專利名稱：氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒、篩選鑒定及菌樣分離方法
技術領域：
本發明屬于ー種細菌篩選鑒定方法及試劑盒，特別涉及ー種氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒、篩選鑒定及菌樣分離方法。
背景技術：
氨氮是引起水體污染的重要物質之一。目前城市污水中含有大量的氨氮，若直接排放到自然環境中會造成嚴重的環境污染，導致河流、湖泊的富營養化，使水體自浄能力減弱。生物脫氮是目前廢水脫氮中最經濟有效的方法之一，而氨氮的轉化依賴于硝化微生物的作用。污水生物脫氮包括硝化階段和反硝化階段。其中硝化階段包括兩個階段(I)將NH4+-N 氧化為 N02__N 的氨氧化菌(Ammonia oxidizing bacteria, AOB) ; (2)將 N02__N 氧化為N03_-N的亞硝酸鹽氧化菌(Nitrite oxidizing bacteria, NOB)。經過硝化過程形成的 硝酸鹽通過反硝化作用形成氮氣逸出水體完成脫氮。在硝化階段中，由氨氮氧化為亞硝氮的氨氧化過程是整個反應的限速步驟，因此加速氨氧化菌的富集、快速生長是目前急需解決的問題。目前有大量針對氨氧化細菌的篩選、分離培養的研究。專利CN1884480A描述了ー種用牛肉膏培養基進行富集，然后從牛肉膏蛋白胨固體培養基上挑取單菌落，接種到氨氧化培養基獲得氨氧化細菌。專利CN 101434905A描述了ー種通過逐步提高氨氮負荷的方法培養能耐受高濃度氨氮負荷的活性污泥，再從活性污泥中分離篩選單菌。專利CN102268386A描述了ー種將污泥進行富集后用硅膠平板進行涂布，挑取單菌落在含甲酚紅的平板上劃線分純得到氨氧化細菌。目前各種篩選氨氧化細菌的方法均取得了不錯的結果，但是對于氨氧化細菌的篩選鑒定一般均采用人工培養基進行間接驗證，沒有在污水環境下進行驗證或將結果與污水環境進行擬合對比。并且采用傳統的驗證方法存在工作量大、效率低的問題。

發明內容
本發明的目的在于克服上述的缺陷，提供一種氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒、篩選鑒定方法及菌樣分離方法；該方法是通過實驗設計了一系列人工氨氧化鑒定培養基對微生物進行氨氧化能力鑒定，并且經過與微生物在市政污水、醫療污水中的氨氧化結果進行對比擬合，最終設計出了 3組人工氨氧化鑒定培養基對微生物進行氨氧化效果鑒定，其結果可以百分之百覆蓋、模擬微生物在污水環境下的氨氧化效果；該試劑盒是將篩選出的人工鑒定培養基制備成無菌預制管，并結合菌株富集管、氨氧化鑒定管、菌株保藏液，顯色劑的一種可以高通量、操作簡單、快速的一站式氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒。本發明的目的是通過以下技術方案實現的一種氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒，其特征在于它是由菌株富集管、氨氧化鑒定管1-3、菌株保藏液、顯色劑A和顯色劑B組成；其中菌株富集管
菌株富集管中裝有富集培養基，每升富集培養基所含成分如下硫酸銨250-780mg,葡萄糖0. 8-2. lg，磷酸ニ氫鉀480-890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg,氯化|丐5-5011^,碳酸氫鈉20-120mg,微量元素母液A Iml,微量元素母液B Iml,以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ；富集培養基配制完成并調完pH后，將富集培養基分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入富集培養基0. 8ml，分裝完畢后，115°C滅菌20-30min ；氨氧化鑒定管I :氨氧化鑒定管I中裝有氨氧化鑒定培養基(1)，每升氨氧化鑒定培養基(I)所含成分如下硫酸銨250-780mg,葡萄糖0. 1-1. 2g,磷酸ニ氫鉀480_890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g，硫酸鎂100_200mg，氯化鈣5_50mg，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B Iml,以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(I)配制完成并調完PH后，將氨氧化鑒定培養基(I)分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每
支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(I) 0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌20-30min ；氨氧化鑒定管2:氨氧化鑒定管2中裝有氨氧化鑒定培養基(2)，每升氨氧化鑒定培養基(2)所含成分如下硫酸銨250-780mg，醋酸鈉0. 4-1. 2g，磷酸ニ氫鉀480_890mg，磷酸氫ニ鈉
0.7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg,氯化鈣5_50mg，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B Iml,以上氨氧化鑒定培養基(2)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(2)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(2)分裝到
