2' _0_甲基核糖核苷酸(特別是在雙鏈分 子的有義鏈上)，2’ -脫氧-氟代核糖核苷酸，2’ -脫氧-核糖核苷酸，“通用堿基”核苷酸 ("universal base”nucleotide)，5，_C_甲基核苷酸，和倒置脫氧堿基殘基摻入(inverted deoxyabasic residue incorporation) (US20060122137)。在另一個實施方案中，修飾可 用于提高雙鏈分子的穩定性或提高靶定效率。修飾包括雙鏈分子兩條互補鏈之間的化學 交聯，雙鏈分子一條鏈的3’或5’末端化學修飾，糖基化修飾，核苷堿基修飾和/或骨架修 飾，2-氟修飾的核糖核苷酸和2’ -脫氧核糖核苷酸(W02004/029212)。在另一個實施方 案中，修飾可用于增加或降低互補核苷酸在靶mRNA和/或在互補雙鏈分子鏈內的親和性 (W02005/044976)。例如，非修飾的嘧啶核苷酸可以被2-硫，5-炔基，5-甲基，或5-丙炔基 嘧啶代替。此外，非修飾的嘌呤可以被7-脫氮，7-烷基，或7-烯基嘌呤代替。在另一個實 施方案中，當雙鏈分子是具有3’突出端的雙鏈分子時，可以把3’末端核苷酸的懸置核苷酸 替換為脫氧核糖核苷酸(ElbashirSM et al. ,Genes Dev 2001 Jan 15，15(2) :188_200)。更 詳細的內容可以參見已公開的文獻，例如US20060234970。本發明并不僅限于這些實施例， 任何已知的化學修飾均可用于本發明的雙鏈分子，只要所得的分子仍保持抑制靶基因表達 的能力即可。而且，本發明的雙鏈分子可以同時包括DNA和RNA，例如dsD/R-NA或shD/R-NA。 具體地，DNA鏈和RNA鏈的雜交多核苷酸或DNA-RNA嵌合多核苷酸顯示更高的穩定性。可 形成DNA和RNA的混合，即由一條DNA鏈(多核苷酸)和一條RNA鏈(多核苷酸)的雜交 型雙鏈分子，在一條或兩條單鏈(多核苷酸)上同時包含DNA和RNA的嵌合型雙鏈分子，或 諸如此類，以提高雙鏈分子的穩定性。DNA鏈和RNA鏈的雜交體可以是有義鏈為DNA，反義 鏈為RNA，或者相反，只要其在引入到表達靶基因的細胞內時具有抑制靶基因表達的能力即 可。優選地，有義鏈多核苷酸是DNA，反義鏈多核苷酸是RNA。另外，嵌合型雙鏈分子可以是
14兩條有義和反義鏈都由DNA和RNA構成，或者是有義鏈和反義鏈中的任何一個由DNA和RNA 構成，只要其在引入表達該基因的細胞內時具有抑制靶基因表達的活性即可。為了提高雙 鏈分子的穩定性，分子優選地含有盡可能多的DNA，而為了誘導靶基因表達的降低，分子需 要有一定范圍的RNA，以誘導充分的表達抑制。作為嵌合型雙鏈分子的優選實例，雙鏈分子 的上游部分區域(即有義或反義鏈內位于靶序列或其互補序列之側翼的區域)是RNA。優 選地，上游部分區域是指有義鏈的5’側(5’端)和反義鏈的3’側(3’端)。或者，將位于 有義鏈5’端側翼和/或反義鏈3’端側翼的區域稱作上游部分區域。也就是說，在優選實 施方案中，位于反義鏈3’端側翼的區域包含RNA，或者位于有義鏈5’端側翼的區域和反義 鏈3’端側翼的區域均包含RNA。例如，本發明的嵌合或雜交型雙鏈分子包括如下組合有義鏈5，-[DNA]_3，3，~ (RNA) - [DNA] _5，反義鏈有義鏈5，_(RNA)-[DNA]-3，3，~ (RNA) - [DNA] _5，反義鏈，和有義鏈5，_(RNA)-[DNA]-3，3’ -(RNA)-5’ 反義鏈。上游部分區域優選地是由雙鏈分子有義或反義鏈內從靶序列或其互補序列的末 端數起的9-13個核苷酸組成的區域。而且，這種嵌合型雙鏈分子的優選實例包括鏈長為 19-21個核苷酸，其中多核苷酸的至少上游一半(對于有義鏈而言為5’側區域，對于反義鏈 而言是3’側區域)是RNA，另一個半區是DNA。在這種嵌合型雙鏈分子中，抑制靶基因表達 的效果比整個反義鏈都是RNA時的效果高得多(US20050004064)。在本發明中，雙鏈分子可以形成發夾，例如短發夾RNA(shRNA)和由DNA和RNA組 成的短發夾(shD/R-NA)。shRNA或shD/R-NA是一段RNA序列或RNA和DNA的混合序列，其 形成緊密的發夾轉角(turn)，可用于通過RNA干擾來沉默基因表達。shRNA或shD/R-NA包 含位于一條鏈上的有義靶序列和反義靶序列，其中所述序列被一個環序列分開。一般地，發 夾結構被細胞機制切割成dsRNA或dsD/R-NA，它進而結合RNA誘導的沉默復合體(RISC)。 該復合體結合并切割與所述dsRNA或dsD/R-NA的靶序列匹配的mRNA。有義和反義序列之間可以有由任意核苷酸序列構成的環序列，以形成發夾環結 構。因此，本發明還提供了一種雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包 含靶序列的有義鏈，[B]是間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。靶序列可 從例如如下核苷酸的組中選出SEQIDN0:16，或SEQ ID NO 17 用于 PKIB ；核苷酸SEQ ID NO 19 用于 NAALADL2 ；核苷酸本發明不僅限于這些實例，[A]中的靶序列可以是這些實例的修飾序列，只要該 雙鏈分子保留抑制靶定PKIB或NAALADL2基因的表達的能力即可。區域[A]與[A’ ]雜 交，形成由區域[B]構成的環。間插單鏈部分[B]，即環序列，的長度優選地為3-23個核苷 酸。環序列可以從例如包含如下序列的組中選出(http://www. ambion. com/techlib/tb/tb 506. html)。進一步，由23個核苷酸構成的環序列也可提供活性siRNACJacque JM et al.， Nature 2002Jul25,418 (6896) :435_8，電子形式公布于 2002 年 6 月 26 日)
CCC、CCACC、或 CCACACC Jacque JM et al. , Nature 2002 Jul 25,418(6896) 435-8，電子形式公布于2002年6月26日；UUCG :Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May, 20 (5) 500-5 ；FruscoloniP et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 2003Feb 18，100 (4) : 1639-44，電子形式公布于 2003 年 2 月 10日；和UUCAAGAGA :Dykxhoorn DM et al.，Nat Rev Mol Cell Biol 2003Jun，4(6) 457-67。作為舉例，下面顯示了優選的本發明具有發夾環結構的雙鏈分子。在下面的結構 中，環序列可以選自 AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC 和 UUCAAGAGA ；然而， 本發明并不僅限于此gauaugccaucccagauuu-[B]_aaaucugggauggcauauc (用于革巴序列 SEQ ID NO 16)；gucaaauuccccaaauuaa-[B]_uuaauuuggggaauuugac (用于革巴序列 SEQ ID NO 17)； 禾口guguccagaggccaauauu-[B]_aauauuggccucuggacac (用于革巴序列 SEQ ID NO 19)；進一步，為了提高雙鏈分子的抑制活性，可以向靶序列反義鏈的3’端添加核苷酸 “u”，作為3’突出端。添加的“u”的數目至少為2個，一般為2-10個，優選地為2-5個。添 加的“11”在雙鏈分子反義鏈的3’端形成單鏈。制備雙鏈分子的方法沒有特殊限制，但優選地使用本領域已知的化學合成方法。 根據化學合成方法，分別合成有義和反義單鏈多核苷酸，然后通過合適的方法將它們退火 在一起，以獲得雙鏈分子。退火的具體實例包括，其中合成的單鏈多核苷酸以優選地至少大 約3 7;更優選地大約4 6，最優選地基本上等摩爾量(即大約5 5的摩爾比)的比 例混合。接著，將混合物加熱到雙鏈分子會解離的溫度，然后緩慢冷卻下來。經退火的雙鏈 分子可以通過本領域已知的通常使用的方法加以純化。純化方法的實例包括使用瓊脂糖凝 膠電泳的方法，或者視情況除去剩余的單鏈多核苷酸(例如通過用合適的酶降解)的方法。PKIB或NAALADL2序列的側翼調節序列可以是相同或不同的，從而它們的表達可 以獨立地接受調節，或者按照時間(temporal)或空間(spatial)的方式接受調節。可以 通過將PKIB或NAALDADL2基因模板克隆到載體內，例如含有來自小核RNA (snRNA) U6或人 H1RNA啟動子的RNA pol III轉錄單元的載體內，來在細胞內轉錄出雙鏈分子。含有雙鏈分子的載體本發明還包括含有一個或多個本文所述雙鏈分子的載體，和含有該載體的細胞。 本發明的載體優選地以可表達的形式編碼本發明的雙鏈分子。這里，術語“以可表達的形 式”是指載體在被引入到細胞內時會表達所述分子。在優選的實施方案中，載體包括雙鏈分 子表達必需的調節元件。本發明的這些載體可用于產生本發明的雙鏈分子，或者直接作為 用于癌癥治療的活性成分。本發明載體的產生可以通過例如將PKIB或NAALADL2序列克隆到表達載體內，使 調節序列與PKIB或NAALADL2序列以允許兩條鏈表達(通過DNA分子的轉錄)的方式操作 連接(Lee NS et al.，Nat Biotechnol 2002May, 20 (5) :500_5)。例如，相對于 mRNA 為反 義的RNA分子被第一個啟動子(例如所克隆DNA的3’端側翼的啟動子序列)轉錄，相對于 mRNA為有義的RNA分子則被第二個啟動子(例如所克隆DNA 5’端側翼的啟動子序列)轉錄。有義鏈和反義鏈在體內雜交，產生用于沉默基因的雙鏈分子構建體。或者，使用兩個載 體構建體，它們分別編碼雙鏈分子有義和反義鏈，來分別表達有義鏈和反義鏈，然后形成雙 鏈分子構建體。而且，所克隆的序列可以編碼具有二級結構(例如發夾)的構建體；即載體 的單個轉錄本同時含有靶基因的有義序列和互補反義序列。還可以為本發明的載體提供必要的裝備，以實現在靶細胞的基因組中的穩定插 入(同源重組盒載體的描述見例如Thomas KR&Capecchi MR，Celll987，51 :503_12)。見 例如 Wolff et al.，Science 1990，247 1465-8 ；US PatentNos. 5，580，859 ；5，589，466 ； 5，804，566 ；5，739，118 ；5，736，524 ；5，679，647 ；和 W098/04720。基于 DNA 的遞送技術的實 例包括“裸DNA”，協助(布比卡因(bupivicaine)、聚合物、肽介導的)遞送、陽離子脂質復 合體和顆粒介導的(“基因槍”)或壓力介導的遞送(見例如美國專利No. 5，922，687)。本發明的載體可以是，例如，病毒或細菌載體。表達載體的實例包括減毒病毒宿 主，例如牛痘或禽痘(見例如美國專利No. 4，722，848)。這種方法涉及使用痘苗病毒，例 如作為載體來表達編碼該雙鏈分子的核苷酸序列。在被引入到表達靶基因的細胞內時，重 組牛痘病毒表達該分子，借此抑制細胞的增殖。可使用的載體的另一個實例包括卡介苗 (BCG)。BCG 載體在 Stover et al.，Nature 1991，351 :456_60 中有記載。多種其它載體也 可用于雙鏈分子的治療性施用和產生；實例包括腺病毒載體和腺伴隨病毒載體、逆轉錄病 毒載體、傷寒沙門氏菌(Salmonella typhi)載體、脫毒的炭疽毒素載體等。見例如Shata et al.，Mol Med Today 2000,6 :66_71 ；Shedlock et al.，J LeukocBiol 2000,68 :793_806 ； 和 Hipp et al. ， In Vivo 2000，14 :571_85。用雙鏈分子治療癌癥的方法在本發明中，為PKIB構建了 3種不同的dsRNA，為NAALADL2構建了 3種不同的 dsRNA，測試它們抑制細胞生長的能力。PKIB的兩種dsRNA有效敲低了基因在兩種前列腺癌 細胞系中的表達，同時細胞增殖被抑制(圖3A、B和C)。NAALADL2的一個dsRNA顯著降低 了前列腺細胞系中的表達水平和細胞生長能力(圖4A-E)。因此，本發明提供了通過抑制PKIB或NAALADL2基因的表達，誘導PKIB或 NAALADL2基因的功能障礙，從而抑制細胞生長，即前列腺癌細胞生長的方法。PKIB或 NAALADL2基因的表達可以被任何前述的特異性靶定PKIB或NAALADL2基因的本發明雙鏈分 子所抑制，或者被能夠表達任何該雙鏈分子的本發明載體所抑制。本發明雙鏈分子和載體的這種抑制癌性細胞的細胞生長的能力提示它們能夠用 于癌癥治療方法。因此，本發明提供了治療前列腺癌患者的方法，所述方法施用針對PKIB 或NAALADL2基因的雙鏈分子或表達該分子的載體，而沒有不良作用，因為這些基因在正常 器官中幾乎未檢出(圖1和2)。術語“特異性抑制”，在抑制性多核苷酸和多肽的語境中，是指試劑或配體抑制 PKIB或NAALADL2的表達或生物學功能的能力。特異性抑制通常導致PKIB或NAALADL2的 表達(例如轉錄或翻譯)或測得的生物學功能(例如細胞生長或增殖，細胞凋亡的抑制)與 背景相比至少有大約2倍的抑制，優選地大于大約10倍，最優選地大于100倍的抑制。表 達水平和/或生物學功能可以通過比較經過處理的和未經處理的細胞或者處理之前和之 后的細胞群體加以測量。在一些實施方案中，PKIB或NAALADL2的表達或生物學功能被完 全抑制。典型地，特異性的抑制，是利用合適的統計檢驗，顯示PKIB或NAALADL2的表達或
17生物學功能的統計學上有意義的降低(例如P ^ 0. 05)。具體地，本發明提供了如下的方法[1]_[23][1] 一種用于治療前列腺癌的方法，包括施用至少一種分離的雙鏈分子的步驟，所 述雙鏈分子抑制PKIB或NAALADL2在過表達該基因的細胞內的表達和細胞的增殖，該分子 包括有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。[2] [1]所述的方法，其中該有義鏈包含與從SEQ ID NO :16，17和19的組中選出 的靶序列對應的序列。[3] [1]所述的方法，其中待治療的前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢抵抗性 前列腺癌；[4] [1]所述的方法，其中施用多種雙鏈分子；[5] [4]所述的方法，其中所述多種雙鏈分子靶定相同的基因；[6] [1]所述的方法，其中雙鏈分子的長度小于約100個核苷酸；[7] [6]所述的方法，其中雙鏈分子的長度小于約75個核苷酸；[8] [7]所述的方法，其中雙鏈分子的長度小于約50個核苷酸；[9] [8]所述的方法，其中雙鏈分子的長度小于約25個核苷酸；[10] [9]所述的方法，其中雙鏈分子的長度為大約19-大約25個核苷酸；[11] [1]所述的方法，其中雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通過 間插單鏈連接起來的有義鏈和反義鏈；[12] [11]所述的方法，其中雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]_3’，其中[A]是 包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間插單 鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈；[13] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含RNA ；[14] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含DNA和RNA ；[15] [14]所述的方法，其中雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜交體；[16] [15]所述的方法，其中所述有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸分別由DNA和 RNA構成；[17] [14]所述的方法，其中所述雙鏈分子是DNA和RNA的嵌合體；[18] [17]所述的方法，其中位于反義鏈3’端側翼的區域由RNA構成，或者位于有 義鏈5’端側翼的區域和反義鏈3’端側翼的區域均由RNA構成；[19] [18]所述的方法，其中所述側翼區域由9-13個核苷酸組成；[20] [1]所述的方法，其中所述雙鏈分子含有3’突出端；[21] [1]所述的方法，其中所述雙鏈分子由載體編碼；[22] [21]所述的方法，其中所述由載體編碼的雙鏈分子具有通式 5，_[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A]是包含選自SEQ ID N0:16、17和19的序列的有義鏈，[B] 是由3-23個核苷酸組成的間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈；和[23] [1]所述的方法，其中雙鏈分子包含在組合物中，該組合物除了該分子之外還 包括轉染增強劑和藥學上可接受的載體。下文中將更詳細地描述本發明的方法。通過使表達PKIB或NAALADL2基因的細胞與針對PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分
18子、表達該分子的載體、或包含它(們)的組合物接觸，可抑制該細胞的生長。進一步使細 胞與轉染劑接觸。合適的轉染劑是本領域已知的。術語“抑制細胞生長”表示與沒有暴露 于該分子的細胞相比，細胞增殖速度更低或者生存力降低。細胞生長可以用本領域已知的 方法測量，例如使用MTT細胞增殖測定。任何類型細胞的生長均可根據本發明加以抑制，只要該細胞表達或過表達本發明 雙鏈分子的靶基因即可。示例細胞包括前列腺癌細胞。因此，對于患有或有風險患上與PKIB或NAALADL2相關的疾病的患者，可以通過施 用至少一種本發明的雙鏈分子、至少一種表達至少一種該分子的載體、或至少一種含有至 少一種該分子的組合物加以治療。例如，前列腺癌患者可以根據本發明的方法加以治療。癌 癥的類型可以利用與待診斷腫瘤的具體類型相應的常規方法加以鑒定。前列腺癌可以用例 如前列腺特異抗原(PSA)或直腸指檢(digital rectal exam)進行診斷。更優選地，通過 RT-PCR或免疫測定檢測來自患者的活檢物中的PKIB或NAALADL2的表達，據此選擇可通過 本發明方法治療的患者。優選地，在用本發明治療之前，通過本領域已知的方法，例如免疫 組織化學分析或RT-PCR，確認來自受試者的活檢樣本中PKIB或NAALADL2基因的過表達。根據該抑制細胞生長以治療癌癥的方法，在施用多種雙鏈分子(或表達這些分子 的載體或含有這些分子的組合物)時，每種分子可以針對PKIB和/或NAALADL2的相同靶 序列或者不同靶序列。例如，所述方法可以采用針對PKIB或NAALADL2的雙鏈分子。或者， 例如，所述方法可以采用針對從PKIB和NAALADL2選出的1種、2種或多種靶序列的雙鏈分 子。為了抑制細胞生長，可以將本發明的雙鏈分子以該分子與相應的mRNA轉 錄本相結合的形式直接導入到細胞內。或者，如上文所述，可將編碼該雙鏈分子 的DNA作為載體導入到細胞內。為了將雙鏈分子和載體導入到細胞內，可以采用轉 染增強齊U，例如 FuGENE(Rochediagnostices)， Lipofectamine 2000(Invitrogen)、 Oligofectamine (Invitrogen)、禾口 Nucleofector (Wako pure Chemical)。如果治療可導致臨床利益，例如患者體內PKIB或NAALADL2基因的表達降低，或癌 癥的大小、普遍性(prevalence)或轉移潛力下降，則治療可被確定有效。當治療是預防性 施用時，“有效”的意思是它可阻止或預防癌癥形成，或者預防或減輕癌癥的臨床癥狀。有效 性的確定可以和任何已知的用于診斷或治療特定腫瘤類型的方法結合進行。預防(prevention和prophylaxis)包括任何可以減輕疾病所致的死亡率或發病 率負擔的活動。預防可以在“一級、二級和三級預防水平”上進行。一級預防是避免疾病的 發生，而二級和三級水平的預防包括旨在預防疾病進展和癥狀出現、以及通過恢復功能和 減少疾病相關并發癥來減輕已成形的疾病的負面影響的活動。或者，預防包括廣泛的旨在 減輕特定疾病嚴重性的預防性治療，例如降低腫瘤的增殖和轉移，減少血管新生。癌癥的治療和/或防治，和/或術后復發的預防包括任何如下步驟，例如手術除去 癌細胞、抑制癌性細胞的生長、腫瘤的消退或衰退，誘導癌癥的減輕和抑制癌癥的發生、腫 瘤衰退、和減少或抑制轉移。癌癥的有效治療和/或防治可降低患癌個體的死亡率，改善患 癌個體的預后，降低血液中腫瘤標志物的水平，和減輕可檢測的癌癥伴隨癥狀。應當理解，本發明的雙鏈分子以亞化學計量的方式降解靶mRNA (PKIB或 NAALADL2)。不希望受限于任何理論，我們相信，本發明的雙鏈分子是以催化的方式降解靶mRNA的。因此，與常規的癌癥治療相比，為發揮治療效果而需要在癌癥部位或其附近遞送的 雙鏈分子顯著較少。本領域的技術人員通過考慮如下因素，例如受試者的體重、年齡、性別、疾病類型、 癥狀和其它條件；施用途徑；施用是局部性還是全身性的等，能夠容易地確定施予給定受 試者的本發明雙鏈分子的有效量。一般地，本發明雙鏈分子的有效量包括癌癥部位或附近 的細胞內濃度，為大約1納摩爾(nM)-大約lOOnM，優選地大約2nM_大約50nM，更優選地大 約2. 5nM-大約lOnM。我們意圖可以施用更大或更小量的雙鏈分子。本方法可用于抑制癌癥的生長或轉移；例如前列腺癌，特別是激素難治性前列腺 癌或去勢抵抗性前列腺癌。特別地，包含PKIB靶序列(即SEQ IDN0:16和17)的雙鏈分子 是治療前列腺癌特別優選的；包含NAALADL2靶序列(即SEQ ID NO 19)的雙鏈分子是治療 前列腺癌特別優選的。為了治療癌癥，還可以將本發明的雙鏈分子和與該雙鏈分子不同的藥劑組合施用 給受試者。或者，可以將本發明的雙鏈分子和另一種設計用于治療癌癥的治療方法組合施 用給受試者。例如，本發明的雙鏈分子可以和目前用于治療癌癥或防止癌癥轉移的治療方 法(例如放射治療，手術和使用化療劑例如順鉬、卡鉬、環磷酰胺、5-氟尿嘧啶、亞德里亞霉 素、柔紅霉素(daunorubicin)或他莫昔芬(tamoxifen)的治療)組合施用。在本方法中，雙鏈分子可以作為裸雙鏈分子施用、與遞送劑聯合施用、或者作為表 達雙鏈分子的重組質粒或病毒載體施用給受試者。用于和本發明雙鏈分子聯合施用的合適遞送劑包括Mirus Trans it TKO 親脂試 劑；lipofectin ；lipofectamine ；cellfectin ；或多聚陽離子(例如多聚賴氨酸)；或脂質 體。