專利名稱：一種篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法及其專用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法及其專用引物。
背景技術(shù)：
水稻是世界上主要糧食作物之一。我國水稻播種面積為2800-3200萬公頃，占全國糧食播種面積的27% ;水稻單產(chǎn)水平達(dá)5. 8-6. 3噸/公頃，稻谷總產(chǎn)量為I. 8-2. O億噸，占糧食總產(chǎn)的39% (農(nóng)業(yè)部，2007中國農(nóng)業(yè)發(fā)展報(bào)告，中國農(nóng)業(yè)出版社，2008，pp6-ll)。水稻生產(chǎn)在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展中起著十分重要的作用，也是我國糧食安全、社會穩(wěn)定和國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的基礎(chǔ)。隨著生活水平的提高，人們對大米的要求不僅僅在于滿足溫飽，而對ロ感和營養(yǎng)提出了越來越高的要求。直鏈淀粉含量是指直鏈淀粉占精米粉干重的百分率，它是鑒定稻米品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，它與米飯的脹性、柔軟性、光澤度、粘性有密切關(guān)系。不同水稻品種直鏈淀粉含量相差較大，水稻直鏈淀粉含量一般分為糯(0飛%)、低(8 15%)、中(15 24%)和高(>24%)四種類型。低直鏈淀粉含量的稻米煮飯脹性小，飯較濕粘有光澤；高直鏈淀粉含量的稻米煮飯脹性大，飯干松而色淡，冷后質(zhì)硬；中等直鏈淀粉含量的稻米飯介于中間，較蓬松而軟，符合大部分人的食味習(xí)慣(吳洪愷，博士學(xué)位論文，揚(yáng)州大學(xué)，2006)。水稻胚乳中直鏈淀粉的合成是由蠟質(zhì)基因(Waxy，/&)編碼的顆粒結(jié)合淀粉合成酶(granule binding starch synthase,GBSS)控制的，該基因同時可控制水稻花粉和胚囊中直鏈淀粉的合成，是ー個組織和發(fā)育特異性表達(dá)的基因。已有研究表明，臉基因變異是導(dǎo)致水稻直鏈淀粉含量變異最主要的原因，也是稻米食味品質(zhì)的主要決定因素。選育優(yōu)質(zhì)不育系和恢復(fù)系來改良和提聞雜交水稻的稻米品質(zhì)，是一條行之有效的技術(shù)路線。多年的育種理論和實(shí)踐證明，雜交稻稻米品質(zhì)與母本(不育系)的關(guān)系更為密切。但就目前生產(chǎn)上來看，父本(恢復(fù)系)的稻米品質(zhì)相對較好，而米質(zhì)優(yōu)、配合力強(qiáng)，有應(yīng)用價值的優(yōu)質(zhì)不育系卻為數(shù)不多，這在相當(dāng)程度上阻礙了優(yōu)質(zhì)雜交稻新組合的選育和推廣。為此，改良或選育具有中等直鏈淀粉含量的水稻育種材料尤其是不育系，已成為當(dāng)今水稻品質(zhì)育種的首選目標(biāo)。眾所周知，直鏈淀粉含量肉眼無法鑒定，化學(xué)測定方法煩瑣，需要樣品量大，耗時耗材，育種低世代選育難度較大。利用分子標(biāo)記技術(shù)可以提高選擇效率和節(jié)約成本。在前人的研究中，發(fā)現(xiàn)阪基因的第一個內(nèi)含子的ー個SNP位點(diǎn)Inl是影響直鏈淀粉ー個重要因素，并開發(fā)出了分子標(biāo)記，但是這個位點(diǎn)的變異只能區(qū)分出低直鏈淀粉含量基因型，不能把中等直鏈淀粉和高直鏈淀粉基因型分開，因此在實(shí)際育種中有很大的局限性。MingHsuanChen 等(Journal of Cereal Science, 2008 (47) : 536 - 545)利用臉基因的 Inl 和 Ex6 兩個位點(diǎn)的SNP來分析171個水稻品種，發(fā)現(xiàn)使用這兩個SNP可以將非糯水稻品種分為三類InlG-Ex6A為高直品種，InlG_Ex6C為中直品種，InlT_Ex6A為低直品種。因此，只要檢測Ex6C就能知道是否是InlG-Ex6C基因型和中直品種。而InlG_Ex6C基因型的水稻品種大多為美洲品種，因此在我國水稻品種中引入中等直鏈淀粉基因型對于改善我國水稻稻米品質(zhì)
3具有重要的意義。對于SNP的檢測現(xiàn)在主要方法是測序法、毛細(xì)管電泳法和HRM法，所需相關(guān)儀器昂貴，成本太高，不適合普遍性推廣；本發(fā)明擬采用等位基因特異性PCR的方法，設(shè)計(jì)四條引物，通過普通的PCR方法就能檢測，簡便快捷，成本低廉。通過基因的分子標(biāo)記，可以在基因型水平上直接進(jìn)行鑒定和輔助選擇，可以大大提高對目標(biāo)性狀的選擇效率，縮短育種周期。利用分子標(biāo)記技術(shù)，加快了中直基因選育的進(jìn)程，節(jié)省成本，提高育種效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供ー種輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法及其專用引物。本發(fā)明所提供的輔助篩選水稻的引物Wx_Ex6，包含序列表中的4條核苷酸序列Wxin陽性水稻檢測有1025bp和766bp的兩個條帶，陰性水稻檢測有1025bp和310bp的兩個條帶的條帶，對Wxin雜合水稻檢測有1025bp、766bp和3IObp的三個條帶。