專利名稱：以海水為介質生產燃料用碳氫化合物的方法及專用菌株的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種以海水為介質生產燃料用碳氫化合物的方法及專用菌株。
背景技術：
幾個世紀以來，常規的化石能源一直支撐著工業文明的發展。但是由于化石能源的不可再生性，地球億萬年積存下的寶貴資源在人類高強度開采與消費下最終會消耗殆盡。同時過度使用化石資源所帶來的氣候變化、環境污染等問題也將使人類付出巨大的代價。能源供應問題將成為制約我國未來社會經濟可持續發展的重要因素。為保證能源供應的獨立性和可持續性，目前各國掀起了一場能源和化工領域新技術浪潮，即用“細胞工廠與生物合成”逐步替代傳統的化工工藝。利用生物技術以可再生生 物資源為原料生產生物燃料和各種化工原料和產品更是其中的熱點。與傳統的化石燃料相比，生物燃料具有可再生、無毒、可降解的特點，并能有效減少有害氣體和顆粒物的排放，是優質的化石燃料替代品，故又稱其為“綠色燃料”。但目前上市的生物燃料主要來源于玉米淀粉的發酵反應以及大豆、油菜籽、棕櫚油中三酰甘油的體外轉酯化反應，其成分為乙醇、脂肪酸甲酯或乙酯等。這種利用糧食作物為原料生產生物燃料的方法已經產生了與人爭糧、占用大量的耕地的情況；傳統的發酵工藝需要消耗大量的淡水作為介質，反應后產生大量不易處理的廢水，既消耗了資源又污染了環境。為了提高生物燃料的實用性和應用范圍，著力于開發新的催化方法和工藝流程，尋找更高效的轉化酶以及優化酶的使用方法，擴展可利用的原料以及發酵介質范圍成為必須。在此基礎上，通過改造微生物的代謝途徑，使其能利用廉價的非糧油類原料如纖維素等，直接在生物體內生產生物燃料，從而擺脫一系列的高能耗生產過程，降低成本。

發明內容
本發明的一個目的是提供一株鹽單胞菌(Halomonas sp.)。本發明提供的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21，其保藏編號為CGMCC No. 6593。上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21在制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸中的應用也是本發明保護的范圍；上述應用中，所述脂肪酸具體為C16脂肪酸，也稱為棕櫚酸。可以利用合成生物學的方法對上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21進行基因重組，修飾其代謝通路，使該基因工程菌株在能夠利用多種碳、氮源的基礎上，表達編碼催化生產碳氫化合物的酶的相關基因。因此，本發明另一個目的是提供一種重組菌。本發明提供的重組菌，為將酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因均導入宿主菌中，得到重組菌。上述重組菌中,宿主菌為鹽單胞菌(Halomonas sp.);本發明的實施例中具體采用鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 ；上述酰基酰基載體蛋白還原酶和上述乙醛脫羧酶具體均來自藍細菌；本發明的實施例中藍細菌具體為集胞藍細菌(Synechocystis sp.)或念珠藍細菌(Nostoc sp.)。上述重組菌中，將酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因均導入宿主菌為將含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段導入宿主菌；所述含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段的核苷酸序列為序列表中的序列I或序列表中的序列4。上述重組菌為如下重組菌A或重組菌B
重組菌A為將來自集胞藍細菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段(序列I)導入鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21中；具體本發明中導入來自集胞藍細菌(Synechocystis sp.)的含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段通過重組載體A導入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21中，該重組載體A為將序列表中的序列I插入載體pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位點間得到表達酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶。集胞藍細菌(Synechocystis sp.)中的酰基酰基載體蛋白還原酶的氨基酸序列為序列表中的序列2 ;所述酸基酸基載體蛋白還原酶的基因的核昔酸序列為序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸；乙醛脫羧酶的氨基酸序列為序列表中的序列3 ;所述酰基酰基載體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸。重組菌B為將來自念珠藍細菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段(序列4)導入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS21中；具體本發明中導入來自念珠藍細菌(Nostoc sp.)