優選地遞送劑是脂質體。脂質體能夠輔助將雙鏈分子遞送到特定組織，例如前列腺腫瘤組織，并且還能 夠增加雙鏈分子的血液半衰期。適于用在本發明的脂質體由常規的囊泡形成性脂質 (vesicle-forming 1 ipids)形成，它們一般包括中性或帶負電荷的磷脂和甾醇，例如膽 固醇。一般通過考慮期望的脂質體大小和脂質體在血流中的半衰期等因素來指導脂質的 選擇。已知有多種方法用于制備脂質體，例如在下列文獻中記載的Szoka et al. , Ann Rev Biophys Bioeng 1980，9 :467 ；和 US Pat. Nos. 4, 235, 871；4, 501, 728 ；4, 837, 028 -M 5，019，369，本文援引并入它們的全部公開內容。優選地，封裝本發明雙鏈分子的脂質體包括能夠將脂質體遞送到癌癥部位的配體 分子。與普遍存在于腫瘤或血管內皮細胞中的受體結合的配體，例如與腫瘤抗原或內皮細 胞表面抗原結合的單克隆抗體，是優選的。特別優選的是對封裝本發明雙鏈分子的脂質體加以修飾，以避免被單核巨噬細胞 和網狀內皮系統(reticuloendothelial system)所清除，例如通過使結構的表面結合有調 理作用抑制部分(moieties)。在一個實施方案中，本發明的脂質體可以同時包括調理作用 抑制部分和配體。用于制備本發明的脂質體的調理作用抑制部分通常是與脂質體膜結合的大型親 水性聚合物。如在本說明書中所使用的，例如，當調理作用抑制部分化學地或物理地搭接 在膜上時，例如通過脂溶性錨(anchor)插入膜本身，或者通過與膜脂質的活性基團直接結 合，則調理作用抑制部分與脂質體膜“結合”。這些調理作用抑制性親水性聚合物形成保護性表層，顯著地減少單核巨噬細胞系統(“匪S”)和網狀內皮系統(”RES”)對脂質體的攝 入；在例如美國專利第4，920，016號中對此有記載，后者的全部公開內容援引并入本說明 書。因此，與未修飾的脂質體相比，被調理作用抑制部分修飾過的脂質體能夠保留在血液循 環中的時間顯著更長。出于以上理由，上述脂質體有時也被稱為“隱形”(stealth)脂質體。已知隱形脂質體蓄積在依靠多孔性或“滲漏性”微血管系統供給的組織中。因此， 在以這樣的微血管系統缺損為特征的靶組織，例如實體瘤中，這些脂質體會高效率地蓄積。 參見 Gabizon 等，Proc Natl Acad Sci USA 1988,18:6949-53。此外，由于 RES 的攝入的減 少，防止隱形脂質體在肝臟和脾臟中的顯著蓄積，從而降低隱形脂質體的毒性。因此，用調 理作用抑制部分修飾的本發明的脂質體能夠將本發明的雙鏈核酸分子輸送至腫瘤細胞。適用于修飾脂質體的調理作用抑制部分優選為分子量約500 約40，000道爾 頓、更優選約2，000 約20，000道爾頓的水溶性聚合物。這樣的聚合物中包括聚乙二 醇(PEG)或聚丙二醇(PPG)衍生物；例如，甲氧基PEG或PPG、和PEG或PPG硬脂酸酯； 合成聚合物如聚丙烯酰胺或聚N-乙烯基吡咯烷酮；直鏈狀、分枝狀或者樹狀聚酰胺胺 (polyamidoamine)；聚丙烯酸；多元醇，諸如化學結合有羧基或氨基的聚乙烯醇和聚木糖 醇，以及神經節苷脂，諸如神經節苷脂GMlt) PEG、甲氧基PEG、或甲氧基PPG或其衍生物的共 聚體也是適合的。此外，抑制調理作用的聚合物可以是PEG與聚氨基酸、多糖、聚酰胺胺、聚 亞乙基胺或者多核苷酸中的任何一種的嵌段共聚物。抑制調理作用的聚合物還可以是含有 氨基酸或羧酸的天然多糖，例如半乳糖醛酸、葡糖醛酸、甘露糖醛酸、透明質酸、果膠酸、神 經氨酸、海藻酸、角叉膠；氨基化多糖類或寡糖(直鏈狀或者分枝狀)；或者羧基化的多糖或 寡糖，例如，與碳酸的衍生物反應而生成了羧基結合的羧基化多糖類或寡糖。優選地，調理作用抑制部分是PEG、PPG或其衍生物。用PEG或PEG衍生物修飾的 脂質體有時稱作“PEG化脂質體”。調理作用抑制部分可以通過許多公知技術中的任何一種結合到脂質體膜上。例 如，PEG的N-羥基琥珀酰亞胺酯能夠與磷脂酰乙醇胺脂溶性錨(lipid-soluble anchor)結 合，然后再結合到膜上。相似地，可以通過還原性氨基化，用硬脂酰胺脂溶性錨來將右旋糖 酐聚合物衍生化，所述還原性氨基化中使用Na (CN) BH3和混合溶劑，如60°C的四氫呋喃與水 的30 12比例混合物。上文討論了表達本發明的雙鏈核酸分子的載體。這樣的表達至少一種本發明的雙 鏈核酸分子的載體也可以直接施用或者與合適的投遞試劑，包括Mirus Transit LT1 脂 溶性試劑、lipofectin, lipofectamine, cellfectin、聚陽離子(例如聚賴氨酸)或脂質體 等組合施用。將表達本發明的雙鏈核酸分子的重組病毒載體投遞到患者的癌癥區域的方法 在本技術領域的技術范圍內。本發明的雙鏈核酸分子可以通過適于將雙鏈核酸分子投遞到癌癥區域的任何手 段來施用給受試者。例如，雙鏈核酸分子可以通過基因槍、電穿孔、或者其它合適的非消化 道或腸內施用途徑來施用。合適的腸內施用途徑包括口服、直腸或鼻內投遞。合適的非消化道施用途徑包括靜脈內施用(例如靜脈內推注、靜脈內輸注、動脈 內推注、動脈內輸注和向血管網絡中的導管滴注)，組織周圍和組織內注射(例如腫瘤周圍 和腫瘤內注射)，皮下注射或沉積，包括皮下輸注(例如利用浸透壓泵)，直接施加到癌癥區
21域或其附近，例如借助導管或其它放置裝置(例如，包含多孔性、非多孔性或明膠狀材料的 視網膜片劑(retinal pellet)或栓劑或植入物)，和吸入。優選通過注射或輸注將雙鏈核 酸分子或載體施用到癌癥部位或其附近。本發明的雙鏈核酸分子可以以單一劑量或分多個劑量來施用。當本發明的雙鏈核 酸分子通過輸注方式施用時，輸注可以是單個持續劑量，或者通過多次輸注來輸送。優選的 是將藥劑直接注射到癌癥部位或其附近的組織中。特別優選的是將藥劑多次注射到癌癥部 位或其附近的組織中。本領域技術人員可以容易地確定合適的劑量方案來給受試者施用本發明的雙鏈 核酸分子。例如，可以將雙鏈核酸分子一次施用給受試者，例如以單次注射或者沉積的形式 施用到癌癥部位或其附近。或者，雙鏈核酸分子可以在約3 約28日、更優選約7 約10 日的期間內施用給受試者，每日一次或二次。在優選的劑量方案中，在7日期間內每日一次 地將雙鏈核酸分子注射到癌癥部位或其附近。當劑量方案包括多次施用時，應該理解的是， 給受試者施用的雙鏈核酸分子的有效量，可以包含在整個劑量方案中施用的該雙鏈核酸分 子的總量。包含雙鏈分子的組合物進一步，本發明提供了包含至少一種本發明雙鏈分子或編碼這些分子的載體的藥 物組合物。具體地，本發明提供了如下的組合物[1]_[23][1] 一種用于治療前列腺癌的組合物，包括至少一種分離的雙鏈分子，該雙鏈分子 抑制PKIB或NAALADL2的表達和細胞增殖，該分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼 此雜交形成該雙鏈分子。[2] [1]所述的組合物，其中該有義鏈包含與從SEQ ID NO 16，17和19中選出的 靶序列對應的序列。[3] [1]所述的組合物，其中待治療的前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢抵抗 性前列腺癌；[4] [1]所述的組合物，其中該組合物含有多種所述的雙鏈分子；[5] [4]所述的組合物，其中所述多種雙鏈分子靶定相同的基因；[6] [1]所述的組合物，其中雙鏈分子的長度少于約100個核苷酸；[7] [6]所述的組合物，其中雙鏈分子的長度少于約75個核苷酸；[8] [7]所述的組合物，其中雙鏈分子的長度少于約50個核苷酸；[9] [8]所述的組合物，其中雙鏈分子的長度少于約25個核苷酸；[10] [9]所述的組合物，其中雙鏈分子的長度為約19-大約25個核苷酸；[11] [1]所述的組合物，其中雙鏈分子由單一多核苷酸構成，所述多核苷酸包含通 過間插單鏈連接起來的有義鏈和反義鏈；[12] [11]所述的組合物，其中雙鏈分子具有通式5’ _[A]-[B]-[A，]_3，，其中[A] 是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間插 單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈；[13] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子包含RNA ；[14] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子包含DNA和RNA ；[15] [14]所述的組合物，其中所述雙鏈分子是DNA多核苷酸與RNA多核苷酸的雜
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[16] [15]所述的組合物，其中所述有義鏈多核苷酸和反義鏈多核苷酸分別由DNA 和RNA構成；[17] [14]所述的組合物，其中雙鏈分子是DNA和RNA的嵌合體；[18] [17]所述的組合物，其中位于反義鏈3’端側翼的區域由RNA構成，或者位于 有義鏈5’端側翼的區域和反義鏈3’端側翼的區域均由RNA構成；[19] [18]所述的組合物，其中所述側翼區域由9-13個核苷酸構成；[20] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子含有3’突出端；[21] [1]所述的組合物，其中所述雙鏈分子由載體所編碼，并且包含在組合物內；[22] [21]所述的組合物，其中所述雙鏈分子具有通式5’-[幻-[8]-仏’]_3’，其中 [A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間 插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈；和[23] [1]所述的組合物，其中該組合物包含轉染增強劑和藥學上可接受的載體。本發明的方法在下文將有更加詳細的記載。對于本發明的雙鏈核酸分子，在施用給受試者之前，優選采用本技術領域公知的 技術將其配制成藥物組合物。本發明的藥物組合物的特征在于至少是無菌和無熱源的。如 在本說明書中使用的，“藥物制劑”包括人用和獸醫用的制劑。本發明的藥物組合物的制備 方法在本技術領域的技術范圍內，例如如Remington' s Pharmaceutical Science, 17th ed.，Mack PublishingCompany，Easton，Pa. (1985)所記載的，將其全部內容援引并入本說 明書。本藥物制劑包含至少一種本發明的雙鏈分子或編碼它們的載體(例如重量比 0. 1-90% )，或者所述分子的生理可接受的鹽，與生理可接受的載體介質相混合。優選的生 理可接受的載體介質是水、緩沖水(buffered water)、生理鹽水、0. 4%鹽水、0. 3%甘氨酸、 透明質酸等。根據本發明，該組合物可以含有多種類型的雙鏈分子，每一種分子可以被導向到 PKIB和/或NAALADL2的相同靶序列或不同靶序列。例如，所述組合物可以含有針對PKIB 或NAALADL2的雙鏈分子。或者，例如，所述組合物可以包含針對從PKIB或NAALADL2選出 的一個、兩個或更多個靶序列的雙鏈分子。進一步，本組合物可以含有編碼一個或多個雙鏈分子的載體。例如，載體可以編碼 一種、兩種或多種本發明雙鏈分子。或者，本組合物可以包含多種類型的載體，每一種載體 編碼一種不同的雙鏈分子。而且，本雙鏈分子可以作為脂質體包含在本發明組合物中。關于脂質體的細節，見 條目“使用雙鏈分子治療癌癥的方法”。此外，本發明的藥物組合物中還可以包含常規的藥用賦形劑和/或添加劑。合適 的藥用賦形劑包括穩定化劑、抗氧化劑、浸透壓調節劑、緩沖劑、和PH調節劑。合適的添加 劑包括生理學上生物相容性的緩沖液(例如氨基丁三醇鹽酸鹽)、補加螯合劑(例如DTPA 或DTPA-雙酰胺等)，或鈣螯合劑復合物(例如、鈣DTPA、CaNaDTPA-雙酰胺)，或者，任選地， 補加鈣或鈉鹽(例如氯化鈣、抗壞血酸酸鈣、葡糖酸鈣或乳酸鈣)。本發明的藥物組合物可 以進行包裝以便作為液體使用，或者也可以加以冷凍干燥。
對于固體組合物，可以使用常規的無毒固態載體；例如，藥物級的甘露醇、乳酸、淀 粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖、碳酸鎂等。例如，用于口服的固體藥物組合物可以包括任何上面列舉的載體和賦形劑，和 10-95%，優選地25-75%的一種或多種本發明雙鏈分子。用于噴霧(吸入)施用的藥物組 合物可以包括重量比0. 01-20%，優選地重量比1-10%的一種或多種如上所述地包被在脂 質體中的本發明雙鏈分子，和推進劑。還可以視需要包含載體；例如卵磷脂，用于鼻內遞送。除了上述之外，本組合物可以含有其它的藥物活性成分，只要它們不抑制本雙鏈 分子的體內功能即可。例如，組合物可以含有常規用于治療癌癥的化療劑。在其它實施方案中，本發明還提供本發明的雙鏈核酸分子在制備用于治療表達 PKIB和/或NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物中的用途。例如，本發明涉及下述雙鏈核酸 分子在制備用于治療表達PKIB和/或NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物中的用途該雙 鏈核酸分子在細胞中抑制PKIB和/或NAALADL2基因的表達，該分子包含有義鏈和與之互 補的反義鏈，所述有義鏈和與之互補的反義鏈彼此雜交而形成所述雙鏈核酸分子，且該分 子以選自SEQ ID NO 16、17和19中的序列為靶標。或者，本發明進一步提供了用于制造用于治療表達PKIB和/或NAALADL2基因的 癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括將藥學上或生理學上可接受的載 體與作為活性成分的、可抑制PKIB和/或NAALADL2基因在細胞內的表達的雙鏈核酸分子 一起配制的步驟，該分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，所述有義鏈和反義鏈彼此雜交 形成所述雙鏈核酸分子，并且該分子以選自SEQ ID N0:16、17和19的序列為靶標。在另一個實施方案中，本發明還提供了用于制造用于治療表達PKIB和/或 NAALADL2基因的癌癥的藥物組合物的方法或過程，其中該方法或過程包括混合活性成分與 藥學上或生理學上可接受的載體的步驟，其中該活性成分是抑制PKIB和/或NAALADL2基 因在細胞內表達的雙鏈核酸分子，該分子包括有義鏈和與之互補的反義鏈，所述有義鏈和 反義鏈彼此雜交形成所述雙鏈核酸分子，并且該分子以選自SEQ ID N0:16、17和19的序列 為靶標。或者，根據本發明，提供了本發明雙鏈分子在制造用于治療前列腺癌的藥物組合 物方面的應用。進一步，本發明還提供了用于治療前列腺癌的本發明雙鏈分子。診斷前列腺癌的方法PKIB或NAALADL2的表達被發現特異性地在前列腺癌細胞中變得更高(圖1A、B、 C、D、E、F和圖2A，B)。因此，本文鑒定的基因以及其轉錄和翻譯產物可作為標志用于診斷前 列腺癌，并且，通過測量PKIB或NAALADL2在細胞樣品中的表達，可以診斷前列腺癌。具體 地說，本發明提供了通過確定PKIB或NAALADL2在受試者中的表達水平來診斷前列腺癌的 方法。可以通過本方法診斷的前列腺癌包括激素難治性前列腺癌或去勢抵抗性前列腺癌。本發明的方法可以為確定受試者狀況提供初始結果。這些初始結果可以和其他信 息結合，來幫助醫生、護士或其它從業人員診斷疾病。或者，本發明可用于檢測受試者來源 組織中的癌性細胞，并為醫生提供診斷疾病的有用信息。具體地，本發明提供了如下方法[1]_[10][1] 一種用于診斷或檢測前列腺癌存在的方法，所述方法包括如下步驟(a)檢測生物樣品中編碼PKIB或NAALADL2氨基酸序列的基因的表達水平；和
(b)將該基因與正常對照水平相比的表達水平增加與疾病相關聯。[2] [1]所述的方法，其中表達水平比正常對照水平至少高10%。[3] [1]所述的方法，其中通過選自下組的任何一種方法檢測表達水平(a)檢測包含PKIB或NAALADL2的序列的mRNA，(b)檢測包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白質，和(c)檢測包含PKIB或NAALADL2的氨基酸序列的蛋白質的生物活性。[4] [1]所述的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢抵抗性前列腺 癌。[5] [3]所述的方法，其中通過檢測探針與基因轉錄本的雜交確定表達水平。[6] [3]所述的方法，其中表達水平的確定是通過檢測抗體與由基因編碼的蛋白質 的結合作為基因的表達水平。[7] [1]所述的方法，其中生物樣品包括活檢物、痰、血液或尿。[8] [1]所述的方法，其中受試者來源的生物樣品包括上皮細胞。[9] [1]所述的方法，其中受試者來源的生物樣品包括癌細胞。[10] [1]所述的方法，其中受試者來源的生物樣品包括癌性上皮細胞。下文將更詳細地記載診斷或檢測前列腺癌存在的方法。本方法要診斷的受試者優選地是哺乳動物。哺乳動物的實例包括，但不限于，例如 人、非人靈長動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬和牛。優選地從待診斷的受試者收集生物樣品來進行診斷。任何生物材料均可用作供測 定的生物樣品，只要其包含PKIB或NAALADL2的目標轉錄產物或翻譯產物即可。生物樣品 包括，但不僅限于，身體組織或體液，例如血液、痰和尿。優選地，生物樣品含有細胞群體，包 括上皮細胞，更優選地是癌上皮細胞或來自懷疑為癌性的前列腺組織的上皮細胞。進一步， 如果需要，可以從所得身體組織和體液純化出細胞，然后用作生物樣品。根據本發明，測定PKIB或NAALADL2在受試者來源的生物樣品中的表達水平。表 達水平可以在轉錄本(核酸)產物水平上加以確定，使用本領域已知的方法。例如，PKIB或 NAALADL2的mRNA可以通過雜交方法(例如Northern雜交)用探針進行定量。檢測可以 在芯片或陣列上進行。對于包括PKIB或NAALADL2在內的多數個基因(例如各種癌特異基 因)的表達水平的檢測，陣列的使用是優選的。本領域的技術人員可以利用PKIB(SEQ IDN0 1 ；GenBank 登錄號匪 181795)或 NAALADL2 (SEQ ID NO 3 ；GenBank 登錄號匪 207015 或 SEQ ID NO 5;GenBank登錄號AK021754)的序列信息制備這些探針。例如，可以使用PKIB 或NAALADL2的cDNA作為探針。如果需要，可以用合適的標簽，例如染料、熒光和同位素 等，來標記探針，由此基因的表達水平可以作為雜交標簽的強度加以檢測。進一步，PKIB或 NAALADL2的轉錄產物可以通過基于擴增的檢測方法(例如RT-PCR)用引物進行定量。這 些引物還可以根據基因的可用序列信息加以制備。例如，實施例中使用的引物(SEQ ID NO 8-15)可以用來實施RT-PCR或Northern印跡檢測，但是本發明并不僅限于此。具體地，用于本方法的探針或引物在嚴格、中等嚴格或低嚴格條件下與PKIB或 NAALADL2的mRNA雜交。如本文所使用的，術語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在該 條件下，探針或引物與其靶序列雜交，但不與其它序列雜交。嚴格條件是依賴于序列的，在 不同的環境下會不同。較長序列的特異雜交與較短序列相比在較高溫度下發生。一般地，