1.8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(2)0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌20_30min ；氨氧化鑒定管3:氨氧化鑒定管3中裝有氨氧化鑒定培養基(3)，每升氨氧化鑒定培養基(3)所含成分如下硫酸銨250-780mg,葡萄糖0-50 mg ;醋酸鈉0-50 mg,磷酸ニ氫鉀480_890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg，碳酸鈣l_5g，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液Alml，微量元素母液B Iml,以上氨氧化鑒定培養基(3)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(3)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(3)分裝到
I.8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(3)0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌20_30min ；菌株保藏液菌株保藏液成分如下甘油30-50ml,去離子水50-70ml ；顯色劑A 顯色劑A成分如下對氨基苯磺酸0. 5-0. 8g, 15%醋酸溶液IOOml ；顯色劑B:顯色劑B成分如下a -萘胺0. 1-0. 3g，15%醋酸溶液IOOml ；其中姆升微量元素母液A所含成分如下硫酸亞鐵5g, EDTA ニ鈉5g ；其中每升微量元素母液B所含成分如下EDTA ニ鈉I. 5g，ZnSO4. 7H20 430mg,CoCl2. 6H20 240mg，MnCl2 629mg，CuSO4. 5H20 250mg，Na2MoO4. 2H20 220mg，NiCl2. 6H20 190mg, H3BO3 14mg。ー種采用氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒進行氨氧化細菌篩選鑒定方法，其特征在于按如下的步驟進行步驟I :待測菌樣的準備待測菌樣是(a)經過分離的污水、污泥中的菌株；(b)未分離純化的污水、污泥中的菌群；步驟2 將步驟I準備的待測菌樣用接種環或移液器接種至菌株富集管中，菌株富集管中裝有富集培養基，將菌株富集管蓋擰緊，培養條件選擇30-35°C溫度下靜止12-16小時培養，或將菌株富集管平放入搖床30-35°C、150-200rpm震蕩12-16小時培養；步驟3 將步驟2富集的菌株分別接種至氨氧化鑒定管I、氨氧化鑒定管2、氨氧化鑒定管3中，接種量為10-60ul ;將氨氧化鑒定管平放入搖床，在30-35°C、150-200rpm條件下震蕩培養 24-48h ；步驟4 接種完畢后向菌株富集管殘留的菌液中加入0.8ml菌株保藏液，震蕩混勻，放入-20°C冰箱保存；步驟5 步驟3的氨氧化鑒定管經培養24_48h后，分別向氨氧化鑒定管I、氨氧化鑒定管2、氨氧化鑒定管3中滴加顯色劑A 2-3滴，充分震蕩，再分別加入顯色劑B，2-3滴，充分震蕩，靜置20min后觀察顏色變化；顏色變成粉紅色或紫紅色為氨氧化陽性，用“ + ”表示，顏色無變化為氨氧化陰性，用“一”表示；步驟6 :將步驟5的結果進行記錄，顯色結果按表I進行比對，得出菌株性能結果。表I :氨氧化鑒定結果分析表
分析結果氨氧化鑒定管I 氨氧化鑒定管2 氨氧化鑒定菅3
無氨氧化功能一__=__- 具有異養氨氧化-=----=- ~~ + 一-—" 具有自養氣氧化_+__~__+_
功能-__+__+
I + ] + r + ー種采用氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒進行氨氧化細菌篩選鑒定方法，其特征在于所說的待測菌樣的分離方法按如下的步驟進行步驟I :氨氧化細菌菌樣采集培養包括自養氨氧化細菌菌樣采集培養和異養氨氧化細菌菌樣采集培養；(I)、自養氨氧化細菌菌樣采集培養將未分離純化的污水、污泥中的菌群樣品與等體積自養氨氧化細菌菌樣培養液混合，放入搖床震蕩培養，溫度20-30°C，轉速150-200rpm,震蕩培養5-7天；(2)、異養氨氧化細菌菌樣米集培養將未分離純化的污水、污泥中的菌群樣品與等體積異養氨氧化細菌菌樣培養液混合，放入搖床震蕩培養，溫度20_30°C，轉速150-200rpm，震蕩培養1-3天；
步驟2 培養菌液稀釋涂布分離將經步驟1(1)自養氨氧化細菌菌樣采集培養的菌液進行梯度稀釋至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接種到自養氨氧化細菌固體分離培養基上進行平板涂布分離，20-30°C培養 5-10 天；將經步驟I (2)異養氨氧化細菌菌樣采集培養的菌液進行梯度稀釋至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接種到異養氨氧化細菌固體分離培養基上進行平板涂布分離，20-30°C培養 2-3 天。所說的自養氨氧化細菌菌樣培養液是每升自養氨氧化細菌菌樣培養液所含成分為硫酸銨400-1200mg，磷酸ニ氫鉀480-890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g，碳酸鈣l_10g，碳酸氫鈉50_200mg，硫酸鎂100_200mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 7.00-8.50。所說的異養氨氧化細菌菌樣培養液是每升異養氨氧化細菌菌樣培養液所含成分為硫酸銨400-1200mg，葡萄糖