的含有酰基酰基載體蛋白還原酶的編碼基因和乙醛脫羧酶的編碼基因的片段通過重組載體B導入鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21中，該重組載體B為將序列表中的序列4插入載體pBBRlMCSl的XbaI和BamH I位點間得到表達酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶。念珠藍細菌(Nostoc sp.)中的酰基酰基載體蛋白還原酶的氨基酸序列為序列表中的序列5 ;所述酰基酰基載體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸；乙醛脫羧酶的氨基酸序列為序列表中的序列6 ;所述酰基酰基載體蛋白還原酶的基因的核苷酸序列為序列表中序列4自5’末端第I位-696位核苷酸。上述重組載體還包含可操作地連接到所述核苷酸序列的啟動子。所述啟動子是具有調節細胞器特異性、組織特異性、誘導型、組成型或細胞特異性表達的啟動子。在具體實施方案中，所述重組載體包含具有以下特征的序列(I)可操作地連接到所述核苷酸序列的調節序列；(2)可操作地連接到所述核苷酸序列的選擇標記；(3)可操作地連接到所述核苷酸序列的標記序列；(4)可操作地連接到所述核苷酸序列的純化部分；(5)可操作地連接到所述核苷酸序列的目的基因表達序列。在某些實施方案中，所述核苷酸序列被穩定整合到所述宿主細胞的基因組中，并且該核苷酸序列的表達受可調節啟動子的控制。上述的重組菌在制備烷烴中的應用也是本發明保護的范圍。上述應用中，所述烷烴具體為十三烷、十五烷和/或十七烷；本發明的第三個目的是提供一種發酵培養基，該發酵培養基可用來培養鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21 或上述重組菌。本發明提供的發酵培養基，由C源、N源和海水組成；所述C源為秸桿纖維素浸提液、油酸、動物脂肪和可溶性淀粉中的至少一種；所述N源為大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一種；所述海水為天然海水或人工海水；所述秸桿纖維素浸泡液按照如下方法制備將秸桿在NaOH水溶液浸泡，收集液體即為秸桿纖維素浸泡液。具體按照如下方法制備將秸桿在濃度為lg/L、pH值為14的NaOH水溶液4°C浸泡48h，收集液體即為秸桿纖維素浸泡液；其中秸桿為氣爆處理后的秸桿；在本發明的實施例中采用氣爆處理后的玉米秸桿，具體方法為將含水量10-35%的玉米秸桿在蒸汽壓力I. 0-1. 5MPa的條件下進行蒸汽爆破處理O. 5h，烘干得到氣爆處理后的秸桿。上述發酵培養基由所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水組成；所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白和所述乳清蛋白的配比為 150-400mL 5-20mL :3_10g :5_20g :l_4g 2g ；其中，所述動物脂肪具體為家禽脂肪；所述家禽脂肪進一步具體為豬肉脂肪；所述發酵培養基的pH值為5. 0-11. O，具體為5. O或9. O或11.0 ;所述天然海水中NaCl的終濃度為20g/L至50g/L。上述培養基中，大豆蛋白為大豆蛋白粉，乳清蛋白為乳清蛋白粉。上述發酵培養基中，人工海水的配方為Mocledon配方，與天然海水的成分基本一致，廣泛用于海產品養殖，其用來配置發酵培養基后NaCl的終濃度具體為26. 726g/L ；上述發酵培養基中，天然海水(NaCl含量約為26g/L)，用來配置發酵培養基后發酵培養基中所含主要離子含量如下Na+3537. 73mg/L、Mg2+543. 97mg/L、Ca2+210. 33mg/L ；K+105. 84mg/L ；0Γ7559. 70mg/L、S02_591. 75mg/L、Li + 193. 0 μ g/L、Al2+3. 788 μ g/L、Br_37. 93 μ g/L;天然海水于2012年8月2日采集于天津港碼頭近岸海邊，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶內密封保存。本發明發酵培養基中的C源和N源，包括但不僅限于經預處理的纖維素、半纖維素、飽和及不飽和長鏈脂肪酸(油脂)、淀粉等農業、林業、城市餐廚垃圾等廢棄物。這些廢棄物經不同方法的預處理后，構成了除必要微量元素外的主要發酵用碳、氮源。本發明的第四個目的是提供一種制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法。本發明提供的方法，為發酵上述的鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21，即得到聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸。上述方法中，所述脂肪酸為C16脂肪酸。上述方法中，在發酵后還包括將發酵產物收集菌體、酯化，獲得聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸。本發明的第五個目的是提供一種制備烷烴的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟發酵上述的重組菌，即得到烷烴；所述烷烴具體為十二燒、十五燒和/或十七燒。在上述制備烷烴的方法中，在發酵后包括如下步驟收集發酵產物用甲醇或環己烷萃取，收集有機相得到烷烴。