25嚴格條件的溫度應選擇比特定序列在限定的離子強度和PH下的熔點(Tm)低大約5°C。Tm 是(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)平衡狀態下有50%的與靶序列互補的探針與靶 序列雜交的溫度。因為靶序列一般過量存在，因此在Tm下，平衡時50%的探針被占據。典 型地，嚴格條件是這樣的其中鹽濃度小于大約1. 0M鈉離子，典型地大約0. 01-1. 0M鈉離子 (或其它鹽)，pH7. 0-8. 3，溫度對于較短的探針或引物(例如10-50個核苷酸)是至少大約 30°C，用于較長的探針或引物是至少大約60°C。嚴格條件也可以通過添加去穩定劑，例如甲 酰胺，來實現。 或者，可以檢測翻譯產物以進行本發明的診斷。例如，可以確定PKIB或NAALADL2 蛋白的量。測定作為翻譯產物的蛋白量的方法包括免疫測定法，此類方法使用特異識別 PKIB或NAALADL2蛋白的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆的。而且，抗體的任何片段或 修飾(例如嵌合抗體、sCFV、Fab、F(ab，)2、Fv等)均可用于檢測，只要該片段保留對PKIB 或NAALADL2蛋白的結合能力即可。制備這些類型的用于檢測蛋白的抗體的方法是本領域 眾所周知的，并且在本發明中可以使用任何方法制備這些抗體和它們的等價物。優選地，結 合PKIB的抗體被制備為具有表位肽，所述表位肽包含SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO 33)或 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK (SEQ ID NO 34)的氨基酸序列。而與 NAALADL2 結合的抗體 則被制備為具有含有胞外域(SEQ ID NO 32)的表位肽。作為根據翻譯產物檢測PKIB或NAALADL2基因的表達水平的另一種方法，可以用 針對PKIB或NAALADL2蛋白的抗體通過免疫組織化學分析觀察染色的強度。也就是說，強 染色觀察結果表明蛋白存在量增加，同時表明PKIB或NAALADL2基因的表達水平升高。而且，除了 PKIB或NAALADL2基因的表達水平之外，還可以確定其它癌癥相關基因 的表達水平，例如已知在前列腺癌中差異表達的基因，以提高診斷的準確度。如果PKIB或NAALADL2在生物樣品中的表達水平比PKIB或NAALADL2基因的對照 水平增加例如10 %、25 %或50 % ；或者增加到超過1. 1倍，超過1. 5倍，超過2. 0倍，超過 5. 0倍，超過10. 0倍或者更多，則可看作該表達水平升高。對照水平可以與測試生物樣品同時確定，使用先前從疾病狀態(患癌或未患癌) 已知的患者收集和保存的樣品。或者，對照水平可以借助統計方法，根據通過分析先前測定 的來自疾病狀態已知的受試者的樣品的PKIB或NAALADL2基因表達水平獲得的結果加以確 定。進一步，對照水平可以是來自先前測試過的細胞的表達模式數據庫。而且，根據本發明 的一個方面，可以將生物樣品中PKIB或NAALADL2基因的表達水平與從多個參考樣品確定 的多個對照水平比較。優選地使用從來自與患者來源樣品組織類型相似的組織類型的參考 樣品確定的對照水平。而且，優選地，使用具有已知的疾病狀態的群體中PKIB或NAALADL2 基因表達水平的標準值。標準值可以通過本領域已知的任何方法獲得。例如，平均值士2S. D.或平均值士3S.D.的范圍可以用作標準值。在本發明的語境下，從已知非癌性的生物樣 品確定的對照水平稱作“正常對照水平”。另一方面，如果對照水平從癌性生物樣品確定，則 稱作“癌對照水平”。當PKIB或NAALADL2基因的表達水平比正常對照水平增加或者與癌對照水平相似 時，可以診斷患者罹患或者具有發生癌癥的危險。而且，當比較多種癌癥相關基因的表達水 平時，樣品與癌參考樣品之間基因表達模式相似表明受試者罹患或具有發生癌癥的危險。測試生物樣品的表達水平與對照水平間的差異，可以相對已知表達水平不會隨著細胞的癌或非癌狀態改變的對照核酸，例如管家基因，的表達水平加以標準化。示例對照基 因包括，但不僅限于，肌動蛋白、甘油醛_3磷酸脫氫酶和核糖體蛋白P1。抗前列腺癌化合物的篩選在本發明的內容中，待通過本篩選方法鑒定的治療劑可以是任何化合物或包含數 種化合物的組合物。而且，根據本發明篩選方法暴露于細胞或蛋白的測試劑可以是單個化 合物或多個化合物的組合。當在方法中使用化合物組合時，化合物可以順次或同時加以接 觸。任何測試劑，例如，細胞提取物、細胞培養上清、發酵微生物產物、海洋生物提取 物、植物提取物、純化或粗蛋白質、肽、非肽化合物、合成小分子化合物以及天然化合物，均 可用于本發明的篩選方法中。也可使用本領域熟知的很多組合文庫方法中的任何途徑來 獲得測試化合物，包括(1)生物文庫，(2)空間可尋址平行固相或液相文庫(spatially addressable parallelsolid phase or solution phase libraries), (3) ■胃角軍 禾只 (deconvolution)的合成文庫法，(4)"一珠一化合物，，("one-bead one-compound，，)文 庫法，以及(5)使用親和色譜選擇的合成文庫法。使用親和色譜選擇的生物文庫法限于肽 文庫，而其它四種途徑適用于肽、非肽寡聚物或化合物小分子文庫(Lam(1997)Anticancer Drug Des. 12 :145_67)。合成分子文庫方法的例子可在本領域技術中找到(DeWitt et al.， Proc Natl Acad Sci USA 1993,90 :6909_13 ；Erb etal.，Proc Natl Acad Sci USA 1994， 91 11422-6 ；Zuckermann et al. , J Med Chem37 :2678_85，1994 ;Cho et al. , Science 1993,261 1303-5 ；Carell et al. , AngewChem Int Ed Engl 1994,33 2059 ；Carell et al. , Angew Chem Int Ed Engl 1994,33 2061 ；Gallop et al.，J Med Chem 1994,37 1233-51)。化合物文庫可提供于溶液中(見 Houghten，Bio/Techniques 1992,13:412-21) 或珠子上(Lam, Naturel991，354 :82_4)、芯片上((Fodor, Nature 1993，364 :555_6)、細菌 上(美國專利5，223，409)、孢子上(美國專利5，571，698 ；5, 403，484和5，223，409)，質粒上 (Cullet al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1992，89 :1865-9)或噬菌體上(Scott and Smith, Science 1990，249 :386_90 ；Devlin, Science 1990，249 404-6 ；Cwirla et al.，ProcNatl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ；Felici, J Mol Biol 1991，222 :301_10 ；美國專利申請 2002103360)。通過本發明任何篩選方法篩選到的化合物的一部分結構通過添加、刪除、和/或 置換方式被轉換而得到的化合物，包括在通過本發明篩選方法鑒定的治療劑之內。此外，當所篩選的測試劑是蛋白質時，為了獲得編碼該蛋白的DNA，可以確定蛋白 的全部氨基酸序列，以此推定編碼蛋白的核酸序列，或者可以分析所得蛋白的部分氨基酸 序列，根據該序列制備寡DNA作為探針，并用該探針篩選cDNA文庫，以獲得編碼該蛋白的 DNA。對所得的DNA進行確認，以其在制備治療或預防癌癥的候選物測試劑中的有用性為 準。可用于本文所述篩選的測試劑還可以是這樣的抗體，它們特異結合PKIB或 NAALADL2蛋白或它們的在體內缺乏原始蛋白生物活性的部分肽。盡管測試劑文庫的構建是本領域眾所周知的，在下文中還是進一步提供了鑒定測 試劑和構建用于本篩選方法的這些治療劑文庫的指導。⑴分子建模
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對具有目標性質的化合物的分子結構和/或對待抑制靶分子即PKIB和NAALADL2 的分子結構的知識為人們構建測試劑文庫提供了便利。預篩選適于進一步評估的受試作用 劑的方法之一，是對受試作用劑與其靶標的相互作用進行計算機建模。計算機建模技術為針對選定分子的三維原子結構的可視化以及會與該分子相互 作用的新化合物的合理設計提供了可能。三維構建典型地依賴于從選定分子的x-射線晶 體分析或NMR成像而來的數據。分子動力學需要力場數據。計算機圖形系統為預測新化合 物如何連接靶分子，以及實驗操作化合物和靶分子的結構以優化結合特異性提供了可能。 為了預測當分子和化合物之一或二者發生細小改變時分子-化合物相互作用是什么樣的， 需要分子力學軟件和計算密集型計算機，它們通常耦聯著分子設計程序和用戶之間的用戶 友好的、菜單驅動的界面。上文一般性描述的分子建模系統的一個實例包括CHARMm和QUANTA程序，Polygen Corporation, ffaltham, Mass。CHARMm執行能量最小化和分子動力學功能。QUANTA執行構 建、圖形建模和分子結構分析。利用QUANTA可進行分子相互行為的互動性構建、修飾、和可 視化分析。有多篇文獻綜述了與特異蛋白相互作用的藥物的計算機建模，例如Rotivinen et al.Acta Pharmaceutica Fennica 1988, 97 :159—66 ;Ripka, NewScientist 1988,54—8; McKinlay&Rossmann,Annu Rev Pharmacol Toxicioll989, 29 111-22 ；Perry&Davies,Prog Clin Biol Res 1989,291 189-93 ；Lewis&Dean, Proc R Soc Lond 1989,236 :125-40, 141-62 ；以及綜述關于核酸組分模型受體的Askew et al.，J Am Chem Soc 1989，111: 1082-90。其它可篩選并圖形描述化學物質的計算機程序可以從例如Mississauga， Ontario, Canada 的 BioDesign, Inc.，Pasadena, Calif.，Allelix, Inc &司、Cambridge, Ontario 的Hypercube，Inc.等公司獲取。見例如 Desjarlais et al. , JMed Chem 1988,31 722-9 ；Meng et al.，J Computer Chem 1992，13 :505_24；Meng et al.，Proteins 1993， 17 266-78 ；Shoichet et al.，Science 1993，259 1445-50 (ii)組合化學合成測試劑的組合文庫可以作為合理藥物設計程序一其涉及有關已知化合物中存在 的核心結構的知識一的一部分生成。該方法允許文庫保持合理的規模，便于高通量篩選。 或者，簡單的、特別是短的聚合物分子文庫，可以通過直接合成構成該文庫的分子家族的所 有排列來加以構建。后一種方法的一個實例是全部由長度為6個氨基酸組成的肽文庫。這 種肽文庫包含每一種6氨基酸序列組合。這種類型的文庫稱作線性組合化學文庫。組合化學文庫的制備是本領域技術人員所熟知的，可以通過化學或生物合成來產 生。組合化學文庫包括，但不僅限于，肽文庫(見例如美國專利5，010，175 ;Furka，Int J Pept Prot Res 1991,37 487-93 ；Houghten et al.，Naturel991，354 :84_6)。也可以使用 其它用于產生化學多樣性文庫的化學。這些化學包括，但不僅限于，肽(例如PCT申請號 W0 91/19735)，被編碼的肽(例如W0 93/20242)，隨機生物寡聚體(例如W0 92/00091)， 苯并二氮卓(benzodiaz印ines)(例如美國專利5，288，514)，diversomer如乙內酰脲、 苯并二氮卓和二肽(DeWitt et al.，Proc Natl Acad Sci USA 1993，90 :6909_13)，插烯 化(vinylogous)多肽(Hagihara et al.，J Amer Chem Soc 1992，114 :6568)，具有葡萄糖骨架(scaffolding)的非肽類肽模擬物(Hirschmann et al.，J Amer ChemSoc 1992， 114 :9217-8)，小化合物文庫的模擬物有機合成(analogous organicsynthese) (Chen et al. , J. Amer Chem Soc 1994，116 :2661)，寡聚氨基甲酸鹽(Cho et al.，Science 1993， 261 :1303)，和 / 或Jj太酰膦酸酯(p印tidylphosphonates) (Campbell et al.，J Org Chem 1994,59:658),核酸文庫(見 Ausubel, CurrentProtocols in Molecular Biology 1995supplement ；Sambrook et al. ,MolecularCloning :A Laboratory Manual,1989,Cold Spring Harbor Laboratory New York, USA)，肽核酸文庫(見例如美國專利 5，539，083)， 抗體文庫(見例如 Vaughan etal.，Nature Biotechnology 1996，14(3) :309_14 禾口 PCT/ US96/10287)，碳水化合物文庫(見例如 Liang et al.，Science 1996,274 1520-22 ； 美國專利5，593，853)，和有機小分子文庫(見例如苯并二氮卓，Gordon EM. Curr Op in Biotechnol. 1995Dec 1 ；6 (6) :624_31 ；類異戊二烯(isoprenoids)，美國專利 5, 569, 588 ； 噻唑烷酮(thiazolidinones)和偏硫雜氮雜環己烷(metathiazanone)，美國專利 5，549，974 ；吡咯烷(pyrrolidines)，美國專利5，525，735和5，519，134 ；嗎啉代化合物，美 國專利5，506，337 ；苯并二氮卓，5，288，514 ；等)。(iii)噬菌體展示另一種手段是使用重組噬菌體來產生文庫。使用“噬菌體方法”(Scott&Smith， Science 1990,249 386-90 ；Cwirla et al. ,Proc Natl Acad Sci USA 1990,87 6378-82 ； Devlin et al. , Science 1990，249 :404_6)，可以構建非常大的文庫(例如106-108個化學 實體)。再一種手段主要使用化學方法，其實例包括Geysen方法(Geysen et al. ,Molecular Immunology 1986,23 709-15 ；Geysen etal.，J Immunologic Method 1987,102:259-74) 和Fodor 等的方法(Science 1991，251 :767_73)。Furka等(14th International Congress of Biochemistry 1988,Volume#5,Abstract FR 013 ；Furka,Int J Peptide Protein Res 1991,37 487-93)，Houghten(美國專利 4，631，211)和 Rutter 等(美國專利 5，010，175) 記載了產生肽混合物的方法，可以將這些肽作為激動劑或拮抗劑加以測試。用于制備組合文庫的設備是可商購的(見例如357MPS，390MPS，Advanced Chem Tech, Louisville KY, Symphony, Rainin, ffoburn, MA,433AApplied Biosystems, Foster City, CA，9050 Plus, Millipore, Bedford, MA)。此外，有多種組合文庫本身也是商業可得 的(見例如 ComGenex, Princeton, N. J. , Tripos, Inc. , St. Louis,M0, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, MD,等等)。PKIB或NAALADL2結合化合物的篩選在本發明中，盡管在正常器官中沒有表達，但在前列腺癌中檢測到了 PKIB或 NAALADL2的過表達(圖1和2)。因此，使用PKIB或NAALADL2基因、由該基因編碼的蛋白 質、或該基因的轉錄調節區，能夠篩選出可改變該基因的表達或改變由該基因編碼的多肽 的生物學活性的化合物。這些化合物可用作治療或預防前列腺癌的藥物。本發明提供了篩選可結合PKIB或NAALADL2的作用劑的方法。因為PKIB和 NAALADL2在前列腺癌中表達，所以與PKIB或NAALADL2結合的作用劑可用于抑制前列腺癌 細胞的增殖，從而可用于治療或預防前列腺癌。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制前列 腺癌細胞增殖的作用劑的方法，以及使用PKIB或NAALADL2多肽篩選可用于治療或預防前 列腺癌的作用劑的方法。具體地，該篩選方法的一個實施方案包括如下步驟
a)使測試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測所述多肽與測試化合物之間的結合活性；和c)選擇可結合所述多肽的測試化合物。本發明的方法在下文將有更詳細的記載。用于篩選的PKIB或NAALADL2多肽可以是重組多肽，或者是來自自然界的蛋白質， 或其部分肽。與測試化合物接觸的多肽可以是，例如，純化的多肽、可溶蛋白質、與載體結合 的形式、或者與其它多肽融合的融合蛋白。作為使用PKIB或NAALADL2多肽來篩選蛋白質，例如與PKIB或NAALADL2多肽結合 的蛋白質的方法，可以使用本領域技術人員周知的許多方法。這樣的篩選可以根據例如免 疫沉淀方法(例如，按照下文[實施例1]中“PKIB與PKA-C間的相互作用”)來進行，具體 地說以如下所述的方式。將基因插入到用于外源基因的表達載體(例如pSV2neo、pcDNAI， pcDNA3. 1，pCAGGS和pCD8)內，在宿主(例如動物)細胞中表達編碼PKIB或NAALADL2多 肽的基因。用于表達的啟動子可以是任何能夠通用的啟動子，包括例如SV40早期啟動子 (Rigby in Williamson (ed. ), Genetic Engineering, vol. 3. Academic Press, London, 83-141(1982))，EF-a 啟動子(Kim et al.，Gene91 :217_23 (1990) )，CAG 啟動子(Niwa et al.，Gene 108 :193(1991))，RSV LTR 啟動子(Cullen，Methods in Enzymology 152 684-704(1987))，SR a 啟動子(Takebe et al.，Mol Cell Biol 8 :466 (1988))，CMV 立 即早期啟動子(Seed andAruffo, Proc Natl Acad Sci USA 84:3365-9(1987))，SV40 晚 期啟動子(Gheysen and Fiers, J Mol Appl Genet 1 :385_94 (1982))，腺病毒晚期啟動 子(Kaufman et al.，Mol Cell Biol 9 =946(1989)), HSV TK 啟動子等。將基因導入到表 達外源基因的宿主細胞內可以根據本領域技術人員眾所周知的任何方法來進行，例如電 穿孔方法(Chu et al.，Nucleic Acids Res 15 :1311-26 (1987))，磷酸鈣方法(Chen and Okayama, Mol Cell Biol 7 :2745_52 (1987))，DEAE 右旋糖酐法(Lopata et al.，Nucleic Acids Res 12:5707-17(1984) ；Sussman andMilman, Mol Cell Biol 4:1641-3(1984))， Lipofectin轉染法(Deri jard B.，Cell76 :1025_37 (1994) ；Lamb et al. ,Nature Genetics 5 22-30(1993) :Rabindran etal.，Science 259 :230_4(1993))等。對于由 PKIB 基因或 NAALADL2基因編碼的多肽，可以把特異性已知的單克隆抗體的識別位點(表位)導入該多 肽的N或C端，從而將該多肽表達為包含該表位的融合蛋白。可以使用商品化的表位_抗體 系統(Experimental Medicine 13 :85_90 (1995))。可商購的載體能夠利用其多克隆位點表 達與例如半乳糖苷酶、麥芽糖結合蛋白、谷胱甘肽S轉移酶和綠色熒光蛋白(GFP)形成 的融合蛋白。另外，也可以使用如下的融合蛋白，其通過導入僅由數個到十余個(a dozen) 氨基酸構成的小型表位加以制備，使融合不會改變PKIB或NAALADL2多肽的性質。可以 使用例如多組氨酸(His-標簽)、流感凝集素HA、人c-myc、FLAG、水泡性口炎病毒糖蛋白 (VSV-GP)、T7基因10蛋白(T7-標簽)、人單純皰疹病毒糖蛋白(HSV-標簽)、E-標簽(多 克隆噬菌體上的表位)等表位，和識別它們的單克隆抗體作為篩選與PKIB或NAALADL2多 肽結合的蛋白質的表位-抗體系統(Experimental Medicine 13:85-90(1995))。在免疫沉淀中，將這些抗體添加到用合適去垢劑制備的細胞裂解物內形成免疫復 合體。免疫復合體由PKIB或NAALADL2多肽、具有與該多肽結合能力的多肽、和抗體組成。 除了使用針對上述表位的抗體之外，還可以使用針對PKIB或NAALADL2多肽的抗體進行免疫沉淀，這樣的抗體的制備如下文所述。免疫復合體可以被沉淀，例如當抗體是小鼠IgG抗 體時，可以通過蛋白A s印harose或蛋白G s印harose將其沉淀。如果將PKIB或NAALADL2 基因編碼的多肽制備成與表位(例如GST)的融合蛋白，則可以使用特異結合這些表位的底 物，例如谷胱甘肽-s印harose 4B,按照與使用針對PKIB或NAALADL2多肽的抗體的相同的 方式來形成免疫復合體。免疫沉淀可以根據下文所述實施，或者例如按照文獻中的方法(Harlowand Lane, Antibodies,511-52,Cold Spring Harbor Laboratory publications,NewYork(1988))實 施。普遍使用SDS-PAGE分析經免疫沉淀的蛋白，使用合適濃度的凝膠，可以利用結合 蛋白的分子量來分析該蛋白。由于與PKIB或NAALADL2多肽結合的蛋白難以通過考馬斯蘭 染色或銀染色等普通染色方法檢測到，可以通過如下的方法提高蛋白的檢測靈敏度在含 有放射性同位素35S-甲硫氨酸或35S-半胱氨酸的培養基中培養細胞，標記細胞中的蛋白，并 檢測該蛋白。當蛋白的分子量已知時，可以直接從SDS-聚丙烯酰胺凝膠上純化出靶蛋白并 測定其序列。作為利用PKIB或NAALADL2多肽來篩選結合該多肽的蛋白的方法，可以使用例如 West-Western 印跡分析法(Skolnik et al.，Cell 65:83-90(1991))。具體地，PKIB 或 NAALADL2多肽結合蛋白可以通過如下方法獲得，從預期表達PKIB或NAALADL2多肽的培養 細胞(例如LNCaP,22Rvl, PC-3DU-145和C4-2B)利用噬菌體載體(例如ZAP)制備cDNA 文庫，在LB瓊脂糖上表達蛋白，將表達出的蛋白固定在膜上，使純化并且標記的PKIB或 NAALADL2多肽與上述膜反應，并依照標記來檢測表達與PKIB或NAALADL2多肽結合的蛋 白的噬菌斑。本發明的多肽可以利用生物素與抗生物素蛋白間的結合，或者利用特異結合 PKIB或NAALADL2多肽或與PKIB或NAALADL2多肽融合的肽或多肽(例如GST)的抗體，來 進行標記。也可以使用利用放射性同位素或熒光等的方法。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系 統(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻見 “Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統中，例如，使本發明的多肽與SRF結合區或GAL4結合區融合，并在酵 母細胞中表達。從預期表達與本發明多肽結合的蛋白的細胞制備cDNA文庫，從而使該文 庫，在被表達時，與VP16或GAL4轉錄激活區融合。然后，將cDNA文庫導入到上述酵母細胞 中，并從檢測到的陽性克隆(當酵母細胞表達可與本發明多肽結合的蛋白時，兩者的結合 可激活報告基因，使陽性克隆可檢測)分離源自該文庫的cDNA。通過將上面分離的cDNA導 入到大腸桿菌中并表達該蛋白，可制備由該cDNA編碼的蛋白。作為報告基因，除了 HIS3基 因之外，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、CAT基因、熒光酶基因等。也可以用親和色譜來篩選與PKIB或NAALADL2基因編碼的多肽結合的化合物。例 如，可以把本發明多肽固定在親和柱的載體上，而將含有能夠結合本發明多肽的蛋白的測 試化合物施加到該柱上。這里的測試化合物可以是例如細胞提取物、細胞裂解物等。在加 載測試化合物之后，沖洗柱子，從而可以制備得到結合于本發明多肽的化合物。當測試化