本發(fā)明所提供的輔助篩選水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，是由序列表中WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列的4條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如該待測水稻的擴(kuò)增產(chǎn)物中有766bp的條帶，則該待測水稻為候選水稻。可通過濃度為I. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中是否有目的條帶。所述PCR擴(kuò)增體系可為水稻基因組DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶I U，I. 5μ I10XPCR緩沖液(IOOMm Tris-HCl (pH8. 3), 500Mm KCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol eachdNTPs 0. 6ul，四條引物各0. 2μ Μ，最后用ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 μ I。所述PCR 反應(yīng)條件可為先 95°C 5min;隨后 95°C 30sec，55°C 30sec, 72°C40sec，共35個循環(huán)；然后72°C 5min。由于水稻中圖位克隆的基因還很少，所以絕大部分分子標(biāo)記輔助選擇都是用的連鎖標(biāo)記，在實(shí)際應(yīng)用中會有一定的交換和誤差。本發(fā)明根據(jù)水稻中直(中等直鏈淀粉，下同)基因Wxin的核苷酸序列設(shè)計(jì)的基因內(nèi)功能性共顯性標(biāo)記。共顯性標(biāo)記與顯性標(biāo)記相比，可以排除實(shí)驗(yàn)中假陰性的影響，同時可以檢測基因是否純和，具有更好的準(zhǔn)確性和精確性。本發(fā)明標(biāo)記的隱性條帶和陽性條帶差異較大，可以用I. 5%左右的瓊脂糖電泳檢測，比一般的PAGE電泳檢測的方法更簡單方便，同時節(jié)省成本。本發(fā)明的特異引物是由本發(fā)明的輔助篩選水稻的方法可用于選育中等直鏈淀粉含量水稻，降低成本，縮短育種周期，具有準(zhǔn)確性高，操作簡單，成本低廉，周期短的特點(diǎn)，適于推廣應(yīng)用，為選育中等直鏈淀粉含量水稻種質(zhì)提供了一種快捷的選擇方法。


圖I為本發(fā)明的分子標(biāo)記Wx-Ex6對實(shí)施例2中巨風(fēng)A//天豐A/J521的F6代育種群體分子檢測示意圖。下面結(jié)合附圖及具體實(shí)施對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I
用本發(fā)明中的專用引物Wx-Ex6對200份中國栽培稻微核心種質(zhì)和95份國外引進(jìn)種核
4心種質(zhì)進(jìn)行了分子檢測，其中包含111個秈稻品種和89個粳稻品種。DNA提取采用常規(guī)的CTAB提取法。PCR擴(kuò)增體系為水稻基因組DNA模板50ng，Taq DNA聚合酶I U，I. 5μ I 10XPCR緩沖液(IOOMm Tris-HCl (pH8. 3), 500Mm KCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol each dNTPs 0. 6ul，四條引物各0.2 μ Μ，最后用ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 μ I。PCR 反應(yīng)條件可為先 95で 5min;隨后 95で 30sec,55°C 30sec,72°C 40sec，共35個循環(huán)；然后72°C 5min。PCR產(chǎn)物檢測將PCR產(chǎn)物，上樣于I. 5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測PCR產(chǎn)物帶型。分子結(jié)果表明，200份核心種質(zhì)中有17個品種的擴(kuò)增產(chǎn)物中有766bp的條帶，即這17個核心種質(zhì)表現(xiàn)為中直等位基因型ry'比例為8.5%，其中秈稻品種2個(占秈稻品種總數(shù)的I. 80%):包協(xié)-7B、鹽水赤;粳稻品種15個(占粳稻品種總數(shù)的16. 9%):臺東陸稻、高陽淀稻、木樨球、肥東塘稻、本邦谷、黑芒稻、葡萄黃、半節(jié)芒、中樓一號、興國、葉里藏花、百歌稻、毫巴永、冷水谷、拉木加。說明中直基因型在中國水稻品種中是ー種很稀少的基因型。對這17份品種進(jìn)行直鏈淀粉含量(AAC)測定表明，他們的AAC介于15. 0%和21. 6%之間，平均值20. 0%，這與分子檢測的結(jié)果是完全吻合的。95份國外引進(jìn)種核心種質(zhì)中，有18個是中直的，他們的AAC介于15. 4%和21. 5%之間，平均值17. 6%。其中55個亞洲品種、10個歐洲品種和10個美洲品種中各有4個是中直的，10個非洲品種6個是中直的，10個大洋洲沒有中直的。非洲的中直比例最大，大洋洲最少。說明利用非洲稻等國外引進(jìn)中等直鏈淀粉水稻來改良國內(nèi)水稻品種，不僅可以針對性改良品質(zhì)，還可以拓寬我國水稻的遺傳背景，打破目前雜種優(yōu)勢利用的瓶頸，進(jìn)ー步提高水稻產(chǎn)量。實(shí)施例2