在上述制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法或制備烷烴的方法中，發酵采用的培養基為上述發酵培養基。上述方法中，所述發酵的溫度為20°C -45°C，具體為20°C或42°C或45°C ;所述發酵的轉速為IOOrpm (旋轉半徑15mm);所述發酵時間為24至96小時。在上述發酵過程中，對于鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21而言，包括野生菌株及基因重組菌株，高鹽濃度及堿性PH環境是其生長所必須的，本發明中應用的人工海水提供了平均35g/L的鹽分濃度，對廢棄物的前處理所用的堿處理方法使培養基的pH值維持在11左右，這樣的高鹽高堿的生產生長條件能抑制其他非嗜鹽菌的生長，使無滅菌生產工藝成為可能，極大的降低了滅菌過程所需的能耗，從而降低了成本。本發明的實驗證明，本發明自主篩選的一株野生鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS21，并以其為基礎，通過基因工程改造構建重組菌，該野生菌和重組菌均可以在以天然海水或人工海水配置的發酵培養基中，生產以主要組成為烷烴、烯烴及長鏈脂肪酸的碳氫化合 物，此類碳氫化合物經分離后可作為生物燃料使用；且發酵過程可以實現不滅菌連續發酵。本發明中的鹽單胞菌及其重組菌株營養要求簡單、發酵過程無需滅菌且可連續進行，簡單易控、低成本、具有良好的工業應用前景。在本說明書中，使用了縮寫基因名稱或多肽名稱引用，該縮寫基因或多肽名稱表示基因或多肽的種類。這些基因包括編碼相同多肽和具有相同生理功能同源多肽的部分基因。多肽包括具有相同活性(同工酶)的所有多肽。本文引用的登錄號來自美國國立衛生研究院(National Institute ofHealth, U. S. A)所維護的NCBI數據庫(國家生物技術信息中心(National Center forBiotechnologyInformation))。除非另作說明，登錄號按照截止到2012年五月的數據庫中提供的。本文所述的碳氫化合物，包括但不僅限于烷烴、烯烴、脂肪酸、酯、醛及脂肪醇等。其中烷烴表示僅含有單一碳-碳鍵的碳氫化合物，其碳原子數至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、
10、11、12、13、14、15、16、17、18、19 或 20 個碳。上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6593,分類命名為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。


圖I為野生型LS21在海水配制的多碳源培養基中的生長情況(框內)圖2為LS21在秸桿纖維素為唯一碳源的培養基中積累PHA的GC分析圖(框內)圖3為LS21在人工海水配制的培養基中積累PHA (實線框內)和C16的脂肪酸的GC分析圖(虛線框內)圖4為含有表達來源于集胞藍細菌的酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產生烷烴的GC圖譜圖5為含有表達來源于念珠藍細菌的酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產生烷烴的GC圖譜
圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標準品GC圖譜圖7為重組LS21B產生烷烴和烷烴標準品的復合比較的GC圖譜
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。實施例I、鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21的分離鑒定及生長特性一、菌株LS 21分離從新疆達坂城鹽湖中取得土樣和水樣，以纖維素為唯一碳源從中分離菌株。得到 5株可產利用纖維素為唯一碳源生長的菌種，選擇其中一株生長良好并可積累的PHA菌株命名為LS 21。纖維素培養基的制作將秸桿纖維素浸泡液用紗布過濾，濾去殘留秸桿，按比例加入NaCl (40g/L)及組分I及微量元素混合溶液，用NaOH溶液調pH值至10，待沉淀析出后，在5000rpm下離心5min，保留上清液作為秸桿纖維素培養基。稻桿纖維素浸泡液稱取氣爆處理后的稻桿(將含水量10 35%玉米稻桿在蒸汽壓力I. O I. 5MPa的條件下進行蒸汽爆破處理O. 5h烘干獲得)6g，加入500mL用去離子水配置的NaOH水溶液(lg/L, pH=14),置于4°C下浸泡48h,收集液體得到稻桿纖維素浸泡液。組分I :1. 5g/L磷酸二氫鉀、9. 65g/L十二水合磷酸氫二鈉，配制成50倍母液，121°C滅菌20分鐘；微量元素混合溶液微量元素I 10mL/L、微量元素II lmL/L，配制成50倍母液，母液pH值調節至4. 0-5. 0,121。。滅菌20分鐘；微量元素I和微量元素II配制同下；I升所述微量元素I按照如下方法制備將檸檬酸鐵銨5g、二水合氯化鈣2g和O. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用O. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素I ;I升微量元素II按照如下方法制備將七水合硫酸鋅lOOmg、四水合氯化錳30mg、硼酸300mg、六水合氯化鈷200mg、五水合硫酸銅10mg、六水合氯化鎳20mg、二水合鑰酸鈉30mg和0. 5mol/L鹽酸水溶液混合，用0. 5mol/L鹽酸水溶液補足至I升，得到所述微量元素II。基底、組分I、組分II、微量元素分別單獨滅菌，冷卻后，分別取20mL組分I母液、20mL組分II母液和20mL微量元素母液加入基底。在實際培養過程中，可向上述培養基中再添加一定濃度的抗生素以維持質粒的穩定性，如100 μ g/mL氨節青霉素，50 μ g/mL硫酸卡那霉素和34 μ g/mL的氯霉素等。分離培養基氯化鈉60g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉lg/L，其余組分為水，pH值約為