31合物是蛋白質時，對所得蛋白質的氨基酸序列進行分析，根據該序列合成寡DNA，并用該寡 DNA作為探針篩選cDNA文庫，從而獲得編碼該蛋白的DNA。利用表面等離子體共振現象的生物傳感器可以在本發明中用作檢測或定量結合 化合物的裝置。當使用這種生物傳感器時，可以僅使用微量并且沒有標記的多肽(例如 BIAcore, Pharmacia)，以表面等離子體共振信號的形式對本發明多肽與測試化合物間的相 互作用進行實時的觀察。因此，使用生物傳感器，例如BIAcore，人們就有可能對本發明多肽 與測試化合物間的結合進行評估。用于篩選當固定的PKIB或NAALADL2多肽暴露于合成化合物或天然底物文庫或 隨機噬菌體多肽展示文庫時發生結合的分子的方法，以及使用基于高通量的組合化學技 術(ffrighton et al.，Science 273:458-64(1996) ；Verdine, Nature 384:11-13(1996)； Hogan, Nature 384 :17_9 (1996))，不僅分離與PKIB或NAALADL2蛋白結合的蛋白質，而且分 離與PKIB或NAALADL2蛋白結合化合物(包括激動劑和拮抗劑)的方法，是本領域技術人 員眾所周知的。在優選實施方案中，通過本發明方法選出的測試化合物可以作為候選物，用于進 一步篩選評估其治療作用。篩詵可抑制PKIB或NAALADL2牛物活件的化合物在本發明中，PKIB或NAALADL2蛋白已顯示具有促進前列腺癌細胞增殖的活性(圖 3C，4C和6)。而且，PKIB顯示具有PKA-C細胞核積累活性(圖5D和E)。在本發明中，所謂 PKA-C細胞核積累，意思是抑制PKA-C從細胞核外排或者加速PKA-C轉運進入細胞核。利用 這些生物活性，可以篩選能夠抑制這些蛋白的活性的化合物，該化合物對于治療或預防前 列腺癌有用。因此，本發明還提供了篩選可抑制前列腺癌細胞增殖的化合物的方法，和篩選 治療或預防前列腺癌的化合物的方法。因此，本發明提供了使用PKIB或NAALADL2基因表 達的多肽來篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟a)使測試化合物與由PKIB或NAALADL2的多核苷酸編碼的多肽接觸；b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和c)選擇與不存在測試化合物時所述多肽的生物活性相比，可抑制由PKIB或 NAALADL2多核苷酸編碼的多肽的生物活性的測試化合物。下文將更詳細地記載本發明的方法。任何多肽均可用于篩選，只要它們具有PKIB或NAALADL2蛋白的生物活性即可。例 如，可以使用PKIB或NAALADL2蛋白，也可以使用與這些蛋白功能上等同的多肽。這些多肽 可以由細胞內源或外源表達。而且，這些生物活性包括PKIB或NAALADL2蛋白的細胞增殖 活性或PKIB蛋白的PKA-C細胞核積累活性。通過本篩選分離的化合物是PKIB或NAALADL2基因編碼多肽的拮抗劑的候選物。 術語“拮抗劑”是指可以通過結合多肽而抑制多肽功能的分子。所述術語還指可降低或抑 制編碼PKIB或NAALADL2的基因的表達的分子。而且，通過本篩選分離的化合物是如下化 合物的候選物，所述化合物抑制PKIB或NAALADL2多肽與分子(包括DNA和蛋白)的體內
相互作用。當本方法中要檢測的生物活性是細胞增殖時，可以通過例如如下方法進行檢測 制備表達PKIB或NAALADL2多肽的細胞，在測試化合物的存在下培養細胞，確定細胞增殖速度，測量細胞周期等，以及通過測量集落形成活性，例如圖3C和4C所示。“抑制生物活性” 在本文中定義為，與不存在該化合物時相比，PKIB或NAALADL2的生物活性優選地至少被抑 制10 %，更優選地，至少抑制25 %、50 %或75 %，最優選地，抑制90 %。當待在本方法中檢測的生物活性是PKA-C細胞核積累時，可以通過例如如下方法 進行檢測，即通過制備表達PKIB多肽的細胞，在測試化合物的存在下培養細胞，并使用免 疫細胞化學或western印跡確定細胞核中PKA-C蛋白的量，例如圖5D和E所示。“抑制生物 活性”在此處定義為，與不存在該化合物時相比，PKIB的生物活性優選地至少被抑制10%， 更優選地，至少抑制25 %、50 %或75 %，最優選的，被抑制90 %。在優選實施方案中，通過本發明方法篩選的測試化合物可以作為候選物，進行進 一步篩選評估其治療作用。篩詵可改變PKIB或NAALADL2表汰的化合物在本發明中，已顯示利用siRNA降低PKIB或NAALADL2的表達可以抑制癌細胞增 殖(圖3、4)。因此，本發明提供了用于篩選可抑制PKIB或NAALADL2表達的作用劑的方法。 抑制PKIB或NAALADL2表達的作用劑可用于抑制前列腺癌細胞的增殖，因此可用于治療或 預防前列腺癌。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制前列腺癌細胞增殖的作用劑的方法， 以及篩選可用于治療或預防前列腺癌的作用劑的方法。在本發明的內容中，該篩選可以包 括例如如下步驟a)使侯選化合物與表達PKIB或NAALADL2的細胞接觸；和b)選擇與對照相比降低PKIB或NAALADL2的表達水平的候選化合物。
本發明的方法在下文將有更詳細的記載。表達PKIB或NAALADL2的細胞包括，例如，從前列腺癌建立的細胞系；這些細胞可 用于上文所述的本發明的篩選(例如LNCaP、22Rvl、PC-3、DU-145和C4-2B)。表達水平可以 通過本領域技術人員眾所周知的方法進行評估，例如RT-PCR、Northern印跡測定、Western 印跡測定、免疫染色和流式細胞術分析。“表達水平降低”在本文中定義為，與不存在該化 合物時相比，PKIB或NAALADL2的表達水平優選地被降低至少10%，更優選地，至水平少降 低25%、50%或75%，最優選地，水平降低95%。本文的化合物包括化學化合物(chemical compound)、雙鏈核苷酸等。雙鏈核苷酸的制備如前述的記載。在篩選方法中，降低PKIB或 NAALADL2表達水平的化合物可以被選擇來作為用于治療或預防前列腺癌的候選作用劑。或者，本發明的篩選方法可包括如下步驟a)使侯選化合物與導入了如下載體的細胞接觸，該載體包括PKIB或NAALADL2的 轉錄調節區和在該轉錄調節區控制下表達的報告基因；b)測量所述報告基因的表達或活性；和c)選擇可降低所述報告基因表達或活性的候選化合物。合適的報告基因和宿主細胞是本領域眾所周知的。例如，報告基因是熒光素酶、綠 色熒光蛋白(GFP)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)紅色熒光蛋白(DsRed)、氯霉素乙酰轉移酶 (CAT)、lacZ和葡糖苷酸酶(⑶S)，而宿主細胞是C0S7、HEK293、HeLa等。篩選所需的報 告構建體可以通過使報告基因序列與PKIB或NAALADL2的轉錄調節區相連接來加以制備。 這里，PKIB或NAALADL2的轉錄調節區是從起始密碼子到上游至少500bp的區域，優選地是 到上游1000bp，更優選地是到上游5000或10000bp的區域。含有轉錄調節區的核苷酸區段可以從基因組文庫分離，或者可以通過PCR擴增。用于鑒定轉錄調節區的方法以及測定 規程是眾所周知的(Molecular Cloningthird edition chapter 17，2001，Cold Springs Harbor Laboratory Press) 0將含有所述報告構建體的載體轉染到宿主細胞，并通過本領 域眾所周知的方法(例如使用照度計(luminometer)、吸收光譜儀、流式細胞儀等)檢測報 告基因的表達或活性。“表達或活性降低”在本文中定義為，與不存在該化合物時相比，報告 基因的表達或活性優選地被降低至少10%，更優選地，至少降低25%、50%或75%，最優選 地，降低95%。在優選實施方案中，通過本發明方法選出的測試化合物可以作為候選物，用于進 一步篩選以評估其治療作用。篩詵降低PKIB和PKA-C間結合的化合物在本發明中，PKIB與PKA-C間的相互作用通過免疫沉淀顯示(圖5C)。而且，PKA-C 在沒有PKIB時從細胞核外排到細胞質中(圖5D)。本發明提供了用于篩選可抑制PKIB和 PKA-C間結合的化合物的方法。可抑制PKIB和PKA-C間結合的化合物可用于抑制前列腺癌 細胞的增殖，從而可用于治療或預防前列腺癌。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制前列 腺癌細胞增殖的化合物的方法，和用于篩選可用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法。更具體地，該方法包括如下步驟a)在測試化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等價物與PKA-C多肽或其功能等 價物接觸；b)檢測多肽間的結合；和c)選擇可抑制多肽間結合的測試化合物。這里，"PKIB多肽的功能等價物”是指包含PKA-C結合域氨基酸序列；假底物基序 (RRNA :SEQ ID NO 31)的多肽。類似地，“PKA-C多肽的功能等價物”是指包含PKIB結合域 氨基酸序列的多肽。本發明的方法將在下文有更詳細的記載。作為篩選可抑制PKIB和PKA-C間結合的化合物的方法，可以使用本領域技術人 員眾所周知的許多方法。這些篩選可以作為體外測定系統來實施。更具體地說，首先，使 PKIB或PKA-C多肽與支持物結合，將另一多肽與測試化合物一起施加。接著，溫育混合物， 清洗，并檢測和/或測量與支持物結合的另一多肽。潛在的候選化合物能夠降低另一多肽 的檢測量(reduce the amount of detecting the other polypeptide)。這里，PKIB 或 PKA-C多肽不僅可以制備成天然蛋白質，還可以作為通過基因重組技術制備的重組蛋白加 以制備。天然蛋白可以通過例如親和色譜制備。另一方面，重組蛋白的制備可以通過培養 用編碼PKA-C的DNA轉化的從而在其中表達該蛋白的細胞，然后回收該重組蛋白。可用于結合蛋白的支持物的實例包括不溶性多糖，例如瓊脂糖、纖維素和右旋糖 酐；和合成樹脂，例如聚丙烯酰胺、聚苯乙烯和硅橡膠(silicon)；優選地，使用由上述材料 制備的可商購的珠子和板(例如多孔板、生物傳感器芯片等)。當使用珠子時，可以將它們 填充到柱中。或者，磁珠的使用也是本領域已知的，借助磁珠能夠容易地通過磁性分離珠子 上結合的蛋白。蛋白與支持物的結合可以根據常規方法進行，例如化學鍵合和物理吸附。或者，蛋 白可以通過特異識別該蛋白的抗體與支持物結合。而且，蛋白與支持物的結合也可以通過
34抗生物素蛋白和生物素進行。蛋白間的結合在緩沖液中進行，緩沖液例如但不僅限于，磷酸 鹽緩沖液和Tris緩沖液，只要該緩沖液不抑制蛋白間的結合即可。在本發明中，利用表面等離子體共振現象的生物傳感器可用作檢測或定量結合蛋 白的裝置。當使用這種生物傳感器時，蛋白間的相互作用可以作為表面等離子體共振信號 得以實時地觀察，僅使用微量的多肽，并且無需標記(例如BIAcore，Pharmacia)。因此，使 用生物傳感器例如BIAcore來評估PKA-C和PKIB間的結合是有可能的。或者，可以標記PKA-C或PKIB，利用多肽的標記來檢測或測量結合活性。具體地， 預標記其中一個多肽，然后使標記的多肽在測試化合物的存在下與另一多肽接觸，經過清 洗后，根據標記檢測或測量結合的多肽。可用于在本發明中標記蛋白的標記物質有例如放 射性同位素(例如3H、14C、32P、33P、35S、125I、131I)、酶(例如堿性磷酸酶、辣根過氧化物 酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶)、熒光底物(例如異硫氰酸熒光素(FITC)、若丹明) 和生物素/抗生物素蛋白。當用放射性同位素標記蛋白時，可以借助液體閃爍進行檢測或 測量。或者，對于用酶標記的蛋白，可以添加酶的底物，使用吸收測定儀檢測底物的變化，例 如顏色的產生，來檢測或測量。此外，當使用熒光底物作為標記時，用熒光光度計檢測或測 量結合蛋白。而且，PKA-C和PKIB間的結合還可以用針對PKA-C或PKIB的抗體進行檢測或測 量。例如，使固定在支持物上的PKA-C多肽與測試化合物和PKIB接觸，然后溫育并清洗混 合物，然后可以用針對PKIB的抗體進行檢測或測量。或者，可以將PKIB固定在支持物上， 而使用針對PKA-C的抗體作為抗體。當在本篩選中使用抗體時，抗體優選地用上述標記物 質的其中一種加以標記，并根據標記物質進行檢測和測量。或者，可以用針對PKA-C或PKIB 的抗體作為第一抗體，用標記底物標記的第二抗體進行檢測。而且，在本發明篩選中與蛋白 結合的抗體可以用蛋白G或蛋白A柱進行檢測或測量。或者，在本發明篩選方法的另一個實施方案中，可以使用利用細胞的雙雜交系 統(“MATCHMAKER Two-Hybrid system”，“MammalianMATCHMAKER Two-Hybrid Assay Kit", "MATCHMAKER one-Hybridsystem" (Clontech) ；"HybriZAP Two-Hybrid Vector System”(Stratagene)；參考文獻見 “Dalton and Treisman, Cell 68:597-612(1992)”， "Fields and Sternglanz，Trends Genet 10:286-92(1994)，，)。在雙雜交系統中，例如，使PKA-C多肽與SRF結合區或GAL4結合區融合，并在酵母 細胞中表達。使能結合PKA-C多肽的PKIB多肽與VP16或GAL4轉錄激活區融合，在測試化 合物的存在下，也在酵母細胞中表達。或者，可以使PKIB多肽和SRF結合區或GAL4結合區 融合，而使PKA-C多肽與VP16或GAL4轉錄激活區融合。兩者的結合可激活報告基因，使陽 性克隆可檢測。作為報告基因，除了 HIS3基因之夕卜，還可以使用例如Ade2基因、lacZ基因、 CAT基因、熒光素酶基因等。而且，本發明的篩選方法是檢測PKA-C的細胞核定位，因為PKA-C在PKIB的存在 下定位于細胞核，而在沒有PKIB時定位于細胞質。例如，使表達PKA-C和PKIB的細胞均與 測試化合物接觸并清洗。細胞用例如70%乙醇或4%多聚甲醛固定，并用抗PKA-C抗體檢 測。當PKA-C基本上在細胞質內被檢測到時，使用測試化合物預防前列腺癌。這里，可通過 本領域眾所周知的方法在細胞中強制表達(force-expressed)PKA-C和PKIB。因此，使表 達PKA-C和PKIB細胞均與測試化合物接觸，并通過眾所周知的方法制備細胞的細胞核提取物(例如使用 Merck Bioscience 生產的 SubcellularProteoExtract Kit(S-PEK))。用 western印跡測定檢測細胞核提取物中PKA-C的量。在優選實施方案中，通過本發明方法選出的測試化合物可以作為候選物，用于進 一步評價其治療作用。也就是說，上述篩選方法還包括如下步驟d)使步驟c)選出的侯選化合物與表達PKIB和PKA-C的細胞接觸；和e)選擇與不存在該侯選化合物時檢測到的表達水平相比，可降低Akt磷酸化水平 的侯選化合物。可以使用本領域技術人員眾所周知的Akt磷酸化檢測方法。例如，可以使用在下 文實施例部分記載的western印跡分析。更具體地，在473位絲氨酸殘基處檢測Akt (SEQ ID NO 35)的磷酸化水平。篩詵可通過抑制PKIB功能降低Akt磷酸化的化合物在本發明中，Akt磷酸化被PKIB siRNA降低(圖7A)。而且，Akt磷酸化被PKIB和 /或PKA-C的過表達所提高(圖7B和C)。本發明提供了篩選可抑制PKIB和PKA-C間結合 的化合物的方法。Akt磷酸化很可能在HRPC進展和其惡性表型中發揮關鍵作用(Sellers， ff. R. &Sawyers, C. L. (2002)inSomatic Genetics of Prostate Cancer Oncogenes and Tumor Suppressors ed. Kantoff,P. (Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia),Wang Y,Kreisberg JI,Ghosh PM. ,Curr Cancer Drug Targets. 2007Sep ；7(6) :591_604,Lin HK, Yeh S，Kang HY,Chang C,Proc Natl Acad Sci U S A 2001 ；98 (13) :7200-5，Feldman BJ, Feldman D, Nat Rev Cancer 2001 ；1(1) 34-45, Malik SN,Brattain M, Ghosh PM,Troyer DA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI.，Clin Cancer Res. 2002 ；8 (4) :1168_71)，因此 我們預期，可通過抑制PKIB功能而降低Akt磷酸化的化合物可以抑制前列腺癌細胞的增 殖，從而可用于治療或預防前列腺癌。因此，本發明還提供了用于篩選可抑制前列腺癌細胞 增殖的化合物的方法，和用于篩選可用于治療或預防前列腺癌，優選地HRPC，的化合物的方 法。更具體地說，本發明包括如下步驟a)使候選化合物與表達PKIB和PKA-C的細胞接觸；和b)選擇與不存在該侯選化合物時檢測到的表達水平相比，可降低Akt磷酸化水平 的候選化合物。或者，通過本發明可以鑒定適于治療和/或預防前列腺癌的侯選化合物。這樣的 方法包括如下步驟a)在測試化合物的存在下，在適于PKIB磷酸化Akt的條件下，將PKIB或其功能等 價物與Akt與PKA-C或其功能等價物一起溫育，其中Akt是從下組中選出的多肽i.包含氨基酸序列SEQ ID NO 35 (Akt)的多肽；ii.包含氨基酸序列SEQ ID NO 35且其中替換、刪除或插入了一個或多個氨基酸 的多肽，其中所述多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO :35組成的多肽等價的生物活性；iii.由在嚴格條件下與由核苷酸序列SEQ ID NO :36組成的多核苷酸雜交的多核 苷酸所編碼的多肽，其中該多肽具有與由氨基酸序列SEQ ID NO :35組成的多肽等價的生物 活性；b)檢測Akt的磷酸化水平；
c)比較在步驟b)中測得的Akt磷酸化水平與對照水平；和d)選擇與對照水平相比，可降低Akt磷酸化水平的化合物。在優選實施方案中，通過本發明方法選出的測試化合物可以作為候選物，用于進 一步篩選評價其治療作用。優選地，Akt的磷酸化水平可以在氨基酸序列SEQ ID NO 35的473位絲氨酸殘基 或該多肽的同源位置進行檢測。可以使用本領域技術人員周知的Akt磷酸化檢測方法。例 如，可以使用在下文實施例部分記載的western印跡分析。在本發明的語境中，適于PKIB磷酸化Akt的條件可以通過在磷酸供體例如ATP的 存在下溫育Akt和PKIB及PKA-C來提供。適于PKIB磷酸化Akt的條件還包括培養表達 PKIB、PKA-C和多肽的細胞。例如，所述細胞可以是攜帶有包含編碼該多肽的多核苷酸的表 達載體的轉化細胞。在溫育之后，可以用識別磷酸化Akt的抗體檢測Akt的磷酸化水平。在檢測磷酸化Akt之前，可以將Akt與其它成分或Akt表達細胞的細胞裂解物分 離。例如，可利用凝膠電泳將Akt與其余組分分離。或者，可以通過使Akt與具有抗Akt抗 體的載體接觸來捕獲Akt。當使用標記的磷酸供體時，可以通過追蹤該標記來檢測Akt的 磷酸化水平。例如，當放射性標記的ATP (例如32P-ATP)用作磷酸供體時，分離的Akt的放 射活性與Akt的磷酸化水平相關。或者，可以使用特異識別磷酸化Akt而不識別非磷酸化 Akt的抗體來檢測磷酸化Akt。優選地，所述抗體識別在Ser-473殘基處磷酸化的Akt。用于制備與給定蛋白功能上等價的多肽的方法是本領域技術人員眾所周知的，包 括在蛋白中導入突變的已知方法。一般地說，已知蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不 會影響蛋白的功能(Mark DF et al. , Proc Natl AcadSci USA 1984,81 5662-6 ；Zoller MJ&Smith M,Nucleic Acids Res 1982，10 :6487_500 ；Wang A et al.，Science 1984，224 1431-3 ；Dalbadie-McFarland G etal. ,Proc Natl Acad Sci USA 1982,79:6409-13)。實 際上，突變的或經過修飾的蛋白，具有通過在特定氨基酸序列中替換、刪除、插入和/或添 加一個或多個氨基酸殘基進行修飾的氨基酸序列的蛋白，已知可以保留原始的生物活性 (Mark et al. ， Proc Natl Acad Sci USA 81 5662-6 (1984) ；Zoller and Smith, Nucleic Acids Res 10 6487-500(1982) ；Dalbadie-McFarland et al. , Proc NatlAcad Sci USA 79:6409-13(1982))。由此，本領域的技術人員將會理解，對氨基酸序列進行個別添加、 刪除、插入或替換以改變單個氨基酸或少數氨基酸，或者被認為是“保守修飾”的那些修 飾一其中蛋白質的改變的結果是產生具有相似功能的蛋白，這些都是本發明所預期的。例如，本領域的技術人員能夠通過在Akt、PKA_C或PKIB中的任一個內導入合適的 突變來制備與這些蛋白功能上等價的多肽，例如使用定點誘變(Hashimoto-Gotoh et al., Gene 152:271-5(1995) ；Zoller and Smith,MethodsEnzymol 100:468-500(1983) ；Kramer et al. , Nucleic Acids Res. 12 :9441_56(1984) ；Kramer and Fritz, Methods Enzymol 154:350-67(1987) ；Kunkel, ProcNatl Acad Sci USA 82:488-92(1985) ；Kunkel TA, et al.，Methods Enzymol. 1991 ；204 :125_39.)。本發明的多肽包括這樣的多肽，其具有Akt、 PKA-C或PKIB的氨基酸序列，且其中一個或多個氨基酸被突變，其中所得的突變多肽分別 與Akt、PKA-C或PKIB的功能等價。只要保留蛋白的活性，氨基酸突變的數目沒有具體限 制。然而，一般優選地改變氨基酸序列的5%或者更少。因此，在優選實施方案中，在這樣的 變體中要突變的氨基酸的數目一般為30個氨基酸或者更少，典型地20個氨基酸或者更少，更典型地10個氨基酸或者更少，優選地5-6個氨基酸或者更少，更優選地1-3個氨基酸。要突變的氨基酸殘基優選地被突變成氨基酸側鏈性質保守的不同氨基酸(這個 過程稱作保守氨基酸替換)。