首先在田間種植上述巨風(fēng)A//天豐A/ J521的F6代育種群體，共114個株系J521含有中直品種Lemont的血緣，巨風(fēng)和天豐則都是高直品種。在苗期采用本發(fā)明方法及提供的分子標(biāo)記Wx-Ex6進(jìn)行檢測。DNA提取、PCR擴(kuò)增體系和PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物檢測方法與實(shí)施例I相同。對這114個株系提取DNA，進(jìn)行上述檢測過程，如圖I所示，最左邊的條帶是分子量對照Marker DL2000, Pl就是陽性親本Lemont的帶型，條帶大小是1025和766bp ；P2就是陰性親本巨風(fēng)A的帶型，條帶大小是1025和310bp ；1-20是待檢測的20個水稻株系，表現(xiàn)和Pi條帶大小一致的是ry"陽性水稻，和P2條帶大小一致的的是Zfy'"陰性水稻，同時具有1025、766和310bp三個條帶的是ry"雜合水稻。圖I中P為中直純和陽性，N為陰性，H為中直雜合陽性，圖I中有9個株系呈中直陽性，其中6個株系為純和，3個株系為雜合。按本發(fā)明及圖I所示檢測方法，對114個株系進(jìn)行上述檢測，結(jié)果顯示50個株系的擴(kuò)增產(chǎn)物中有766bp的條帶，即表現(xiàn)為中直基因型ry'其中47個純和，3個雜合。對這個50個陽性株系和114個株系中的另外5個陰性株系進(jìn)行了直鏈淀粉測定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性單株的直鏈淀粉含量都在24%以上，屬于高直類型；47個中直純和陽性株系的直鏈淀粉含量在16. 0-20. 9%之間，平均值為17. 7%，3個中直雜合陽性株系的直鏈淀粉含量分別為16. 2%、17. 2%和17. 6%，50個株系都屬于中直類型。標(biāo)記和表型吻合度為100%，說明分子標(biāo)記輔助選擇的結(jié)果是有效的。陽性株系的直鏈淀粉含量有一定的波動，說明稻米直鏈淀粉含量由
5主效基因ぬ控制，但是還受到其他微效基因的影響，這與前人研究的結(jié)果也是一致的。
權(quán)利要求
1.ー種輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的引物，包含序列表中的4條核苷酸序列WxMF CAACCCATACTTCAAAGGAACATC, WxMR GGCGGTGATGTACTTGTCC, WxH CTGGAGAAGGTGGAGTC和 WxHR GATCTTGAGATCAATTGTAACTCACGAT
2.ー種輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法，以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用序列表中 WxMF :CAACCCATACTTCAAAGGAACATC、WxMR :GGCGGTGATGTACTTGTCC、WxHF CTGGAGAAGGTGGAGTCAT 和 WxHR GATCTTGAGATCAATTGTAACTCACGAT 的核苷酸序列的 4 條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，如該待測水稻的擴(kuò)增產(chǎn)物中有766bp的條帶，則該待測水稻為候選中等直鏈淀粉含量水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增體系為水稻基因組DNA模板 50ng，Taq DNA 聚合酶 I U, I. 5μ I 10父？0 緩沖液(100馳1^8-!1(1 (pH8. 3), 500MmKCl),25mM MgCl2 O. 9ul,2. 5 mmol each dNTPs 0. 6ul，四條引物各 0. 2 μ M，最后用 ddH20補(bǔ)充反應(yīng)體系至15 μ I。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述PCR反應(yīng)條件為先95°C5min ；隨后 95°C 30sec，55°C 30sec, 72°C 40sec，共 35 個循環(huán)；然后 72°C 5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述檢測擴(kuò)增產(chǎn)物帶型的方法是進(jìn)行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法與其專用引物。輔助篩選水稻的引物，是由序列表中序列WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列組成的四條引物。該輔助篩選水稻的方法，是以待檢測水稻的基因組DNA為模板，用序列表中序列WxMF、WxMR、WxHF和WxHR的核苷酸序列組成的四條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，如該待測水稻的擴(kuò)增產(chǎn)物有766bp的條帶，則該待測水稻為候選水稻。本發(fā)明的輔助篩選中等直鏈淀粉含量水稻的方法可用于選育中等直鏈淀粉含量水稻，縮短水稻的育種周期，加快育種速度，降低育種成本，具有操作簡單，成本低廉，周期短的優(yōu)點(diǎn)，適應(yīng)于推廣應(yīng)用，為選育中等直鏈淀粉含量水稻品種提供了一種快捷的檢測方法。
文檔編號C12N15/11GK102912014SQ201210361030
公開日2013年2月6日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者游艾青, 周雷, 陳志軍, 馬銀花, 陳少愚, 楊國才, 李三和, 劉凱, 胡剛, 閘雯俊 申請人:湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所