8.O。二、菌株鑒定I、形態鑒定取15%甘油管冷凍保藏的的LS21菌液，將菌液濃度稀釋至104cfu/mL，取100 μ L涂布于LB平板(組分同分離培養基)，37°C培養箱培養48小時，觀察菌落形態菌落呈圓形，直徑約I 一 2_，邊緣光滑，濕潤，灰白色半透明，顯微鏡下觀察菌體呈短桿狀。2、生理生化鑒定對LS21菌株進行革蘭氏染色鑒定，結果為革蘭氏陰性菌。3、分子鑒定檢測LS21菌株的16S rDNA序列，擴增16S rDNA序列的引物為通用引物16F5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16R 5’ -ACGGCTACCTTGTTACGACT-3’。測得的序列如序列表中的序列 所示。將該序列在NCBI中比對，結果該菌株與Halomonas sp.相似度達99%。綜合以上鑒定結果,將LS21菌株鑒定為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。上述菌株LS21已于2012年9月20日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏號為CGMCCNo. 6593,分類命名為鹽單胞菌(Halomonas sp.)。實施例2、鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21CGMCC No. 6593利用海水為介質發酵中的應用I、海水配制發酵培養基利用海水和餐廚垃圾即節約成本又節能環保，因此可以采用其作為培養基原料，基于上述目的，開發研究利用海水為介質的發酵培養基可以采用天然海水，也可以采用與其組分相同或非常近似的人工海水配方(Mocledon配方)配置模擬；餐廚業有機垃圾中水分約占79%、干物料中粗脂肪約為29%、粗蛋白約占20%、淀粉占31%，可以采用混合C源、N源及相應的配比模擬。·
天然海水(NaCl含量約為26g/L)，用來配置發酵培養基后發酵培養基中所含主要離子含量如下Na+3537. 73mg/L、Mg2+543. 97mg/L、Ca2+210. 33mg/L ；K+105. 84mg/L ；0Γ7559. 70mg/L、S02_591. 75mg/L、Li+193. 0 μ g/L、Al2+3. 788 μ g/L、Br_37. 93 μ g/L ;天然海水于2012年8月2日采集于天津港碼頭近岸海邊，海水置于聚四氟乙烯塑料瓶內密封保存。與下面人工海水相比，主要元素含量無顯著差異。人工海水的配方為Mocledon配方，每升去離子水中加入以下組分(為在發酵培養基A中的終濃度)氯化鈉(NaCl) 26. 726g/L，氯化鎂(MgCl2) 2. 26g/L,硫酸鎂(MgSO4) 3. 248g/L，氯化鈣(CaCl2) I. 153g/L,碳酸氫鈉(NaHCO3) O. 198g/L,氯化鉀(KCl)O. 721g/L，溴化鈉(NaBr)O. 058g/L，硼酸(H3BO3)O. 058g/L，硅酸鈉(Na2SiO3)O. 0024g/L，硅酸鈉(Na2Si4O9) 0.0015g/L，磷酸(H3PO4) 0. 002g/L，六氯化二鋁(Al2Cl6) 0. 013g/L,氨(NH3) 0. 002g/L，硝酸鋰(LiNO3)O. 0013g/L。每IL發酵培養基A (利用人工海水為介質)按照如下方法制備將200mL實施例I得到的秸桿纖維素浸提液、IOmL油酸、5g豬肉脂肪(市售的豬肉，取脂肪組織，將該脂肪勻漿成糊狀)、IOg可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉和2g乳清蛋白粉混合，用人工海水補齊體積，用5M的NaOH溶液調節體系的pH值至11。每IL發酵培養基B (利用天然海水為介質)按照如下方法制備僅將發酵培養基A中的人工海水替換為天然海水。每IL含有微量元素發酵培養基按照如下方法制備將200mL實施例I得到的秸桿纖維素浸提液、IOmL油酸、5g豬肉脂肪、IOg可溶性淀粉、2g大豆蛋白粉、2g乳清蛋白粉和20mL由實施例I制備的微量元素混合溶液混合，用人工海水補齊體積，pH值為11。2、發酵I)細胞干重檢測3組發酵A組(LS 21 seawater):每個500mL的三角瓶裝入60mL發酵培養基A,接入鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21CGMCC No. 6593,42°C, IOOrpm (旋轉半徑 15mm)下發酵培養 3 天，得到發酵液。