氨基酸側鏈的性質的實例包括疏水氨基酸(A，I，L，M，F，P，W， Y, V)，親水氨基酸(R，D，N, C，E，Q，G，H，K，S，T)，和具有如下共同官能團或特征的側鏈月旨 肪族側鏈(G，A，V，L，I，P)；含羥基側鏈(S，T，Y)；含硫原子側鏈(C，M)；含羧酸和酰胺側鏈 (D，N, E，Q)；含堿側鏈(R，K，H)；和含芳香基側鏈(H，F，Y，W)。注意，圓括號內的字母指示 氨基酸的單字母編碼。而且，提供功能相似氨基酸的保守替換表是本領域眾所周知的。例 如，下面8組中每一組含有的氨基酸彼此之間是保守替換1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，賴氨酸(K)；5)異亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，纈氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)絲氨酸(S)，蘇氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(見例如 Creighton，Proteins 1984) 這樣的保守修飾的多肽包含在本Akt、PKA_C或PKIB蛋白內。然而，本發明不僅限 于此，Akt、PKA-C和PKIB蛋白包含非保守修飾，只要保留原始蛋白的結合活性即可。而且， 修飾蛋白不排除多態變異體、種間同源物和由這些蛋白的等位基因編碼的蛋白。向Akt、PKA-C或PKIB氨基酸序列添加了一個或多個氨基酸殘基的多肽的實例是 分別含有Akt、PKA-C或PKIB的融合蛋白。因此，本發明包括Akt、PKA-C或PKIB與其它肽 或蛋白的融合蛋白，也就是融合物。融合蛋白可以通過本領域技術人員眾所周知的技術加 以制備，例如使編碼Akt、PKA-C或PKIB的DNA與編碼其它肽或蛋白的DNA相連，并使閱讀 框匹配，將融合DNA插入到表達載體內，并在宿主中表達它。與本發明蛋白融合的肽或蛋白 沒有限制。可用作與Akt、PKA_C或PKIB蛋白融合的肽的已知肽包括，例如，FLAG(Hopp TP et al.，Biotechnology 19886 1204-10)，含 6 個 His (組氨酸)殘基的 6xHis，lOxHis，流感凝 集素(HA)，人c-myc片段，VSP-GP片段，pl8HIV片段，T7-標簽，HSV-標簽，E-標簽，SV40T 抗原片段，lck標簽，a -微管蛋白片段，B-標簽，蛋白C片段等。可以和本發明蛋白融合的 蛋白的實例包括GST(谷胱甘肽-S轉移酶)、流感凝集素(HA)、免疫球蛋白恒定區、半 乳糖苷酶、MBP (麥芽糖結合蛋白)等。融合蛋白的制備可以通過使編碼上面討論的融合肽或蛋白的商業可得DNA與編 碼Akt、PKA-C或PKIB蛋白的DNA融合，并表達所制備的融合DNA。另一種本領域已知可分離功能等價多肽的方法涉及，例如，雜交技術(Sambrook et al. ,Molecular Cloning 2nd ed. 9. 47-9. 58,Cold Spring Harbor Lab. Press(1989))。 本領域的技術人員能夠容易地從分離的DNA分離與Akt (即SEQ ID NO 36) .PKA-C或PKIB 具有高同源性的DNA，并從所述分離的DNA分離出與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價的多肽。 本發明的蛋白包括由與編碼Akt、PKA-C或PKIB的DNA序列的全部或一部分雜交的DNA編 碼，并且與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價的蛋白。這些多肽包括對應于人源蛋白的哺乳動CN 物同源體(例如由猴、大鼠、家兔和牛基因編碼的多肽)。在從動物分離與編碼Akt、PKA_C 或PKIB的DNA高度同源的DNA時，特別優選地使用前列腺癌組織。用于分離編碼與人Akt、PKA-C或PKIB蛋白功能上等價的蛋白的DNA的雜交條件 可以由本領域技術人員常規地加以選擇。術語“嚴格(雜交)條件”是指這樣的條件，在 該條件下核酸分子與其靶序列雜交，典型地在核酸復合體混合物中，但檢測不到與其它序 列雜交。嚴格條件是序列依賴的，并且在不同環境下會不同。序列越長，特異雜交的溫度 越高。Tijssen，Techniquesin Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes, "Overview of principles of hybridization and the strategy Of nucleic acid assays" (1993)提供了關于核酸雜交的詳細指導。在本發明的語境中， 合適的雜交條件可以由本領域的技術人員常規地加以選擇。一般地說，嚴格條件被選擇為在限定的離子強度pH下，比特定序列的熔點(TJ低 大約5-10°C。Tffl是如下的溫度(在限定的離子強度、pH和核酸濃度下)，其中50%的與靶分 子互補的探針在平衡狀態下與靶序列雜交(因為靶序列過量存在，所以在Tm下，在平衡時 50%的探針被占據)。嚴格條件還可以通過添加去穩定劑(例如甲酰胺)來實現。為了選 擇性或特異性的雜交，陽性信號優選地至少是背景的兩倍，更優選地是背景雜交的10倍。示例性的嚴格雜交條件包括如下50%甲酰胺、5x SSC、和SDS，在42°C溫育， 或5x SSC、1% SDS、在65°C溫育，用0. 2x SSC和0. 1 % SDS在50°C下清洗。合適的雜交條 件還可以包括使用“快速雜交緩沖液(Rapid-hyb buffer) " (Amersham LIFE SCIENCE)在 68°C預雜交30分鐘或者更長時間，添加標記的探針，在68°C溫育lh或更長時間。清洗步驟可以在例如低嚴格條件下進行。因此，示例性的低嚴格條件可以包括例 如42°C、2x SSC、0. 1% SDS、或優選地50°C、2x SSC、0. 1% SDS。或者，示例性的高嚴格條件 包括例如在室溫下用2x SSC、0. 01% SDS清洗三次各20分鐘，然后在37°C用lx SSC、0. 1% SDS清洗三次各20分鐘，和在50°C下用lx SSC、0. 1% SDS清洗兩次各20分鐘。然而，多種 因素，例如溫度和鹽濃度，會影響雜交的嚴格度，本領域的技術人員能夠合適地選擇可實現 所需嚴格度的因素。優選地，功能上等價多肽的氨基酸序列與本文公開的天然Akt、PKA_C或PKIB序列 具有至少大約80%的同源性(也稱作序列同一性)，更優選地，至少大約85%、90%、95%、 96%、97%、98%、或99%同源性。多肽的同源性可以通過如下文獻中的算法加以確定 "Wilbur and Lipman，Proc Natl Acad Sci USA 80 :726_30 (1983) ”。在其它實施方案中，功 能上等價多肽可以由在嚴格條件下(如下文定義)與編碼這種功能上等價多肽的多核苷酸 雜交的多核苷酸編碼。除了雜交，可以使用基因擴增方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法，使用根據 Akt或PKIB的序列信息合成的引物分離編碼與Akt、PKA-C或PKIB功能上等價的多肽的 DNA。可用于本發明語境下的Akt、PKA-C或PKIB功能上等價物在氨基酸序列、分子量、 等電點、是否存在糖鏈或形式方面可以有不同，這取決于用于產生它的細胞或宿主或者所 使用的純化方法。然而，只要它是Akt、PKA-C或PKIB多肽的功能上等價物，就包含在本發 明的范圍內。篩選與NAALADL2結合的抗體
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NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。著名的 前列腺癌標記一前列腺特異膜抗原(PSMA)，也屬于GCPII家族(Rajasekaran AK et al.， Am J Physiol Cell Physiol 2005288 :C975_81.禾口Murphy GP et al. ,Prostate 200042 145-9.)。NAALADL2顯示與PSMA同源，具有一個跨膜區，并定位在細胞質膜上(圖5B)。 PSMA是一種FDA批準的前列腺癌顯像劑一mIn標記的7E11單克隆抗體(Prostascint， Cytogen, Princeton, NJ)的靶標，而且PSMA被單克隆抗體如J591靶定，J591在接受臨 床試驗，用于將顯像劑或治療劑特異遞送到PSMA表達細胞(Murphy GP etal.，Prostate 200042 145-9.和 Holmes EH, Expert Op in Investig Drugs 200110 :511_9.)。因此，利用 NAALADL2在細胞表面的結合能力作為指征進行篩選，可以鑒定用于診斷或預防前列腺癌的 抗NAALADL2抗體。該篩選方法的一個實施方案包括如下步驟a)使候選抗體與表達NAALADL2的細胞接觸；b)選擇可結合細胞表面上的NAALADL2的測試抗體。本發明的方法在下文將有更詳細的記載。或者，NAALADL2的推定胞外域是SEQ ID NO :32。因此，篩選在細胞外與NAALADL2 結合的抗體的方法包括如下步驟a)使候選抗體與包含SEQ ID NO 32的多肽接觸；b)選擇與該多肽結合的測試抗體。通過檢測NAALADL2表達細胞(例如前列腺癌細胞)的親和性來選擇抗體或抗體 片段或非抗體結合蛋白(在下文中描述)。通過用含有3%BSA的PBS在室溫下處理30分 鐘，封閉與這些細胞的非特異結合。將細胞在室溫下與候選抗體或抗體片段溫育60分鐘。 用PBS清洗后，細胞在室溫下用FITC偶聯的第二抗體染色60分鐘，并用熒光計進行檢測。 或者，可以使用利用表面等離子體共振現象的生物傳感器作為檢測或定量本發明中抗體或 抗體片段的裝置。在本發明中，選擇能夠檢測細胞表面上的NAALADL2肽的抗體或抗體片 段。在優選實施方案中，通過本發明方法選出的測試化合物可以作為候選物，用于進 一步篩選評估其治療作用。抗體 如本文所使用的，術語“抗體”意圖包括可以和指定蛋白或其片段特異反應的免疫 球蛋白或其片段。抗體可以包括人抗體、靈長源化(primatized)抗體、嵌合抗體、雙特異 性抗體、人源化抗體、與其它蛋白或放射性標記融合的抗體和抗體片段。而且，本文中，抗體 使用其最廣泛的意義，具體地涵蓋完整單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩個完整抗體形成 的多特異性抗體(例如雙特異性抗體)和抗體片段，只要它們顯示期望的生物學活性即可。 “抗體”指示所有類型(例如IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。本發明使用針對PKIB或NAALADL2的抗體。更優選地說，可以使用針對包含氨基 酸序列SEQ ID NO :33或34的蛋白的抗體作為針對PKIB的抗體，并且可以使用針對包含氨 基酸序列SEQ ID N0:32的蛋白的抗體作為針對NAALADL2的抗體。這些抗體將通過已知的 方法提供。本文描述了用于產生根據本發明使用的抗體的示例技術。(i)多克隆抗體單克隆抗體優選地通過多次皮下(sc)或腹膜內(ip)注射相關抗原和佐劑在動物體內產生。可以使用雙功能或衍生化試劑將相關抗原與在待免疫物種體內具有免疫原性的 蛋白相偶聯，所述具有免疫原性的蛋白例如鑰孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或 大豆胰蛋白酶抑制劑，雙功能或衍生試劑例如馬來酰亞胺苯甲酸硫代丁二酰亞胺酯(malei midobenzoylsulfosuccinimide ester)(通過半胱氨酸殘基偶聯)、N_羥基琥珀酰亞胺(通 過賴氨酸殘基)、戊二醛、琥珀酸酐、S0C12或R' N = C = NR，其中R和R’是不同的烷基。用該抗原、免疫原性偶聯物或衍生物免疫動物是通過，例如，組合100 ii g或5 ii g 蛋白或偶聯物(分別用于家兔或小鼠)與3倍體積的弗氏完全佐劑，并在皮內多點注射該 溶液。一個月后，用1/5-1/10原始量的肽或偶聯物與弗氏完全佐劑多點皮下注射來對動物 加強免疫。7-14天后，對動物進行采血，并測定血清的抗體滴度。加強免疫動物，直至滴度 達到高平臺。優選地是，用于對動物進行加強免疫的是相同抗原的偶聯物，但與不同的蛋白 偶聯和/或通過不同的交聯劑偶聯。偶聯物還可以在重組細胞培養物中作為蛋白融合物制備。另外，可以適當地使用 凝集劑，例如明礬，來提高免疫響應。(ii)單克隆抗體單克隆抗體從基本上均質的抗體構成的群體獲得，即構成該群體的單個抗體是 相同的，只是可能存在少量的天然發生的突變。因此，修飾語“單克隆”是指抗體不是離散 (discrete)抗體的混合物這一特征。例如，單克隆抗體可以用雜交瘤方法制備，該方法首先在Kohler et al. ,Nature, 256:495(1975)中被記載，或者可以通過重組DNA方法制備(U. S. Patent No. 4，816，567)。在雜交瘤方法中，小鼠或其它合適的宿主動物，例如倉鼠，被如上文所述地免疫， 從而引發出淋巴細胞，這些淋巴細胞產生或者能夠產生特異結合用來進行免疫的蛋白的抗 體。或者，可以在體外免疫淋巴細胞。然后，用合適的融合劑，例如聚乙二醇，使淋巴細胞 與骨髓瘤細胞融合，形成雜交瘤細胞(Goding，Monoclonal Antibodies principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press,1986))。將這樣制備的雜交瘤細胞接種并生長于合適的培養基中，其優選地含有一種或多 種可抑制未融合的母骨髓瘤細胞生長或存活的物質。例如，如果母骨髓瘤細胞缺乏次黃嘌 呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT或HRPT)，則用于雜交瘤的培養基典型地可包含次黃嘌呤、氨甲 喋呤和胸苷(HAT培養基)，這些物質可阻止HGPRT缺陷細胞的生長。優選的骨髓瘤細胞具有如下特征融合效率高，支持所選抗體產生細胞穩定高水 平產生抗體，并且對某種培養基例如HAT培養基敏感。其中，優選的骨髓瘤細胞系是鼠骨髓 瘤細胞系，例如從可以從Salk研究所細胞配送中心(Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego), California USA 獲得的 M0PC-21 和 MPC-11 小鼠腫瘤和可以從美國 HMJtlf^f^^^^ (American Type Culture Collection), Manassas, Virginia, USA ^t 得的SP-2或X63-Ag8-653細胞衍生的細胞系。人骨髓瘤和小鼠_人異源骨髓瘤細胞系也 有報道用于產生人單克隆抗體(Kozbor，J. Immunol.，133 3001(1984) ；Brodeur et al.， Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc.，New York,1987))。對培養著雜交瘤細胞的培養基，測定其中針對抗原的單克隆抗體的產生。優選地， 由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性通過免疫沉淀或通過體外結合試驗加以確定，例如放射免疫試驗(RIA)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。單克隆抗體的結合親和性可以通過例如Munson et al.，Anal. Biochem.，107 220(1980)的30Scatchard分析加以確定。在鑒定出可產生具有期望特異性、親和性和/或活性的抗體的雜交瘤細胞之 后，可以通過有限稀釋程序對克隆進行亞克隆，并通過常規方法來培育它們(Goding， Monoclonal Antibodies Principles and Practice,pp. 59-103(Academic Press,1986))。 用于此目的的合適培養基包括例如D-MEM或RPML-1640培養基。此外，雜交瘤細胞可以在 體內作為動物體內的腹水瘤培育。通過常規的免疫球蛋白純化程序，例如蛋白A-s印harose凝膠、羥基磷灰石色譜、 凝膠電泳、透析或親和色譜，合適地將由亞克隆分泌的單克隆抗體與培養基、腹水液或血清 分離。編碼單克隆抗體的DNA可以用傳統方法(例如通過使用能夠特異結合編碼鼠源抗 體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)容易地加以分離和測序。雜交瘤細胞是這類DNA的 優選來源。一旦分離了 DNA，即可將DNA置于表達載體內，然后將其轉染進入宿主細胞，例如 大腸桿菌細胞、猿COS細胞、中華倉鼠卵巢(CH0)細胞，或骨髓瘤細胞，這些細胞本身不會產 生免疫球蛋白，從而在重組宿主細胞內合成單克隆抗體。關于在細菌體內重組表達編碼抗 體的 DNA 的綜述文獻見 Skerra et al.，Curr. Opinion in Immunol.，5 :256_262 (1993)和 Pluckthun, Immunol. Revs.，130 :151—188(1992)。另一種產生與PKIB或NAALADL2特異反應的抗體或抗體片段的方法，是用PKIB或 NAALADL2蛋白或肽對在細菌體內表達的、編碼免疫球蛋白基因或其部分的表達文庫進行篩 選。更優選地，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID NO :33或34的PKIB片段作為PKIB的替 代物，可以使用包含氨基酸序列SEQ ID N0:32的NAALADL2片段作為NAALADL2的替代物。 例如，可以用噬菌體表達文庫，在細菌內表達完整的Fab片段、VH區和Fv區。見例如Ward et al. , Nature 341:544-546(1989) ；Huse et al.，Science 246 1275-1281(1989)；和 McCafferty et al.，Nature 348 :552_554 (1990)。用例如 PKIB肽、包含氨基酸序列 SEQ ID NO 33或34的PKIB片段、NAALADL2肽或包含氨基酸序列SEQ ID NO 32的NAALADL2片段 篩選這些文庫，能夠鑒定出與PKIB、PKIB片段、NAALADL2或NAALADL2片段反應的免疫球蛋 白片段。或者，可以使用SCID-hu小鼠(可以從Genpharm獲得)產生抗體或其片段。在進一步的實施方案中，抗體或抗體片段可以從抗體噬菌體文庫分離，抗體噬菌 體文庫用 McCafferty et al. , Nature, 348 :552_554 (1990)中記載的技術來產生。Clackson et al. ， Nature,352 :624_628(1991)和 Marks et al. ， J MoLBioL，222 :581_597(1991) 分別記載了使用噬菌體文庫分離鼠源和人源抗體。隨后出版物記載了通過鏈重排產生高 親和性(nM 范圍)的人抗體(Marks et al.，BiolTechnology, 10 :779_783 (1992))，以及 使用組合感染(combinatorialinfection)和體內重組作為構建超大噬菌體文庫的策略 (ffaterhouse et al.，Nuc. Acids. Res. ,21 :2265_2266 (1993))。因此，這些技術都是傳統的 單克隆抗體雜交瘤法分離單克隆抗體的切實可行的替代方式。DNA還可以例如以下述方式進行修飾針對編碼序列，用人重鏈和輕鏈恒定域替 換同源的鼠源序列(美國專利 4，816，567 ;Morrison，et al. , Proc. Natl Acad. ScL USA, 81 :6851 (1984))，或者將非免疫球蛋白多肽的編碼序列的全部或部分與免疫球蛋白的編碼序列共價連接。典型地，用這些非免疫球蛋白多肽替換抗體的恒定域，或者用它們替換抗體的一 個抗原結合位點的可變域而生成嵌合二價抗體，其包含一個對抗原特異的抗原結合位點， 和另一個對不同抗原特異的抗原結合位點。(iii)人源化抗體用于將非人抗體人源化的方法在本領域中已有記載。優選地，人源化抗體中 導入了一個或多個來自非人來源的氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基經常稱作“輸入 (import)，，殘基，通常取自某個“輸入”可變域。人源化可以基本上按照Winter及其合 作者的方法(Jones et al.，Nature, 321 :522_525 (1986) ； Reichmann et al.，Nature, 332:323-327(1988) ；Verhoeyen et al.，Science, 239 1534-1536 (1988))來進行，用 高變區序列替換人抗體的相應序列。因此，這些“人源化”抗體是嵌合抗體(美國專利 No. 4，816，567)，其中完整人可變區的一小部分(substantially less than intact)被來 自非人物種的相應序列替代。在實踐中，人源化抗體典型的是人抗體中一些高變區殘基 (可能還有一些FR殘基)被來自嚙齒動物抗體中類似位置上的殘基替代而得到的抗體。用于制造人源化抗體的人可變區，包括輕鏈和重鏈，的選擇對于減少抗原性是 非常重要的。根據所謂的“最佳匹配(best-fit)”方法，用嚙齒動物抗體的可變域的序 列來篩選整個已知人可變區序列文庫。然后，選擇與嚙齒動物序列最接近的人序列作為 用于人源化抗體的人框架區(FR) (Suns et al.，J. Immunol.，151 =2296(1993) ；Chothia et al.，J.Mol.Biol，196 :901(1987))。另一種方法使用來源于輕鏈或重鏈特定亞群中的 所有人抗體之共有序列的特定框架區。同一框架可用于數種不同的人源化抗體(Carter et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89 4285 (1992) ；Presta et al. , J. Immunol. , 151 2623(1993))。此外，人源化的抗體保留對抗原的高親和性和其它有利的生物學性質是重要的。 為了實現這一目標，根據優選的方法，人源化抗體的制備借助下述過程使用親本和人源化 序列的三維模型來分析親本序列和各種理論上的人源化產物。三維免疫球蛋白模型是常 用的，而且本領域技術人員很熟悉它們。有可用的計算機程序來圖解和顯示選定的候選免 疫球蛋白序列的可能三維構型結構。通過檢查這些顯示結果，人們可以分析殘基在候選免 疫球蛋白序列功能中的可能作用，即分析殘基是否影響候選免疫球蛋白與其抗原結合的能 力。