D組每個500mL的三角瓶裝入60mL發酵培養基B,接入鹽單胞菌(Halomonassp. ) LS 21CGMCC No. 6593,42°C, IOOrpm (旋轉半徑15mm)下發酵培養3天，得到發酵液。B組(加微量元素，LS 21seawater+MM):每個500mL的三角瓶裝入60mL含有微量元素發酵培養基，接入鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21CGMCC No. 6593，42°C，IOOrpm (旋轉半徑為15mm)下發酵培養3天，得到發酵液。取各組25mL發酵液10000轉/分離心10分鐘收集菌體，用去離子水洗滌兩次，冷凍冰干。冰干后菌體稱重計算細胞干重(CDW)。每個處理設3個平行。部分結果如圖I所示，A組(LS 21seawater)在不添加微量元素的發酵培養基A中生長，CDW可達到4. 06g/L ；B組(加微量元素，LS 21seawater+MM)在添加微量元素的發酵培養基中生長，CDW可達到4. 65g/L。而D組在發酵培養基B中生長，CDff結果與A組無顯著差異。從上述結果可以看出，微量元素不會顯著影響LS21生長，在不添加微量元素的發酵培養基A和發酵培養基B仍可以很好生長，另外，天然海水和人工海水不會顯著影響LS21生長。因此，處于成本考慮，采用發酵培養基A或發酵培養基B進行下述研究。2) LS 21在唯一碳源的培養基中可產生PHA (聚羥基脂肪酸酯)3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB)為PHA中的單體,可以用來檢測是否產生PHA。每IL對照培養基(秸桿纖維素為唯一碳源的培養基):將由實施例I得到的秸桿纖維素浸泡液按比例加入NaCl (40g/L)及由實施例I中的組分I及由實施例I中的微量元素混合溶液，用5M的NaOH溶液將pH值調至10，待沉淀析出后，在5000rpm下離心5min，保留上清液作為秸桿纖維素培養基。C組(稻桿纖維素為唯一碳源)每個500mL的三角瓶裝入60mL對照培養基,接入鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21CGMCC No. 6593，42°C，IOOrpm 下發酵培養 3 天。取 25mL發酵液10000轉/分離心10分鐘收集菌體，用去離子水洗滌兩次，冷凍冰干，C組CDW為3. 17g0取C組獲得的30mg冰干后菌體進行酯化，氣相色譜(GC)檢測PHA含量，每個處理設3個平行。酯化方法為取30mg冰干菌體于酯化管中，加入2mL氯仿、2mL酯化液混勻，加蓋密閉，100°C烘箱中酯化4小時。冷卻至室溫后，加入ImL蒸餾水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水完全分離后，取氯仿相進行氣相色譜分析。IL酯化液配置方法Ig苯甲酸、30mL濃硫酸溶于970mL甲醇,得到酯化液。同時取IOmg的標樣物質進行酯化。標準品為3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB),內標為苯甲酸Benzoic Acid (購自國藥集團化學試劑北京有限公司；產品目錄號30018760)。氣相色譜(GC)分析依照島津公司GC-2014 (SHIMADZU, Japan)氣相色譜儀的說明書操作氣相色譜儀。設定柱頭溫度為80°C，進樣器溫度為240°C，檢測器溫度為250°C，柱頭壓力為O. 25MPa，程序升溫條件為80°C I. 5分鐘，以35°C /分的速度升溫至140°C，再由40°C /分的速度升溫至280°C并在此溫度保持2分鐘。使用自動進樣器進樣，樣品進樣量為I μ I。結果圖2所示,在如上氣相色譜條件下,標準品3-輕基丁酸(3-hydroxybutyricacid, 3HB)的保留時間2. 5±0. Imin，內標苯甲酸的保留時間為3. 7±0. Imin。樣品中3HB的保留時間2. 4min,內標苯甲酸的保留時間為3. 7min ;可以看出，發酵培養LS21產生了 3HB，C組產生3HB的含量為菌體干重的27. 19±6. 07%，從而證明其可積累PHA。可以看出，LS 21在秸桿纖維素為唯一碳源的培養基中可產生3HB和PHA。3)在混合碳源的發酵培養基中發酵產生PHA和C16脂肪酸··分別取上述A組(發酵培養基A)、B組(含有微量元素發酵培養基)和D組(發酵培養基B)的30mg冰干后菌體進行酯化，氣相色譜(GC)檢測3HB含量，每個處理設3個平行。氣相色譜(GC)分析依照島津公司GC-2014 (SHIMADZU, Japan)氣相色譜儀的說明書操作氣相色譜儀。設定柱頭溫度為80°C，進樣器溫度為240°C，檢測器溫度為280°C，柱頭壓力為
O.25MPa，程序升溫條件為80°C 2. 5分鐘，以35°C /分的速度升溫至140°C，再由30°C /分的速度升溫至280°C并在此溫度保持2分鐘。使用自動進樣器進樣，樣品進樣量為I μ I。標準品為標準品為3-輕基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB),內標為苯甲酸Benzoic Acid (購自國藥集團化學試劑北京有限公司；產品目錄號30018760);棕櫚酸(又稱為C16的脂肪酸)購自東京化學試劑公司(TCI TOKYO CHEMICAL INDUSTRY Co. LTD)。部分結果如圖3所示，A為LS21在發酵培養基A (不加微量元素的人工海水培養基)中可以積累3HB和C16的脂肪酸(A組)，B為LS21在含有微量元素發酵培養基中可以積累3HB和C16的脂肪酸(B組)；在如上氣相色譜條件下，標準品中3-羥基丁酸(3-hydroxybutyric acid, 3HB)的保留時間2. 299min,內標苯甲酸的保留時間為3. 915min ；樣品中3HB的保留時間2. 300min,內標苯甲酸的保留時間為3. 908min ;可以看出，在發酵培養基A中發酵LS21可積累少量3HB，并能積累占菌體干重27. 37%的C16的脂肪酸(虛線框中色譜峰)。A組產生3HB的含量為菌體干重的9. 17± I. 01% ;B組產生3HB的含量為菌體干重的 4. 34 ± O. 42%ο檢測D組的結果為LS21在發酵培養基B (天然海水配制培養基)中也可以積累3HB.PHA和C16的脂肪酸，產生3HB的含量與A組無顯著差異。實施例2、利用LS21制備產生烷烴的重組菌一、利用LS21和集胞藍細菌相關基因制備產生烷烴的重組菌A通過導入集胞藍細菌(Synechocystissp. )PCC6803 (記載在 Accumulation ofpoly-β -hydroxybutyrate in cyanobacterium Synechocystissp. PCC6803,吳慶余等，Bioresource Technology, 76卷,第2期,2001, P85-90,公眾可從清華大學獲得)。菌株編碼的酰基酰基載體蛋白還原酶(acyl-acyl carrier protein reductase)和乙醒脫羧酶(aldehyde decarbonylase)的基因在LS21中異源產生烷烴。集胞藍細菌PCC6803的酰基酰基載體蛋白還原酶(sll0208 ;NP442147)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列2 ;集胞藍細菌PCC6803的乙醛脫羧酶(sll0209 ；NC_000911. I)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列3。I、構建重組菌LS21A以提取的集胞藍細菌PCC6803總DNA為模板，分別使用引物6803-F gtggTCTAGAcctcccccccagcaacttagactag (酶切位點為XbaI酶切位點(大寫部分))與引物6803-R ccggGGATCCccagcagcattgagctttgataatt (酶切位點為BamH I酶切位點(大寫部分))擴增，得到約2kb的PCR產物，經過測序，該PCR產物為含有酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的片段，具有序列表中序列I所示的核苷酸，其中序列表中序列I自5’末端第I位-1023位核苷酸為酰基酰基載體蛋白還原酶編碼基因，序列I自5’末端第1242位-1937位核苷酸為乙醛脫羧酶編碼基因。PCR擴增結束后，使用溶液回收純化的方法，純化PCR產物。將純化PCR產物經XbaI和Bam I酶切后，與經過同樣酶切的載體pBBRlMCSl (記載在 Kovach, Μ. E. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vectorpBBRlMCS, earring different antibiotic-resistant cecassettes. Genel66(1995)175 -176，公眾可從清華大學獲得)連接，得到重組質粒命名為pBBRlMCSl-A，經過測序，該重組質粒為將序列表中序列I插入pBBRlMCSl的XbaI和BamH I酶切位點間得到的載體。將重組質粒pBBRlMCSl-A轉化到大腸桿菌S17-1 (記載在Plasmid cloningvectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to Streptomycesspp. M. Bierman et al.，GENE, 116卷,第I期，1992, P43-49,公眾可從清華大學獲得)感受態細胞中，在含有25 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆的質粒，為pBBRlMCSl-A，將含有該質粒的陽性克隆命名為S17-l/pBBRlMCSl_A。挑取S17-l/pBBRlMCSl_A菌落，在液體Lb培養基中培養至對數期，將S17-1/pBBRlMCSl-A和野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21 (實施例I得到)共培養，進行接合轉化，得到重組菌LS21A。具體如下分別取供體菌S17-1/PBBR1MCS1-A和受體菌野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. ) LS 21菌液各ImL, 6000rpm, I. 5min離心,去上清；再分別用普通LB和加鹽LB (NaCl 35g/L，pHIO)分別清洗供體菌和受體菌一次，重懸浮；取400ul供體菌和受體菌混合，6000rpm，I. 5min離心，去上清；用lOOulLB液體將混合物重懸浮，將所得菌液滴在LB (NaCl 20g/L不調pH不加抗生素)平板上，待菌液吹干后在37°C恒溫培養箱中正向靜置培養6h;用ImL液體LB (NaCl 35g/L，pHIO)將平板上的菌液沖洗下來，混勻，6000rpm，
I.5min離心，取上清；用500ul LB (NaCl 35g/L，pHIO)將菌體重懸浮，稀釋10倍、100倍后，分別取原液、10—1倍液和10_2倍液各200ul均勻涂布于LB (NaCl 35g/L，pHIO，加氨芐抗生素)平板上，37°C培養24h。接合轉化完成后，選取獲得氯霉抗性且經PCR鑒定正確(弓丨物為6803-F和6803-R，得到2Kb的產物為正確轉化子)的轉化子，命名為重組菌LS21A。2、發酵重組菌LS21A產生烷烴將重組LS21A接種到實施例2制備的發酵培養基A (利用人工海水為介質)中，42°C、IOOrpm (旋轉半徑15mm)培養3天。取15mL培養物，離心10分鐘、lOOOOrpm，分別將上清液和菌體用甲醇進行萃取，其中菌體細胞團在甲醇中重懸，渦漩后超聲處理，破碎菌體后在進行萃取，以IOOOOrpm離心I分鐘后，收集上清液。將上清液轉移到新的GC樣品瓶并通過GC進行分析。色譜柱為HP-5毛細柱(柱長30m，內徑O. 25mm)。I μ I無分流進樣(入口溫度保持在300°C到GC/MS柱后，柱溫保持在100°C，持續3分鐘。以20°C /分鐘的速率將溫度升至320°C。