這樣，可以選擇FR殘基，并與受體序列和輸入序列組合，從而獲得期望的抗體特性，例 如增加對靶抗原的親和性。一般地說，高變區殘基直接而且最實質性地參與影響抗原的結合。(iv)人抗體除人源化之外，還可以生成人抗體。例如，現在有可能生產這樣的轉基因動物(例 如小鼠)，它能夠在被免疫時產生完全的人抗體譜(repertoire)，而沒有內源免疫球蛋白 產生。例如，已有記載，在嵌合和種系突變小鼠內純合刪除抗體重鏈連接區(JH)，可導致內 源抗體的產生完全被抑制。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉移到這種種系的突變小鼠體 內，可導致在抗原刺激時產生人抗體。見例如Jakobovits et al.，Proc. Mad. Acad. Sci. USA,90 2551 (1993) Jakobovits et al. , Nature, 362 255-258(1993) ；Bruggermann et al.，Year in immuno.，7 33 (1993)；和美國專利 5，591，669，5，589，369 和 5，545，807。McCaffertyet al.，Nature 348 :552_553 (1990))可用 于在體外從來自未被免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)區基因譜(repertoire)產生人抗 體和抗體片段。根據這種技術，將抗體V區基因閱讀框架一致地(in-frame)克隆到絲狀 噬菌體(例如M13或fd)的大或小衣殼蛋白基因內，作為有功能的抗體片段在噬菌體顆粒 的表面上展示。因為絲狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以根據抗體的功能性 質進行選擇也可以選出編碼顯示這些性質的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細胞的一些 性質。噬菌體展示可以用多種形式進行，關于它們的綜述，見例如Johnson，Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3:564—571(1993)。有多 種來源的V基因片段可用于噬菌體展示。Clackson et al.，Nature, 352 =624-628(1991)從經免疫小鼠的脾臟來源的小型 隨機組合V基因文庫分離了多種系列的抗噁唑酮抗體。可以從未被免疫的人供體構建V 基因譜，并基本上按照下列文獻中記載的技術分離針對多種系列抗原(包括自身抗原)的 抗體:Marks et al.，J. Mol. Biol, 222 :581_597 (1991)，或 Griffith et al.，EMB0 J. 12 725-734(1993)。另見美國專利 5，565，332 和 5，573，905。人抗體也可以由體外活化的B細胞來產生(見美國專利205，567，610和 5，229，275)。在共有的共同未決申請中記載了用SCID小鼠產生人抗體的一個優選手段。(v)抗體片段已經開發了各種技術用于產生抗體片段。傳統上，這些片段是通過蛋白水解消化 完整的抗體產生的(見例如 Morimoto et al. , Journal ofBiochemical and Biophysical Methods 24:107—117(1992)和 Brennan et al.，Science, 229 :81 (1985))。然而，現在這 些片段也可以由重組宿主細胞直接產生。例如，可以從上面討論的抗體噬菌體文庫分離抗 體片段。或者，可以直接從大腸桿菌回收Fab' _SH片段，并加以化學偶聯形成F(ab' )2 片段(Carteret al.，Bio/Technology 10 163-167 (1992))。根據另一種方法，F(ab' )2 片段可以直接從重組宿主細胞分離。其它用于產生抗體片段的技術是技術人員容易想到 的。在其它實施方案中，選擇的抗體是單鏈Fv片段(scFv)。見W093/16185;美國專利 No. 5，571，894 ；和美國專利No. 5，587，458。抗體片段還可以是“線性抗體”，例如在美國專 利5，641，870中記載的。這些線性抗體片段可以是單特異性或雙特異性的。(vi)非抗體結合蛋白術語“非抗體結合蛋白，，或“非抗體配體”或“抗原結合蛋白，，可互換使用，指使用 非免疫球蛋白骨架的抗體模擬物，包括adnectimavimers、單鏈多肽結合分子和類抗體結 合肽模擬物，在下文中將更詳細地進行討論。已經開發出了其它按照與抗體相似的方式靶定和結合靶標的化合物。這些“抗體 模擬物”的一些使用非免疫球蛋白骨架作為抗體可變區的可替代蛋白框架。例如，Ladner et al.(美國專利No. 5，260，203)記載了單多肽鏈結合分子，其具 有與抗體的聚集的、但分子水平上分離的輕鏈和重鏈可變區相似的結合特異性。單鏈結合 分子同時含有抗體重鏈和輕鏈可變區的抗體結合位點，它們通過一段肽接頭連接，并會折 疊成與雙肽抗體相似的結構。單鏈結合分子與傳統的抗體相比顯示有多種優勢，包括尺寸 更小、穩定性更高和更容易被修飾。Ku 等 Proc Natl Acad Sci USA 92(14) :6552_6556 (1995))公開了一種基于細胞
44色素b562的抗體替代物。Ku等(1995)制成了一個文庫，其中細胞色素b562的兩個環被隨 機化，并從中選擇針對牛血清白蛋白的結合性。發現突變體們以與抗BSA抗體相似的方式 選擇性結合BSA。Lipovsek等(美國專利6，818，418和7，115，396)公開了一種抗體模擬物，其特 征是具有一個纖連蛋白或纖連蛋白樣骨架和至少一個可變環。這些基于纖連蛋白的抗體模 擬物稱作Adnectins，它們顯示出許多與天然或工程化抗體相同的特征，包括對任何靶配體 的高親和性和特異性。任何用于發展新的或改良的結合蛋白的技術均可用于這些抗體模擬 物。這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈可變區的結構相似。因此，這 些模擬物的抗原結合性質在性質上與親和性上與天然抗體相似。而且，這些基于纖連蛋白 的抗體模擬物與抗體和抗體片段相比還表現出某些優點。例如，這些抗體模擬物的天然折 疊穩定性不依賴于二硫鍵，因此這些抗體模擬物在通常會破壞抗體的條件下仍然保持穩 定。此外，因為這些基于纖連蛋白的抗體模擬物的結構與IgG重鏈的結構相似，所以可以在 體外進行環隨機化和重排處理，類似于抗體的體內親和力成熟過程。Beste 等(Proc Natl Acad Sci USA 96(5) : 1898-1903 (1999))公開了一種基于 脂籠蛋白骨架的抗體模擬物(Anticalin )。脂籠蛋白包括蛋白末端由4個超變環構成的
桶。Beste (1999)將這些環進行隨機突變，并以例如對熒光素的結合為條件進行選擇。 這些變異體顯示對熒光素的特異性結合，其中一個變異體顯示與抗_熒光素抗體相似的結 合。進一步的分析顯示，所有隨機化位置均是可變的，表明Anticalin 可能適合于用作抗 體的替代物。Anticalin 是小的單鏈肽，典型地為160-180個殘基，與抗體相比具有多種優勢，
包括生產成本低、保存穩定性高和免疫反應小。Hamilton等(美國專利No. 5，770，380)公開了一種合成抗體模擬物，其使用杯芳 烴(calixarene)剛性非肽有機骨架，骨架上搭接有多個可變肽環，作為結合位點。肽環相 對于彼此均從杯芳烴的幾何學上的同一側突出。由于這種幾何學構型，所有的環均可供結 合，從而增加了與配體的結合親和性。然而，與其它的抗體模擬物相比，基于杯芳烴的抗體 模擬物不是純粹由肽構成的，因此對蛋白酶攻擊的敏感性降低。骨架也不是僅由肽、DNA或 RNA構成，這意味著該抗體在極端環境條件下相對穩定，壽命較長。而且，因為基于杯芳烴的 抗體模擬物相對較小，其產生免疫響應的可能性降低。Murali 等(Cell Mol Biol. 49 (2) :209_216 (2003))討論一種用于將抗體減 小為更小的模擬肽的方法，他們稱之為“類抗體結合模擬肽(antibody likebinding peptidomemetics) ” (ABiP)，也可以作用抗體的替代物。Silverman 等(Nat Biotechnol. (2005) ,23 :1556_1561)公開了融合蛋白，它們是 包含多個域的單鏈多肽，稱作“avimers”。avimers是通過體外外顯子重排和噬菌體展示 從人細胞外受體域發展而來的，是一類在親和性和對各種靶分子的特異性方面與抗體相似 的結合蛋白。所得的多結構域蛋白可以包括多個獨立的結合域，它們與單表位結合蛋白相 比顯示更高的親和性(在某些情況下是亞納摩爾級)和特異性。關于avimers構建和使 用的更多細節參見例如美國專利申請公開Nos. 20040175756, 20050048512, 20050053973, 20050089932 和 20050221384。
除了非免疫球蛋白蛋白框架之外，包含RNA分子和非天然寡聚體(例如蛋白酶抑 制劑、苯并二氮卓、嘌呤衍生物和轉角模擬物)的化合物也可以模擬抗體的性質，所有 這些均適用于本發明。盡管測試劑文庫的構建是本領域眾所周知的，但在下文中，還是提供了關于鑒定 測試劑和構建這些試劑文庫用于本篩選方法的額外指導。(vii)抗體偶聯和其它修飾本方法中使用的或者本文制造商文獻中包含的抗體可以任意地與細胞毒性或治 療劑偶聯。本文也預期了抗體與一個或多個小分子毒素，如加利車霉素(calicheamicin)、 美登木素(maytansine)(美國專利 No. 5，208，020)、trichothene、和 CC1065,的偶聯 物。在本發明的一個優選實施方案中，抗體與一個或多個美登木素分子偶聯(例如每個 抗體分子與大約1-大約10個美登木素分子)。美登木素可以例如轉變為May SS-Me，其 可被還原成May_SH3，進而與經過修飾的抗體反應(Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992))，從而產生類美登木素生物堿(maytansinoid)-抗體偶聯物。或者，可以將抗體與一個或多個加利車霉素分子偶聯。加利車霉素抗生素家族 能夠在亞皮摩爾濃度產生雙鏈DNA斷裂。可使用的加利車霉素的結構類似物包括但不 限于 h1、a a/、N-乙酰基-yJ、PSAG 禾口 0 \ (Hinmanet al. , Cancer Research 53: 3336-3342(1993)禾口 Lode et al. , Cancer Research 58:2925-2928(1998))。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、 外毒素A鏈(來自銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒 蛋白A鏈、蒴蓮根毒素(modeccin)A鏈、a -帚曲毒素(sarcin)、油桐(Aleurites fordii) 毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陸(Phytolaca Americana)毒蛋白(PAPI、 PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制物、麻瘋樹毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋 白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白樹毒素(gelonin)、絲林霉素 (mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酷霉素(phenomycin)、依諾霉素(neomycin) 和單端孢菌毒素(tricothecenes)。還可參見例如1993年10月28日公開的W093/21232。本發明進一步預期了與多種放射性同位素偶聯的抗體。實例包括211At，mI，125I， 9°Y，186Re，188Re，153Sm，212Bi，32P 和放射性同位素 Lu。可使用多種雙功能蛋白質偶聯劑來制備抗體和胞毒劑的偶聯物，諸如3_(2_吡啶 基二硫代)丙酸N-琥珀酰亞氨基酯(SPDP)、4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己胺-1-羧酸琥 珀酰亞氨基酯、亞氨基硫烷(iminothiolane) (IT)、亞氨酸酯(諸如鹽酸二甲基己二酰亞胺 酯)、活性酯類(諸如辛二酸二琥珀酰亞胺酯)、醛類(諸如戊二醛)、雙疊氮化合物(諸如雙 (對疊氮苯甲酰基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲酰基)己二胺)、二異氰 酸酯(諸如甲苯2，6- 二異氰酸酯)、和雙活性氟化合物(諸如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)的 雙功能衍生物。例如，可如Vitetta et al. , Science 238 =1098(1987)中所述制備蓖麻毒蛋 白免疫毒素。碳-14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二亞乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是 用于將放射性核苷酸與拮抗劑或抗體偶聯的例示性螯合劑。參見W0 94/11026。接頭可以是 便于在細胞中釋放細胞毒性藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭、肽酶敏感接 頭、二甲基接頭或含二硫化物接頭(Chari et al. ,Cancer Research 52:127-131 (1992))。
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或者，可以通過例如重組技術或肽合成制備包含抗體和細胞毒劑的融合蛋白。在另外一個實施方案中，抗體可以和用于腫瘤預定位(pretargeting)的“受 體”(例如鏈霉抗生物素蛋白)偶聯，其中將抗體-受體偶聯物施用給患者，隨后用清除劑從 循環中除去未結合的偶聯物，然后施用與細胞毒劑(例如放射性核苷酸)偶聯的“配體”(例 如抗生物素蛋白)。本發明的抗體還可以和前體藥激活酶偶聯，其將前體藥物(例如肽酰化療劑，見 W081/01145)轉變成活性抗癌藥物。見例如W0 88/07378和美國專利No. 4，975，278。這些偶聯物的酶組分包括任何能夠作用于前體藥的酶，這些酶將前體藥轉變成更 有活性的細胞毒形式。可用于本發明方法的酶包括但不限于可用于將含磷酸鹽/酯的前體藥物轉變為 游離藥物的堿性磷酸酶；可用于將含硫酸鹽/酯的前體藥物轉變為游離藥物的芳基硫酸酯 酶；可用于將無毒5-氟胞嘧啶轉變為抗癌藥物5-氟尿嘧啶的胞嘧啶脫氨酶；可用于將含 肽的前體藥物轉變為游離藥物的蛋白酶，諸如沙雷氏菌蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋 白酶、羧肽酶和組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B和L)；可用于轉化含D-氨基酸替代的前體 藥物的D-丙氨酰羧肽酶；可用于將糖基化前體藥物轉變為游離藥物的碳水化合物切割酶 類，諸如半乳糖苷酶和神經氨酸酶；可用于將內酰胺衍生的藥物轉變為游離藥物 的旦-內酰胺酶；及可用于將在其氨基氮處分別用苯氧乙酰基或苯乙酰基衍生的藥物轉變 成游離藥物的青霉素酰胺酶，諸如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。或者，可使用具有酶 活性的抗體，本領域也稱作“抗體酶”(abzymes)，來將本發明的前體藥物轉變為游離活性藥 物(參見例如Massey，Nature 328:457-458(1987))。可如本文所述制備抗體-抗體酶偶 聯物，用于將抗體酶投遞至腫瘤細胞群。可通過本領域眾所周知的技術將本發明的酶與抗體共價結合，諸如使用上文討論 的異雙功能交聯劑。或者，可使用本領域眾所周知的重組DNA技術構建包含與本發明酶 的至少功能活性部分連接的抗體的至少抗原結合區的融合蛋白(參見例如Neuberger et al.，Nature 312 :604_608(1984))。本文還設想了抗體的其它修飾。例如，可將抗體與多種非蛋白質性質聚合物中的 一種連接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。本文公開的抗體還可以被配制為脂質體。含有抗體的脂質體可通過本領域眾 所周知的方法加以制備，例如下列文獻中所述Epstein et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 3688(1985) ；Hwang et al. , Proc. Natl Acad. Sci. USA，77 :4030 (1980)；美國專 利 Nos. 4，485，045 和 4，544，545 ；和 1997 年 10 月 23 日公開的 W097/38731。美國專利 No. 5，013，556公開了具有更長循環時間的脂質體。特別有用的脂質體可以通過反相蒸發法用包含磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生化 磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂質組合物來產生。將脂質體通過具有限定孔尺寸的濾膜擠出， 產生具有期望直徑的脂質體。本發明抗體的Fab’片段可以按照下列文獻所述通過二硫鍵 交換反應與脂質體偶聯:Martin et al. J ；Biol. Chem. 257 =286-288(1982) 脂質體中可以 視需要包含化療劑。見 Gabizon et al. ANational Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)。還預期了本文所述抗體的氨基酸序列修飾。例如，我們期望提高抗體的結合親和 性和/或其它生物學性質。通過在編碼抗體的核酸中導入合適的核苷酸變化或通過肽合成制備抗體的氨基酸序列變異體。這些修飾包括，例如，從抗體氨基酸序列刪除、和/或插入、 和/或替換殘基。刪除、插入和替換的任意組合均可用于實現所得構建體，使所得的構建體 具有期望的性質。氨基酸變化也可以改變抗體的翻譯后處理，例如改變糖基化位點的數目 或位置。一種用于鑒定抗體中作為優選突變位置的某些殘基或區域的有用方法稱作“丙氨 酸掃描突變”，，如 Cunningham and Wells, Science 244 1081-1085 (1989)所述。這里，鑒 定了一個或一組靶殘基(例如帶電荷的殘基，諸如精氨酸、天冬氨酸、組氨酸、賴氨酸和谷 氨酸)，并用中性或帶負電荷的氨基酸(最優選丙氨酸或聚丙氨酸)替代，以影響氨基酸與 抗原的相互作用。然后通過在或對替代位點引入更多或其它變體，推敲那些對替代顯示功 能敏感性的氨基酸位置。因此，雖然引入氨基酸序列變異的位點是預先決定的，但是突變本 身的性質不需要預先決定。例如，為了分析在指定位點處的突變的后果，在靶密碼子或區域 進行丙氨酸掃描誘變或隨機突變，并對所表達的抗體變體篩選所需活性。氨基酸序列插入包括氨基_和/或羧基_末端的融合，長度范圍從一個殘基至包 含上百或更多殘基的多肽，以及單個或多個氨基酸殘基的序列內插入。末端插入的例子包 括具有N-末端甲硫氨酰殘基的抗體或與細胞毒性多肽融合的抗體。抗體分子的其它插入 變體包括在抗體的N-或C-末端融合酶或提高抗體血清半衰期的多肽。另一類變體是氨基酸替代變體。這些變體在抗體分子中有至少一個氨基酸殘基用 不同殘基替換。最感興趣進行替代誘變的位點包括高變區或CDR，但也考慮了 FR或Fc區改 變。對抗體生物學特性的實質性修飾通過選擇在保持以下方面的效果上顯著不同的 替代來完成(a)替代區域的多肽主鏈的結構，例如作為折疊片或螺旋構象，(b)靶位點處 分子的電荷或疏水性，或(c)側鏈的體積。天然發生的殘基可以根據共有的側鏈性質分成如下幾組(1)疏水正亮氨酸，met, ala, val, leu, ile ；(2)中性親水:cys, ser, thr ；(3)酸性asp，glu ；(4)喊個生:asn, gin, his, lys, arg ；(5)影響鏈方向的殘基gly，pro ；和(6)芳香性:trp, tyr, phe.非保守替換需要用這些組中其中一個的成員交換另一個組的成員。任何不參與保持抗體的合適構象的半胱氨酸殘基均可加以替換，一般是替換成絲 氨酸，以提高分子的氧化穩定性，和防止異常交聯。相反，可以向抗體添加半胱氨酸鍵，以提 高其穩定性(特別是抗體是片段例如Fv片段的情況)。特別優選的一類替代變體涉及替代親本抗體(如人源化或人抗體)的一個或多個 高變區殘基。通常，選擇用于進一步開發的所得變體相對于產生它們的親本抗體將具有改 進的生物學特性。產生此類替代變體的一種便利方法涉及使用噬菌體展示的親和力成熟。 簡而言之，將數個高變區位點(例如6-7個位點)突變，在各個位點產生所有可能的氨基酸 替代。如此產生的抗體變體以單價形式展示在絲狀噬菌體顆粒上，作為與各個顆粒內包裝 的M13基因III產物的融合物。然后如本文所公開的對噬菌體展示的變體篩選其生物學活性(例如結合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區位點，可進行丙氨酸掃描誘變以鑒 定對抗原結合具有重要貢獻的高變區殘基。或者/另外，分析抗原_抗體復合物的晶體結 構，以鑒定抗體和抗原之間的接觸點可能是有益的。所述接觸殘基及鄰近殘基是依照本文 詳述的技術進行替代的候選位點。一旦產生這樣的變體，如本文所述對該組變體進行篩選， 可選擇在一種或多種相關測定法中具有優良特性的抗體用于進一步的開發。抗體的另一類氨基酸變體改變了抗體的原始糖基化樣式。改變意味著刪除在抗 體中發現的一個或多個碳水化合物模塊，和/或添加抗體中不存在的一個或多個糖基化位 點o抗體的糖基化通常或是N-連接的或是0-連接的。N-連接指碳水化合物模塊搭 接于天冬酰胺殘基的側鏈。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X 是除脯氨酸外的任何氨基酸)是將碳水化合物模塊酶促搭接于天冬酰胺側鏈的識別序列。 因此，多肽中這些三肽序列其中任一的存在產生了潛在的糖基化位點。0-連接的糖基化指 將糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一搭接于羥基氨基酸，最常見的是絲氨酸或蘇氨 酸，但也可使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。向抗體中添加糖基化位點可通過改變氨基酸序列使其包含一個或多個上述三肽 序列而便利的完成(對于N-連接的糖基化位點)。所述改變還可通過向原始抗體的序列中 添加或替代一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來進行(對于0-連接的糖基化位點)。編碼抗體氨基酸序列變體的核酸分子可通過本領域已知的多種方法制備。這些方 法包括但不限于從天然來源分離(在天然存在氨基酸序列變體的情況中)，或者通過對早 期制備的變體或非變體型式的抗體進行寡核苷酸介導的(或定點)誘變、PCR誘變和盒式 誘變來加以制備。理想的是修飾本發明中使用的抗體來改善效應物功能，例如增強抗體的抗原依賴 性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和/或補體依賴性細胞毒性(CDC)。這可通過在抗體Fc區 中弓I入一個或多個氨基酸替代來實現。或者/另外，可在Fc區中引入半胱氨酸殘基，從而容 許在該區中形成鏈間二硫鍵。如此產生的同二聚體抗體可具有改善的內在化能力和/或提 高的補體介導的細胞殺傷和抗體依賴性細胞細胞毒性(ADCC)。參見Caron et al.，J. Exp. Med. 176 1191-1195(1992)和 Shopes, B.，J. Immunol. 148=2918-2922(1992)。具有增強的抗腫瘤活性的同二聚體抗體還可使用如Wolff et al.， CancerResearch 53:2560-2565(1993)中描述的異雙功能交聯劑來制備。或者，抗體可改 造成具有雙重Fc區，由此可具有增強的補體溶解和ADCC能力。參見Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219—230(1989)。為了提高抗體的血清半衰期，可如例如美國專利5，739，277中所述在抗體(尤其 是抗體片段)中加入補救受體結合表位。在用于本文時，術語“補救受體結合表位”指IgG 分子(如IgA、IgG2、IgG3或IgG4)Fc區中負責提高IgG分子體內血清半衰期的表位。本發明的多個方面將在下面的實施例中進行描述，這些實施例并不意圖限制由權 利要求描述的本發明的范圍。除非另外定義，否則本文所使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域普 通技術人員所普遍理解的相同的意思。盡管在實踐或檢驗本發明時可以使用與本文所述方 法和材料相似或等價的方法和材料，但是下文記載了合適的方法和材料。