柱溫保持在320°C柱溫5分鐘。運載氣體氦的流速是I. 5mL/分鐘。標準品為十一烷(CAS:1120-21-4),十三烷(CAS =629-50-5),十五烷(CAS 629-62-9)、十七烷(CAS :629-78-7)購自東京化學試劑公司(TCI TOKYO CHEMICALINDUSTRY Co. LTD)，內標為苯甲酸Benzoic Acid(購自國藥集團化學試劑北京有限公司；產品目錄號:30018760)；結果如圖4和圖6所示，圖4為含有表達來源于集胞藍細菌的酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21產生烷烴的GC圖譜；圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標準 品GC圖譜；在如上氣相色譜條件下，標準品中i^一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留時間分別為4. 660min、6. 895min、
9.065min、ll. 456min和13. 188min，樣品中十三烷、十五烷和十七烷的保留時間分別為6. 891min、9. 053min和11. 442min,可以看出，產物峰的保留時間和與標準品一致，說明重組LS21A產生了十三烷、十五烷和十七烷，且產生量為I. 48 μ 1/mL的十三烷、O. 87 μ 1/mL的十五燒和O. 66 μ 1/mL的十七燒。采用同樣的方法將重組LS21A接種到實施例2制備的發酵培養基B (利用天然海水為介質)中，結果也產生了十三烷、十五烷和十七烷，且產生的量與在發酵培養基A中發酵結果無顯著差異。二、利用LS21和念珠藍細菌相關基因制備產生烷烴的重組菌B通過導入念珠藍細菌(Nostocsp. ) PCC 7120 (記載在 Characterizationof phytochelatin synthase-1 ike protein encoded by alr0975from aprokaryote, Nostocsp. PCC7120, Naoki Tsuji et al. , Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 315卷,第3期,2004, P751-755,公眾可從清華大學獲得)。菌株編碼酰基酰基載體蛋白還原酶(acyl - acyl carrier protein reductase)和乙醒脫羧酶(aldehyde decarbonylase)的基因在LS21中異源產生烷烴。念珠藍細菌PCC7210的酰基酰基載體蛋白還原酶(alr5283;NP 489323. I，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列4自5’末端第938-1958位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列5 ;念珠藍細菌PCC7210乙醛脫羧酶(alr5284;NP-489324)，其編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列4自5’末端第1-696位核苷酸，其氨基酸序列為序列表中的序列6。I、構建重組菌LS21B以提取的念珠藍細菌PCC7210總DNA為模板，分別使用引物7120-F (cgTCTAgagttagatcgccaagcacttgttt,酶切位點為 XbaI)與引物 7120_R(ccccGGATCCagttagggattaggtattgggtatt，酶切位點為BamH I )擴增，得到約2kb的PCR產物，經過測序，該PCR產物為含有酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的片段，具有序列表中序列4所示的核苷酸，其中序列表中序列4自5’末端第938位-1958位核苷酸為酰基酰基載體蛋白還原酶編碼基因，序列4自5’末端第I位-696位核苷酸為乙醛脫羧酶編碼基因。PCR擴增結束后，使用溶液回收純化的方法，純化PCR產物。將純化PCR產物經XbaI和BamH I酶切后，與經過同樣酶切的載體pBBRlMCSl連接，得到重組質粒命名為pBBRlMCSl-B，經過測序，該重組質粒為將序列表中序列4插入pBBRlMCSl的XbaI和BamH I酶切位點間得到的載體。將重組質粒pBBRlMCSl-B轉化到大腸桿菌S17-1感受態細胞中，在含有25 μ g/mL氯霉素的LB平板上篩選得到陽性克隆。提取陽性克隆的質粒，為pBBRlMCSl-B，將含有該質粒的陽性克隆命名為S17-l/pBBRlMCSl-B。挑取S17-l/pBBRlMCSl-B菌落，在液體Lb培養基中培養至對數期，將S17-1/pBBRlMCSl-B和野生型鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21 (實施例I得到)共培養，進行接合轉化，得到重組菌LS21B，方法同上。接合轉化完成后，選取獲得氯霉抗性且經PCR鑒定正確 (引物為7120-F和7120-R，得到2Kb的產物為正確轉化子)的轉化子，為重組LS21B。2、發酵重組菌LS21B產生烷烴將重組LS21B接種到實施例2制備的發酵培養基A (利用人工海水為介質)中，42°C、IOOrpm (旋轉半徑15mm)培養3天。取15mL培養物，離心10分鐘、lOOOOrpm，分別將上清和菌體用甲醇進行萃取，其中菌體細胞團在甲醇中重懸，渦漩后超聲處理，破碎菌體后在進行萃取，以IOOOOrpm離心I分鐘后。將上清液轉移到新的GC樣品瓶并通過GC進行分析。色譜柱為HP-5毛細柱(柱長30m，內徑0. 25mm)。I μ I無分流進樣(入口溫度保持在300°C到GC/MS柱后，柱溫保持在100°C，持續3分鐘。以20°C /分鐘的速率將溫度升至300°C。柱溫保持在300°C柱溫5分鐘。運載氣體氦的流速是I. 5mL/分鐘。產物峰的保留時間和與標準品進行比較以確認
一致性。標準品為十一烷(CAS:1120-21-4),十三烷(CAS =629-50-5),十五烷(CAS 629-62-9)、十七烷(CAS :629-78-7)購自東京化學試劑公司(TCI TOKYO CHEMICALINDUSTRY Co. LTD)，內標為苯甲酸Benzoic Acid(購自國藥集團化學試劑北京有限公司；產品目錄號:30018760)；結果如圖5-圖7所示，圖5為含有表達來源于念珠藍細菌的酰基酰基載體蛋白還原酶和乙醛脫羧酶的重組LS21B產生烷烴的GC圖譜；圖6為C11、C13、C15、C17烷烴標準品GC圖譜；圖7為重組LS21B產生烷烴和烷烴標準品的復合比較的GC圖譜；在如上氣相色譜條件下，標準品中i^一烷、十三烷、十五烷、十七烷的保留時間分別為 4. 660min、6. 895min、9. 065min、11. 456min 和 13. 188min ;樣品中十三烷、十五烷和十七烷的保留時間分別為6. 884min、9. 042min和11. 436min ;可以看出，產物峰的保留時間和與標準品一致，說明重組LS21B產生了十三烷、十五烷和十七烷，且產生量為I. 72 μ 1/mL的十三烷、0. 92 μ 1/mL的十五烷和0. 73 μ 1/mL的十七烷。采用同樣的方法將重組LS21A接種到實施例2制備的發酵培養基B (利用天然海水為介質)中，結果也產生了十三烷、十五烷和十七烷，且產生的量與在發酵培養基A中發酵結果無顯著差異。
權利要求
1.鹽單胞菌(Halomonassp. ) LS 21，其保藏編號為 CGMCC No. 6593。
2.權利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonassp. )LS 21在制備聚輕基脂肪酸酯/3-輕基丁酸和/或脂肪酸中的應用；所述脂肪酸具體為C16脂肪酸。
3.—種重組菌，為將酰基酰基載體蛋白還原酶編碼基因和乙醛脫羧酶編碼基因均導入宿主菌中，得到重組菌。
4.根據權利要求3所述的重組菌，其特征在于所述宿主菌為鹽單胞菌(Halomonassp.);所述鹽單胞菌(Halomonas sp.)具體為權利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS 21 ； 所述酰基酰基載體蛋白還原酶和所述乙醛脫羧酶具體均來自藍細菌； 所述藍細菌進一步具體為集胞藍細菌(Synechocystis sp.)或念珠藍細菌(Nostocsp.)。
5.權利要求3或4所述的重組菌在制備烷烴中的應用；所述烷烴具體為十三烷、十五燒和/或十七燒。
6.一種發酵培養基，由C源、N源和海水組成； 所述C源為秸桿纖維素浸提液、油酸、動物脂肪和可溶性淀粉中的至少一種； 所述N源為大豆蛋白和乳清蛋白中的至少一種； 所述海水為天然海水或人工海水； 所述秸桿纖維素浸泡液按照如下方法制備將秸桿在NaOH水溶液浸泡，收集液體即為稻桿纖維素浸泡液。
7.根據權利要求6所述的發酵培養基，其特征在于 所述發酵培養基由所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白、所述乳清蛋白和所述海水組成； 所述秸桿纖維素浸提液、所述油酸、所述動物脂肪、所述可溶性淀粉、所述大豆蛋白和所述乳清蛋白的配比為 150-400ml 5-20ml :3_10g :5_20g :l_4g 2g ； 所述動物脂肪具體為家禽脂肪；所述家禽脂肪進一步具體為豬肉脂肪； 所述發酵培養基的PH值為5. 0-11. O,具體為5. O或9. O或11. O ; 所述天然海水中NaCl的終濃度為20g/L至50g/L。
8.一種制備聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸的方法，為發酵權利要求I所述的鹽單胞菌(Halomonas sp. )LS 21，即得到聚羥基脂肪酸酯/3-羥基丁酸和/或脂肪酸；所述脂肪酸具體為C16脂肪酸。
9.一種制備烷烴的方法，包括如下步驟發酵權利要求3或4所述的重組菌，即得到烷烴； 所述烷烴具體為十三烷、十五烷和/或十七烷。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于 所述發酵采用的培養基為權利要求6或7所述的發酵培養基； 所述發酵的溫度為20°C _45°C，所述發酵的溫度具體為20°C或42°C或45°C ； 所述發酵的轉速為IOOrpm (旋轉半徑15mm)； 所述發酵時間為24至96小時。
全文摘要
本發明公開了一種以海水為介質生產燃料用碳氫化合物的方法及專用菌株。該菌株為鹽單胞菌(Halomonas sp.)LS21，其保藏編號為CGMCC No.6593。本發明的實驗表明，Halomonas sp.LS21及其基因重組菌株可以在以天然海水為發酵介質，利用多種廉價碳、氮源-包括經預處理的纖維素、半纖維素、廢棄油脂及餐廚垃圾等為底物，生產以主要組成為烷烴、烯烴及長鏈脂肪酸的碳氫化合物。此類碳氫化合物經分離后可作為生物燃料使用；且發酵過程可以實現不滅菌連續發酵。本發明中的鹽單胞菌及其重組菌株營養要求簡單、發酵過程無需滅菌且可連續進行，簡單易控、低成本、具有良好的工業應用前景。
文檔編號C12P7/62GK102925382SQ20121036962
公開日2013年2月13日 申請日期2012年9月27日 優先權日2012年9月27日
發明者陳國強, 岳海濤, 尹進 申請人:清華大學