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本發明在下文的實施例中將進行進一步的描述，它們并不限制由權利要求描述的 本發明的范圍。
實施例本發明在下文的實施例中將進行進一步的記載，它們并不限制由權利要求描述的 本發明的范圍。「實施例11通用方法細胞系C0S7細胞和PC細胞系LNCaP、22Rvl、PC-3、DU-145和C4-2B從美國典型培養 物保藏中心(ATCC、Rockville、MD)購買，LNCaP來源的HRPC細胞系C4-2B從ViroMed Laboratories (Minnetonka, MN)購買。傳代超過 30 次的 LNCaP 被定義為 LNCaP (HP)， 其與傳代次數低的LNCaP細胞在形態學上和基因表達模式方面有所不同。它們生長于 Delbecco 改良的 Eagle 培養基(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，該培養基添加 了 10 % 胎牛血清(GeminiBio-Products，West Sacramento, CA)和抗生素/抗真菌劑溶液 (Sigma-Aldrich, St. Louis, M0)。將細胞保持在 37°C 5% C02 的濕潤氣氛中。半定量RT-PCR如前人所述地(TamuraK et al.，Cancer Res 200767 :5117-25.)從冷凍PC組織 中純化PC細胞和正常前列腺上皮細胞。在獲得了患者知情同意的前提下，從正在進行前列 腺針吸活檢、骨活檢、TUR-P(經尿道前列腺切除)和“溫熱”尸檢的HRPC患者采取組織樣品。 同時，還從正在進行根治性前列腺切除術的、未經治療的可手術病例(untreated operable cases)獲得未經激素處理的(hormone-naYve )前列腺癌(HNPC)樣品，從已確認組織病理 學上無明顯前列腺癌或PIN的良性前列腺增生(BPH)患者和膀胱癌患者獲得了正常的前列 腺上皮細胞(NPEC)。如前所述(Tamura K et al.，Cancer Res 200767 :5117_25.)進行 HRPC細胞、未經激素處理的前列腺癌細胞和正常前列腺上皮細胞的顯微解剖。對來自這些 樣品的RNA進行兩輪基于T7的RNA擴增(Epicentre Technologies,Madison, WI)，并隨后 合成單鏈cDNA。用Rneasy試劑盒(QIAGEN，Valencia, CA)根據制造商的推薦提取人HRPC 細胞系的總RNA。提取的RNA用無RNA酶的DNA酶套裝(QIAGEN)處理，然后利用d⑴12-18 引物和Superscript II逆轉錄酶(Invitrogen)逆轉錄成單鏈cDNA。使用如下的引物序 列肌動蛋白(ACTB)正向TTGGCTTGACTCAGGATTTA (SEQ ID NO. 6)肌動蛋白(ACTB)反向ATGCTATCACCTCCCCTGTG (SEQ ID NO. 7)PKIB 正向GGCACATACTAGAAGCAAAATACG (SEQ ID NO. 8)PKIB 反向GATGGGCAAATCATTCTTGGTA (SEQ ID NO. 9)NAALADL2 正向GAAAGCATCTCACATTGGTTTTC (SEQ ID NO. 10)NAALADL2 反向GGGTTTCAAAGAGAAACTCTGCT (SEQ ID NO. 11)NAALADL2-2 正向GAAGCAAAATGCCAGATGGT (SEQ ID NO. 12)NAALADL2-2 反向TCCTGCACAGTGTTCTAGAAAGG (SEQ ID NO. 13)該EST與NAALADL2基因的聯系通過RT-PCR加以確認。確定RT-PCR的指數期，以 容許對從相同反應產生的cDNA進行半定量比較。每個PCR體系包括98°C，30秒初始變性步驟，隨后98°C 10秒，55°C 5秒，和72°C 30秒進行22個循環(對于ACTB)，23個循環(對 TPKIB, NAALADL2), ^ GeneAmp PCR system 9600 (PE Applied Biosystems, Foster, CA) 上進行。Northern 印跡分析使用Rneasy試劑盒(QIAGEN)從7種PC細胞系提取總RNA，并進行Northern印跡 分析。用mRNA純化試劑盒(GE Healthcare)根據制造商的方案純化出mRNA。將1 P g等份 的來自PC細胞系以及從正常人心臟、肺、肝、腎、腦和前列腺(BD Biosciences,Palo Alto, CA)分離的每種mRNA在變性瓊脂糖凝膠上進行分離，并轉移到尼龍膜上。261bp的PKIB 特異性探針通過用上述的引物組進行PCR加以制備，706bp的NAALADL2特異性探針通過用 如下的引物組進行PCR加以制備正向5’ -ccagtgcccagaaaccaata-3’ (SEQ ID NO. 14)和 反向 S'-tcaattcttcccatccaagacal'(SEQ ID NO. 15)。根據 Megaprime DNA 標記系統(GE bioscience,UK)的使用說明，與隨機引發的a 32P-dCTP_標記探針進行雜交。預雜交、雜交 和清洗根據供應商的推薦進行。印跡用光增感屏在-80°C放射自顯影7天。小干擾RNA(siRNA)表達構建體和轉染為了敲低PKIB和NAALADL2在PC細胞中的表達，如前人所述地(Tamura K et al.， Cancer Res 200767 :5117_25.)使用psiU6BX3. 0載體表達針對靶基因的短發夾RNA。用于 PKIB siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下sil；GCCCTAAGCAGCATGTGTA (SEQ ID NO. 16),si2 ；GCAGTAGGCACTTAAGCAT (SEQ ID NO. 17)si3 ；GATGCAAAAGAGAAAGATG (SEQ ID NO. 18)用于NAALADL2siRNA的合成寡核苷酸的靶序列如下si#690 ；GACTCAGTGGACCTCTTTG (SEQ ID NO. 19)si#913 ；GTCATCGATGTGAGTTATG (SEQ ID NO. 20)si#1328 ；GAGTCGTCAGCATGCAAGT(SEQ ID NO. 21)和siEGFP ;GAAGCAGCACGACTTCTTC(SEQ ID NO. 22)(作為陰性對照)。將 PC 細胞 系22Rvl和LNCaP (HP)或C4-2B細胞鋪布在10_cm盤或6孔板上，并使用FuGENE6 (Roche) 根據制造商的說明，用設計表達針對PKIB或NAALADL2的siRNA的質粒(8 y g/盤，3 y g/ 孔)進行轉染。細胞用0. 8mg/ml遺傳霉素(Sigma-Aldrich)選擇7天，然后收集細胞并分 析對PKIB或NAALADL2表達的敲低作用。用上述引物對PKIB或NAALADL2進行RT-PCR。對 于集落形成試驗，將表達siRNA的轉化體在含有遺傳霉素的培養基內生長20天。用100% 甲醇固定后，轉化細胞用0. 結晶紫-H20染色以評估集落形成。細胞生存力的定量使用 細胞計數試劑盒_8(D0JIND0，Kumamoto, Japan) 0在含有遺傳霉素的培養基中培養20天 后，添加終濃度為10%的溶液。在37°C溫育2小時后，用酶標儀550(Bio-Rad，Hercules, CA)測量490nm吸光度，以630nm為參比。本發明人還合成了對應于si#690的RNA雙鏈體 5，-GACUCAGUGGACCUCUUUGGG-3，(SEQ ID NO. 23)和 5，-CAAAGAGGUCCACUGA⑶CUU-3，(SEQ ID NO. 24)，或者陰性對照 siRNA 雙鏈體(GCAGCACGACUUCTUUCAAGTT(SEQ ID NO. 25)和 CUUGAAGAAGUC⑶GCUGCTT (SEQ ID NO. 26))，將它們的分別轉染進入另一種表達NAALADL2的 PC細胞系C4-2B細胞。免疫細胞化學
通過PCR擴增編碼PKIB或NAALADL2開放閱讀框的cDNA，將PCR擴增產物克隆到 pcDNA3. l(+)/myc-HisA 載體(Invitrogen)或 pIRES/HA(Clontech/BD Bioscience)中。 用FuGENE6按照制造商推薦的程序(Roche)將質粒轉染進入涂布在玻璃蓋玻片(Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ)上的 C0S7 中。溫育 48 小時后，用 4%多聚甲酸 固定細胞，并在室溫下用溶于PBS中的0. Triton X-100處理lmin使之通透化。用含 有3% BSA的PBS在室溫下處理30min，封閉非特異結合。用稀釋于含BSA的PBS中的 抗_Myc抗體(Santa Cruz)或抗-HA抗體(Sigma)在室溫下溫育細胞60min。用PBS清洗 后，用FITC偶聯第二抗體(Santa Cruz)在室溫下對細胞染色60min。用PBS清洗后，用含 有 4，，6，_ 二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽(DAPI)的 VECTASHIELD (VECTOR Laboratories, Inc，Burlingame，CA)封固樣品，并用光譜共聚焦掃描系統(Leica，Bensheim，Germany)可 視化。PKIB與PKA-C間的相互作用將PKIB-Myc和HA-PKA-C表達載體共轉染進入22Rvl細胞，轉染48小時后，用裂 解緩沖液[50mM 撲18-11(1( 117.0)、2501111蔗糖、11111 DTTUOmM EDTAUmM EGTA、5mM MgCl2] 裂解這些細胞。細胞裂解物用抗_Myc抗體(Santa Cruz)或抗_HA抗體(Sigma)免疫沉淀， 用抗_Myc抗體或抗-HA抗體對這些免疫沉淀物進行western印跡分析。PKA-C 定位本發明人合成了對應于序列sil的RNA雙鏈體(5，-GCCCUAAGCAGCAUGUGUAUA-3， (SEQ ID NO. 27)和 5，-UACACAUGCUGCUUAGGGCUU-3，(SEQ ID NO. 28))，以更有效地敲低內 源PKIB。用Lipofectamin 2000 (Invitrogen)根據制造商的推薦方法將這些RNA雙鏈體轉 染進入PC-3細胞。溫育48小時后，用4%多聚甲醛固定細胞，并在室溫下用溶于PBS中的 0. 1% Triton X-100通透化lmin。用含有3% BSA的PBS在室溫下處理30min，封閉非特異 結合。用以1 200的比例稀釋于含1%BSA的PBS中的抗-PKA-C抗體(C-20，Santa Cruz) 在室溫下溫育細胞60min。用PBS清洗后，用FITC偶聯第二抗體(Santa Cruz)在室溫下對 細胞染色60min，并用光譜共聚焦掃描系統可視化。為了分級細胞裂解物，用Lipofectamin 2000 (Invitrogen)根據制造商的推薦方法將RNA雙鏈體轉染進入LNCaP (HP)細胞。溫 育48小時后，收集細胞，并用NE-PER細胞核和細胞質提取試劑(PIERCE)將這些細胞裂 解物分級。用抗-PKA-C抗體和作為上樣和細胞核分級對照的抗-核纖層蛋白B抗體 (Calbiochem)，對30 i g蛋白的分級的細胞裂解物進行western印跡。PKIB過表達細胞的生成和體外/體內生長測定通過PCR擴增了編碼PKIB開放閱讀框的cDNA，并將PCR擴增產物克隆到pIRES/ HA(Clontech/BD Bioscience)中。用FuGENE6 (Roche)根據制造商推薦的程序將質粒轉染 進入無PKIB的PC細胞系DU145。細胞群體用0. 6mg/ml遺傳霉素(Invitrogen)選擇，然后 通過有限稀釋對形成克隆的DU145細胞進行亞克隆。通過RT-PCR如上所述地確認PKIB表 達，建立了三個組成型表達PKIB的克隆。還建立了用空pIRES/HA載體轉染的對照DU145細 胞作為模擬細胞。使用細胞計數試劑盒-8(D0JIND0)測量這些已建立的克隆的生長曲線。對于體內生長測定，將兩個穩定克隆和兩個模擬克隆的2X106個細胞分別接種在 雄性裸鼠的右脅和左脅。抗體生成和免疫組織化學
將兩種來自人PKIB 的肽(SARAGRRNALPDIQSSAATD(SEQ ID NO 33)和 KEKDEKTTQDQLEKPQNEEK(SEQ ID NO :34))免疫接種到家兔體內，在親和柱上對免疫血清進 行純化，其中親和柱裝填有通過基本方法與每種肽抗原偶聯的Affi-GellO活化親和介質 (Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)的。PC 組織的常規切片(Conventional section) 從手術樣品獲得，HRPC組織通過尸檢和TUR-P獲得(Tamura et al. Cancer Res 67， 5117-25，2007)。將切片在 108°C 的 Dako Cytomation Target Retrieval Solution High pH(Dako，Carpinteria，CA)中處理15min，進行脫蠟和高壓滅菌。在封閉內源過氧化物酶和 蛋白質之后，將切片與抗-PKIB抗體(按1 100稀釋)在室溫下溫育60min。用PBS清洗 后，用過氧化物酶標記的抗家兔免疫球蛋白(Envision kit,Dako)進行免疫檢測。最后，用 3，3’ - 二氨基聯苯胺(Dako)對反應物進行顯影。用蘇木精進行復染。Akt磷酸化22Rvl, LNCaP或PC_3細胞如上面討論地用對應于序列sil的PKIB寡siRNA或 PKIB表達載體(pcDNA3. 1/HA-PKIB)轉染，在48小時或24小時后收集。用含有蛋白酶抑制 劑(蛋白酶抑制劑合劑第III組；CALBI0CHEM)的RIPA緩沖液(50mM Tris-HCl [pH 8. 0]、 150mM NaClU%NP-40,0. 5%脫氧膽酸鈉、0. 十二烷基磺酸鈉[SDS])裂解細胞。蛋白樣 品用SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離，并電印跡到PVDF轉移膜(GE Healthcare Bio-sciences) 上。將印跡與家兔單克隆抗-磷酸Aktl(Ser473)抗體(Cell signaling)、家兔單克隆 抗-Aktl抗體(Cell signaling)或小鼠單克隆3 -肌動蛋白(ACTB)抗體(Sigma)溫育。 蛋白條帶通過增強化學發光(ECL)western印跡檢測試劑(GE HealthcareBio-sciences) 可視化。基質膠(Matrigel)侵襲測定用表達PKIB的質粒(pcDNA3. 1/HA-PKIB)或用模擬質粒轉染的NIH3T3細胞在含 10% FBS的DMEM中生長至接近匯合。通過胰蛋白酶消化收集細胞，用未添加血清或蛋白酶 抑制劑的DMEM清洗，并以5X105/ml的濃度懸浮在DMEM中。在制備細胞懸液之前，將基質 膠基質(Becton DickinsonLabware)的干燥層用DMEM在室溫下復水2小時。向每個下部小 室(lowerchamber)中添加含有10% FBS的DMEM(0. 75ml)；侵襲通過人工基膜(Matrigel) 的細胞如上所述地固定，并用吉姆薩染色。「實施例21在PC細胞中PKIB和NAALADL2的過表達 在通過HRPC細胞的全基因組范圍cDNA微陣列分析篩選出的數十種反式激活基因 中(Tamura K et al. , Cancer Res 200767 :5117_25.)，本發明關注 PKIB 和 NAALDL2。在 9 個顯微解剖的HRPC細胞群體中的5個內通過RT-PCR確認有PKIB過表達(圖1A)，在9個 顯微解剖的HRPC細胞群體中的5個內確認有NAALADL2過表達(圖2A)。
這兩個基因在正常器官，包括心臟、肺、肝和腎中的表達微弱，與激素敏感型或未 處理型PC細胞相比，HRPC細胞顯示這兩個基因有更高表達。使用PKIB的cDNA片段作為 探針進行Northern印跡分析，在胎盤和PC細胞系中特異地鑒定出了一個大約1. 3kb的 轉錄本，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、腎和腦，沒有觀察到表達(圖1B)。使用 NAALADL2的cDNA片段作為探針進行Northern印跡分析，在三個PC細胞系中特異性地鑒定 出了大約10kb、6kb和5kb的條帶，但是在任何其它器官中，包括肺、心、肝、腎和腦，沒有觀 察到表達(圖2B)。
數據庫分析和跨NAALADL2編碼區的RT-PCR提示，這三個條帶反映了 3’ UTR的變 異。制成了特異針對人PKIB的多克隆抗體，并且為了確認PKIB蛋白在PC細胞中的表達， 用41個臨床PC組織，包括32個激素敏感型或未經激素處理型的PC和9個HRPC，進行了免 疫組織化學分析。如Northern印跡分析和RT-PCR分析所示，PIN(圖1C)和正常前列腺上 皮細胞(圖1D，用N表示)顯示微弱的PKIB染色(+)，10/32(31% )的未經激素處理型PC 也顯示微弱或無PKIB染色(+)(圖1D)。另一方面，22/32 (69%)的未經激素處理型PC(圖 1E)和全部6個HRPC(圖1F)顯示PKIB強陽性(++或+++)，這與RT-PCR分析的結果是一 致的。而且，全部(9/9)GleaS0n等級5級的未經激素處理型PC(圖1E)以及HRPC都顯示 PKIB強陽性，并且PKIB表達與Gleason等級強烈相關(表1，卡方檢驗，P = 1.35X10—6)， 提示PKIB表達可以指示PC的惡性表型和不良預后。表1在臨床PC組織中PKIB表達與Gleason分數(GS)相關 「實施例31PC細胞系中siRNA敲低PKIB為了研究PKIB異常表達的潛在促生長作用構建了數個siRNA表達載體，以檢查它 們對表達PKIB的PC細胞系22Rvl和LNCaP (HP)細胞的敲低作用。當sil和si2構建體被 轉染到22Rvl細胞(左)和LNCaP (HP)細胞(右)時，通過半定量RT-PCR觀察到了顯著 的敲低效果，但是#3si和陰性siRNA構建體siEGFP沒有(圖3A)。在含有遺傳霉素的培 養基中選擇之后，MTT測定(圖3B)和克隆形成測定(圖3C)證明，在22Rvl細胞(左)和 LNCaP (HP)細胞(右)中導入sil和si2可顯著降低其細胞生長和生存力，而其它不影響 PKIB表達的siRNA則不會影響細胞生長，表明PKIB很可能在PC細胞生存力中發揮重要作 用。「實施例41 PC細胞系中通過siRNA敲低NAALADL2為了研究NAALADL2異常表達的潛在促生長作用，構建了數個siRNA表達載體，以 檢查它們對表達NAALADL2的PC細胞系一22Rvl細胞的敲低作用。當si#690構建體被轉染 到22Rvl細胞時，通過半定量RT-PCR觀察到了顯著的敲低效果，但是其它構建體沒有(圖 4A)。在含有遺傳霉素的培養基中選擇14天之后，MTT測定(圖4B)和克隆形成測定(圖 4C)證明，在22Rvl細胞中導入si#690可急劇降低其細胞生長和生存力，而其它沒有顯示對 NAALADL2表達的敲低效果的siRNA則沒有影響細胞生長，這表明NAALADL2很可能在癌細胞 生存力中發揮重要作用。將對應于si#690的合成RNA雙鏈體或陰性對照siRNA雙鏈體轉 染進入另一個NAALADL2表達PC細胞系C4-2B細胞。RT-PCR顯示，si#690RNA雙鏈體明顯地敲低了內源NAALADL2在C4-2B細胞中的表達(圖4D)，并且MTT測定證明si#690RNA雙 鏈體還能抑制C4-2B細胞的生長(圖4E)。「實施例51PKIB和NAALADL2蛋白的亞細胞定位使用構建的哺乳動物表達載體表達帶標簽的全長PKIB和NAALADL2蛋白，用 抗_標簽抗體通過免疫細胞化學研究它們的亞細胞定位。如圖5所示，外源PKIB定位于細 胞質(圖5A)，而外源NAALADL2蛋白定位于細胞膜(圖5B)。NAALADL2具有一個跨膜，被預 測作為II型膜蛋白定位于質膜。我們的數據支持這一點，因此NAALADL2蛋白很可能是II 型膜蛋白。「實施例51 PKIB與PKA-C的相互作用，和敲低PKIB所致的PKA-C轉位PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制劑)家族，并且PKIA能夠敲低蛋白激酶A催化亞 基(PKA-C)的激酶活性，并通過其假底物基序(RRNA ；SEQ IDN0 31)與PKA-C直接結合從而 將 PKA-C 從細胞核外排到細胞質(Glass DBet al.，J Biol Chem 1986261 :12166_71.和 Wen ff et al.，J Biol Chem 1994269 :32214_20.)。PKIB 也具有假底物基序(RRNA)，但其 抑制活性比 PKIA 小得多(Gamm DM et al. , J Biol Chem 1995270 :7227_32.)，并且其在細 胞中轉位PKA-C的活性未知。為了研究PKIB是否參與PKA-C定位，首先驗證PKIB與PKA-C 間的直接相互作用。將PKIB-Myc和HA-PKA-C表達載體共轉染22Rvl細胞，通過每種標簽 抗體對它們的細胞裂解物進行免疫沉淀。圖5C顯示，PKIB-Myc與PKA-C免疫共沉淀，反之 亦然，表明PKIB與PKA-C間有直接相互作用。接著，通過免疫細胞化學分析和細胞分級檢查在敲低了 PKIB的PC-3細胞或 LNCaP (HP)細胞中內源PKA-C的亞細胞定位。免疫細胞化學分析觀察到，當用對照siRNA轉 染PC-3細胞時，大多數PKA-C定位于細胞質，一些PKA-C蛋白細胞位于細胞核(圖5D，左)。 另一方面，當在PC-3細胞中用siRNA敲低內源PKIB時，免疫細胞化學分析顯示在細胞核中 沒有或者僅有非常小的PKA-C信號(圖5D，右)。在另一種PKIB表達PC細胞系LNCaP (HP) 細胞中觀察到了相同的現象。為了更加定量地分析細胞核PKA-C，對用PKIB siRNA處理過 的LNCaP (HP)細胞的裂解物進行分級。如圖5E所示，與對照siRNA相比，PKA-C在細胞核中的量在PKIB敲低中被明顯降 低，而PKA-C在細胞質中的量在PKIB敲低中則有微小增加。這些發現暗示，PKIB能夠幫助 PKA-C進入細胞核，或者抑制PKA-C從細胞核外排，這與PKIA的細胞核外排功能不同。「實施例71 PKIB過表達促進PC細胞生長為了研究PKIB的致癌功能，從DU145細胞(其不表達或僅表達很少量內源PKIB) 建立了三個組成性表達外源PKIB的克隆，將這些克隆的生長與模擬DU145細胞進行比較。 如圖所示，所有三個克隆均組成性表達外源PKIB(圖6A，圖6B)，并且它們在體外(圖6C) 和體內(圖6D)比模擬細胞生長得更快，提示PKIB在前列腺癌中的促生長作用。如本免疫 組織化學分析所示，PKIB過表達與高Gleason分數強相關，這表明PKIB可能對前列腺癌細 胞的惡性和侵襲潛能有貢獻。然后，通過基質膠侵襲測定考察了 PKIB在細胞侵襲中的可能 作用。如圖6E所示，用PKIB表達載體轉染的OTH3T3細胞與用模擬載體轉染的細胞相比， 顯著增強了其透過基質膠的遷移。「實施例81 PKIB參與PC內的Akt磷酸化許多報道提示，PTEN的功能喪失和Akt的激活與前列腺癌的進展顯著相關，并且PTEN-PI3K-Akt途徑很可能在HRPC進展和其惡性表型中發揮關鍵作用(Sellers， W. R. &Sawyers, C. L. (2002),《Somatic Genetics ofProstate Cancer Oncogenes and Tumor Suppressors)) Kantoff, P.編輯(Lippincott ffilliams&ffilkins, Philadelphia), Wang Y, Kreisberg JI, Ghosh PM. , Curr Cancer Drug Targets. 2007S印；7(6) :591_604, Lin HK, Yeh S, Kang HY, Chang C, Proc Natl Acad Sci U S A 2001 ；98 (13) 7200-5, Feldman BJ, FeldmanD, Nat Rev Cancer 2001 ；1(1) :34_45，Malik SN, Brattain M,Ghosh PM, TroyerDA, Prihoda T, Bedolla R, Kreisberg JI. ， Clin Cancer Res. 2002 ；8 (4) 1168-71)。于是，我們研究了 PKIB是否能夠影響Akt磷酸化。首先，用對應于sil的RNA 雙鏈體敲低PKIB在PC細胞系(LNCaP和PC-3)中的表達，通過western印跡分析檢查Akt 在Ser 473位的Akt磷酸化。RNA雙鏈體對PKIB的敲低得到了 RT-PCR的驗證(數據未顯 示)。結果，PKIB敲低顯著影響了 PC細胞中的Akt磷酸化(圖7A)。而且，如圖7B所示，還 觀察到，PKIB在PC細胞中的過表達顯著提高Akt在Ser473位的磷酸化。結果證明，PKIB 直接相互作用于PKA-C激酶，并可能修飾其功能，并且已經確認，PKA-C激酶過表達也會提 高Akt在Ser473的磷酸化(圖7A)。這些發現提示，PKIB可能參與PC細胞中的Akt磷酸 化(Ser473)，可能是通過修飾PKA-C激酶的功能。接著，如圖冗所示，我們觀察到，PKIB在PC細胞中的過表達可提高Akt磷酸化。 結果證明PKIB與PKA-C激酶直接相互作用，并可能修飾后者的功能，并且已經確認，PKA-C 激酶過表達也會提高Akt磷酸化(圖7C)。這些發現提示，PKIB可能參與Akt磷酸化，可能 是通過修飾PKA-C激酶。此外，為了確認Akt Ser473是否直接被PKA-C和/或PKIB磷酸化，使用重組PKIB、 PKA-C激酶和Akt蛋白進行體外激酶測定。如圖7D所示，當PKA-C激酶與重組Akt反應時 磷酸化Ser473特異抗體可檢測到磷酸化的Akt，而且PKIB的添加顯著提高了 Akt (Ser473) 的磷酸化水平。這提示，PKA-C激酶和PKIB可以直接并且有效地磷酸化Akt Ser473，這有 助于PC細胞的生長促進和進展。「實施例91 PC組織中的Akt磷酸化和PKIB過表汰最后，在臨床PC組織中檢查PKIB表達與Akt Ser473磷酸化的關聯。圖8顯示了 代表性的PC組織圖片，比較PC組織面對面切片(face-on-faceslide)中PKIB的染色模式 和pAkt (Ser473)的染色模式，表明在該PC組織中PKIB表達和Akt磷酸化具有相關性。表 2總結了臨床PC組織中PKIB表達與Akt磷酸化間的相關性(P = 0. 0156，卡方檢驗)。表2臨床組織中PKIB表達與Akt Ser473磷酸化間的關聯 (P = 0. 0156，卡方檢驗)討論
在本發明中，用臨床HRPC細胞的全基因組范圍基因表達譜分析鑒定了兩種前列 腺癌一特別是激素難治性前列腺癌一的分子靶標。前列腺癌顯示相對良好的預后，激素 耗竭療法(hormone depletion therapy)在大多數復發或晚期PC中有效。但是一旦出現 HRPC細胞，PC患者護理的選項就非常少了。結果，現有技術已經認識到，需要為HRPC患者 鑒定新的分子靶標，并通過靶定這些新分子開發HRPC的新療法。PKIB屬于PKI (蛋白激酶A抑制劑)家族，PKIA能夠抑制蛋白激酶A催化亞基 (PKA-C)的激酶活性，并通過與PKA-C直接結合將PKA-C從細胞核外排到細胞質(Glass DB et al.，J Biol Chem 1986261:12166-71.和 Wen Wet al.，J Biol Chem 1994269 32214-20.)。蛋白激酶A(PKA)、cAMP-依賴的蛋白激酶A，多被認為對于介導由cAMP引 發的廣泛的生理和病理作用和與G蛋白的偶聯至關重要，有多種配體和受體系統可激 活PKA信號途徑，并且其激活與細胞生長和分化的控制有關(Tasken K et al. , Physol Review200484 137-67. and Stork PJ et al. , Trends Cell Biol 200212:258-66.)。在前列腺癌中，有多個報道提示，它涉及不依賴雄激素的生長和神經內分泌性分 化(Cox ME et al.，J Biol Chem 2000275 :13812_8.)，還有人提出 HRPC細胞的雄激素非依 賴性生長中涉及了 PKA途徑和AR途徑之間的對話(cross-talk) (Stork PJ et al.，Trends Cell Biol 200212:258-66.和 Sadar MD, JBiol Chem 1999274:7777-83.)。在本發明中，已經證明PKIB能夠幫助PKA-C的細胞核定位并促進PC細胞生長，而 不是像PKI家族成員那樣抑制PKA-C活性或PKA途徑。先前的報道提示，PKIB在體外具有 一些PKA-C抑制活性，但是其Km比PKIA高得多，并且輔助PKA-C的細胞核轉入或抑制其細 胞核導出是PKIB在PC細胞中的主要功能。而且，PKIB與在CRPC的侵襲和惡性表型中發 揮關鍵作用的Akt Ser473磷酸化強烈相關。NAALADL2是一種新的II型膜蛋白，屬于谷氨酸羧肽酶II (GCPII)家族。GCPII的 前列腺形式，稱作前列腺特異膜抗原(PSMA)，在前列腺癌中表達，并且PSMA的表達水平增 加與 PC 進展和 HRPC 相關(Rajasekaran AK et al.，Am J Physiol Cell Physiol 2005 288 :C975-81.和 Murphy GP et al.，Prostate200042 :145-9.)。考慮到其與 PSMA 的同源 性和其相似的表達模式，這種新型分子NAALADL2應當稱作“PSMA2”。PSMA是一種FDA批準 的前列腺癌顯像劑一lllln-標記的7E 11單克隆抗體(Prostascint，Cytogen，Princeton， NJ)-的靶標，并且PSMA被單克隆抗體例如J591靶定，該抗體在臨床試驗中用于將成像 劑或治療劑特異遞送到PSMA表達細胞(Murphy GP et al.，Prostate 200042 145-9.和 Holmes EH, Expert Opin Investig Drugs 2001 10:511-9.)。除了充當腫瘤標志物之外，PSMA具有GPC活性，其底物包括聚_、_谷氨酸葉酸 (Zhou J et al.，Nature Review Drug Disc 20054:1015-26.)。PSMA 的酶活性可用于設 計前體藥物，其中藥物的無活性谷氨酸化形式僅在表達PSMA的細胞中被選擇性切割并由 此激活(Denny WA et al.，Eur J Med Chem200136 :577_95.)。然而，PSMA 如何與前列腺 癌進程相關則完全未知，并且靶定PSMA功能或其自身活性的可能性也尚未知曉。NAALADL2 在HRPC細胞中高表達，而其在正常成人器官中的表達則非常有限，如圖2B所示。除了其作 為腫瘤標記的限制性表達之外，它很可能與PC生存力或生長有關，這得到了 siRNA實驗的 支持。因此，和腫瘤標志一樣，針對PSMA2的特異單克隆抗體亦可用于通過阻斷PSMA2活性 進行PC治療。
工業應用性人基因PKIB和NAALADL2的表達在前列腺癌中，特別是激素難治性前列腺癌或去 勢抵抗性前列腺癌，比正常器官顯著提高。因此，這些基因可以方便地用作前列腺癌診斷標 記，借此所編碼的蛋白可以用于前列腺癌的診斷試驗。本發明人證明，細胞生長被特異靶定PKIB和NAALADL2基因的雙鏈分子抑制。因 此，這些新的雙鏈分子可用于開發抗癌藥物。例如，阻斷PKIB或NAALADL2蛋白表達或阻止 其活性的試劑可應用為抗癌劑，特別是用于治療前列腺癌，尤其是激素難治性前列腺癌或 去勢抵抗性前列腺癌，的抗癌劑的治療用途。而且，無論是PKIB還是NAALADL2多肽均是開發抗癌藥物的有用靶標。例如，與 PKIB或NAALADL2結合、或阻斷PKIB或NAALADL2的表達或阻止其活性、或者抑制PKIB與 PKA-C結合的試劑，或者抗-NAALADL2抗體，可用作抗癌劑，特別是用于治療前列腺癌，尤其 是激素難治性前列腺癌或去勢抵抗性前列腺癌，的抗癌劑。盡管本文對于本發明參考其具體的實施方案進行了詳細的記載，但是本領域的技 術人員顯然可以想到，在不背離本發明精神和范圍的前提下可以在其中進行各種改變和修 飾。
權利要求
一種分離的雙鏈分子，它在被導入細胞中時，在體內抑制PKIB或NAALADL2的表達和細胞增殖，該雙鏈分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
2.權利要求1的雙鏈分子，其中該有義鏈包含與選自SEQID NO :16、17和19的靶序 列對應的序列。
3.權利要求2的雙鏈分子，其長度為大約19-大約25個核苷酸。
4.權利要求2的雙鏈分子，其由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通過間插單鏈連 接在一起的有義鏈和反義鏈。
5.權利要求4的雙鏈分子，其具有通式5’-[A]-[B]-[A’ ]-3’，其中[A]是包含選自 SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3-23個核苷酸組成的間插單鏈，[A，]是 包含與[A]互補的序列的反義鏈。
6.一種載體，其表達權利要求1的雙鏈分子。
7.權利要求6的載體，其中該雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是包 含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間插單鏈， [A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。
8.一種用于治療癌癥的方法，包括施用至少一種分離的雙鏈分子的步驟，該雙鏈分子 抑制PKIB基因或NAALADL2基因在過表達該基因的細胞中的表達，該雙鏈分子包含有義鏈 和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
9.權利要求8的方法，其中該有義鏈包含與選自SEQID N0:16、17和19的靶序列對 應的序列。
10.權利要求9的方法，其中該雙鏈分子的長度為大約19-大約25個核苷酸。
11.權利要求8的方法，其中該雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通過間 插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈。
12.權利要求11的方法，其中該雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’，其中[A]是 包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間插單 鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。
13.權利要求8的方法，其中該雙鏈分子由載體編碼。
14.權利要求13的方法，其中由載體編碼的雙鏈分子具有通式5’-[A]-[B]-[A’]-3’， 其中[A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組 成的間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。
15.權利要求8的方法，其中待治療的癌癥是前列腺癌或激素難治性前列腺癌或去勢 抵抗性前列腺癌。
16.一種用于治療癌癥的組合物，其包含至少一種抑制PKIB或NAALADL2的表達的分離 的雙鏈分子，該雙鏈分子包含有義鏈和與之互補的反義鏈，它們彼此雜交形成該雙鏈分子。
17.權利要求16的組合物，其中該有義鏈包括與選自SEQID NO :16、17和19的靶序 列對應的序列。
18.權利要求17的組合物，其中該雙鏈分子的長度為大約19-大約25個核苷酸。
19.權利要求16的組合物，其中該雙鏈分子由單一多核苷酸組成，該多核苷酸包含通 過間插單鏈連接在一起的有義鏈和反義鏈。
20.權利要求19的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5’-[幻-[8]-仏’]-3’，其中[A]是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈序列，[B]是由3_23個核苷酸組成的 間插單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。
21.權利要求16的組合物，其中該雙鏈分子由載體編碼并包含在該組合物中。
22.權利要求21的組合物，其中該雙鏈分子具有通式5’_[A]-[B]-[A’ ]_3’，其中[A] 是包含選自SEQ ID NO :16、17和19的序列的有義鏈，[B]是由3_23個核苷酸組成的間插 單鏈，[A’ ]是包含與[A]互補的序列的反義鏈。
23.權利要求16的組合物，其中待治療的癌癥是前列腺癌或激素難治性前列腺癌或去 勢抵抗性前列腺癌。
24.一種用于診斷前列腺癌的方法，所述方法包括如下步驟(a)通過選自下組的任何一種方法測定來自受試者的生物樣品中基因的表達水平 (i)檢測包含對應于SEQ ID NO :1、3或5的序列的mRNA，( )檢測包含SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列的蛋白質，和(iii)檢測包含SEQ ID NO :2或4的氨基酸序列的蛋白質的生物活性；和(b)將基因與正常對照水平相比的表達水平增加與前列腺癌相關聯。
25.權利要求24的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去勢抵抗性前列腺癌。
26.權利要求24的方法，其中表達水平比正常對照水平高至少10%。
27.權利要求24的方法，其中通過檢測探針與所述來自受試者的生物樣品的基因轉錄 本的雜交來測定表達水平。
28.權利要求27的方法，其中該雜交步驟在DNA陣列上進行。
29.權利要求24的方法，其中通過檢測抗體與包含氨基酸序列SEQID NO :2或4的蛋 白質的結合來測定表達水平。
30.權利要求29的方法，其中該抗體與由SEQID NO :32、33或34組成的多肽結合。
31.權利要求24的方法，其中該來自受試者的生物樣品包括活檢物、痰、血液或尿。
32.—種抗體，其結合包含SEQ ID NO 33或34的氨基酸序列的蛋白質。
33.一種用于檢測前列腺癌的組合物，其含有結合包含氨基酸序列SEQ IDNO :2或4的 蛋白質的抗體。
34.權利要求33的組合物，其中該抗體結合SEQID NO :32，33或34。
35.篩選可用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使測試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測所述多肽與測試化合物之間的結合活性；和(c)選擇與所述多肽結合的測試化合物。
36.一種篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使測試化合物與由PKIB或NAALADL2多核苷酸編碼的多肽接觸；(b)檢測步驟(a)的多肽的生物活性；和(c)選擇這樣的測試化合物與不存在該測試化合物時檢測到的由PKIB或NAALADL2 多核苷酸編碼的多肽的生物活性相比，該化合物可抑制所述多肽的生物活性。
37.權利要求36的方法，其中該生物活性是易化細胞增殖或PKA-C核積累活性。
38.一種篩選可用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使候選化合物與表達PKIB或NAALADL2的細胞接觸；(b)選擇如下的候選化合物，與不存在該測試化合物時檢測到的PKIB或NAALADL2表達 水平相比，該化合物可抑制所述表達水平。
39.一種篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)使候選化合物與導入了載體的細胞接觸，該載體包括PKIB或NAALADL2的轉錄調節 區和在該轉錄調節區的控制下表達的報告基因；(b)測量所述報告基因的表達或活性；和(c)選擇與對照相比可降低所述報告基因的表達或活性水平的候選化合物。
40.一種篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在測試化合物的存在下，使PKIB多肽或其功能等價物與PKA-C多肽或其功能等價 物接觸；(b)檢測所述多肽之間的結合；和(c)選擇可抑制所述多肽之間結合的測試化合物。
41.權利要求40的方法，其中PKIB多肽的功能等價物包括由SEQID NO 31組成的多肽。
42.權利要求40的方法，其中PKA-C多肽的功能等價物包含PKIB結合域的氨基酸序列。
43.一種篩選用于治療或預防前列腺癌的化合物的方法，該方法包括如下步驟(a)在適合Akt被PKIB多肽磷酸化并有測試化合物存在的條件下溫育PKIB多肽或其 功能等價物、PKA-C多肽或其功能等價物、以及Akt ；(b)檢測Akt的磷酸化水平；和(c)將步驟(b)中測得的Akt的磷酸化水平與對照水平進行比較；(d)選擇與對照水平相比降低Akt磷酸化水平的化合物。
44.權利要求43的方法，其中在SEQID NO 35氨基酸序列的第473位絲氨酸殘基處 檢測Akt的磷酸化水平。
45.權利要求43的方法，其中在細胞中表達PKIB多肽或其功能等價物、PKA-C多肽或 其功能等價物、以及Akt，并且通過使細胞或其裂解物與測試化合物接觸而將它們在測試化 合物存在下進行溫育。
46.權利要求35、36、38、39、40和43的方法，其中前列腺癌是激素難治性前列腺癌或去 勢抵抗性前列腺癌。
全文摘要
本發明的特色是用于檢測前列腺癌，特別是激素難治性前列腺癌(HRPC)或去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)的方法，所述方法系通過檢測與正常器官相比PKIB或NAALADL2的過表達來檢測前列腺癌。還公開了鑒定用于治療和預防前列腺癌(包括HRPC)的化合物的方法，所述方法系基于PKIB或NAALADL2在前列腺癌中的過表達、PKIB或NAALADL2的細胞增殖功能、PKIB或NAALADL2的細胞內定位或PKIB與PKA-C之間的相互作用來鑒定化合物。另外，提供了通過施用針對PKIB或NAALADL2基因的雙鏈分子來治療前列腺癌的方法。本發明還提供了產品，包括雙鏈分子和編碼它們的載體，以及包含可用于本發明所提供方法的分子或載體的組合物。
文檔編號A61K31/70GK101855346SQ20088010985
公開日2010年10月6日 申請日期2008年8月20日 優先權日2007年8月24日
發明者中川英刀, 中村佑輔, 中鶴修一 申請人:腫瘤療法科學股份有限公司