0.5-3. Og,磷酸ニ氫鉀480_890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g,氯化I丐40_120mg,碳酸氫鈉50-200mg，硫酸鎂100-200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B lml, pH 7. 00-8. 50 所說的自養氨氧化細菌固體分離培養基是每升自養氨氧化細菌固體分離培養基所含成分為硫酸銨400_1200mg，磷酸ニ氫鉀480-890mg，磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g，氯化鈣40_120mg，碳酸氫鈉50_200mg，硫酸鎂200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，瓊脂I. 2%_2. 0%, pH 7. 00-8. 50。所說的異養氨氧化細菌固體分離培養基是每升異養氨氧化細菌固體分離培養基所含成分為硫酸銨400-1200mg，葡萄糖0. 5-3. Og,磷酸ニ氫鉀480_890mg,磷酸氫ニ鈉0. 7-1. 5g,氯化I丐40_120mg,碳酸氫鈉50-200mg,硫酸鎂200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，瓊脂I. 2%-2. 0%，pH7. OO-8. 50 o本發明公開的氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒與現有技術相比所具有的優點和有益效果在于具體的說是達到氨氧化細菌快速、高通量篩選鑒定的效果，實現菌種培養、鑒定、保藏ー站式操作；尤其對污水、活性污泥、養殖水、自然水體、土壤中自養及異樣氨氧化細菌的篩選有很好的針對性和效果。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進ー步闡述本發明。應理解這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。需要說明的是操作前應確保操作環境及相關器具已滅菌。本發明所說的原料如無特殊說明均為市售產品。實施例I :自養氨氧化細菌分離、篩選鑒定從活性污泥中篩選自養氨氧化細菌，樣品采自天津市海河醫院曝氣池中的活性污泥，并且采集市政污水作為試劑盒效果對比樣品。
步驟I :自養氨氧化細菌菌樣采集培養將樣品活性污泥與等體積自養氨氧化細菌菌樣培養液混合，放入搖床震蕩培養，溫度27°C，轉速180rpm，震蕩培養7天；每升自養氨氧化細菌菌樣培養液所含成分為硫酸銨578mg，磷酸ニ氫鉀730mg，磷酸氫ニ鈉I. 10g，碳酸I丐5g,碳酸氫鈉60mg,硫酸鎂200mg,微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 8. 00 ；步驟2 :培養菌液稀釋涂布分離將經步驟I自氧氨氧化培養的菌液進行梯度稀釋至lO'lO'lO'lO—7倍，各取SOul接種到自養氨氧化細菌固體分離培養基上進行平板涂布分離，25°C培養7天；每升自養氨氧化細菌固體分離培養基所含成分為硫酸銨578mg，磷酸ニ氫鉀730mg,磷酸氫ニ鈉I. IOg,氯化I丐50mg,碳酸氫鈉60mg,硫酸鎂200mg,微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，瓊脂2. 0%，pH 8. 00 ；步驟3 :菌株氨氧化能力篩選鑒定a.選取經步驟2平板涂布分離的菌落數在1-300左右的平板，將平板上的單菌落進行標記，共標記237個單菌落，用接種環將單菌落接種到試劑盒中的菌株富集管中，菌株富集管中裝有富集培養基，將菌株富集管蓋擰緊，平放入搖床30°C、170rpm震蕩12-16小時培養；其中每升富集培養基所含成分如下硫酸銨580mg，葡萄糖2. Og,磷酸ニ氫鉀680mg，磷酸氫ニ鈉I. 0g，硫酸鎂150mg,氯化韓30mg,碳酸氫鈉80mg,微量元素母液A lml,微量元素母液B lml,以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 50 ;富集培養基配制完成并調完PH后，將富集培養基分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入富集培養基0. 8ml，分裝完畢后，115°C滅菌20-30min ；b.將步驟a富集的菌液分別接種至氨氧化鑒定管I、氨氧化鑒定管2、氨氧化鑒定管3中，接種量為20ul，氨氧化鑒定管1、2、3中分別裝有氨氧化鑒定培養基1、2、3 ;將氨氧化鑒定管平放入搖床，在30°C、170rpm條件下震蕩培養48h ;其中氨氧化鑒定管I中裝有氨氧化鑒定培養基(I )，每升氨氧化鑒定培養基(I)所含成分如下硫酸銨780mg,葡萄糖0. Ig,磷酸ニ氫鉀480mg,磷酸氫ニ鈉0. 7g,硫酸鎂IOOmg,氯化I丐5mg,碳酸氫鈉20mg,微量兀素母液A lml,微量兀素母液B lml,以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00 ;氨氧化鑒定培養基(I)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(I)分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(I )0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌25min ；氨氧化鑒定管2中裝有氨氧化鑒定培養基(2)，每升氨氧化鑒定培養基(2)所含成分如下硫酸銨780mg,醋酸鈉0. 4g,磷酸ニ氫鉀480mg,磷酸氫ニ鈉0. 7g,硫酸鎂IOOmg,氯化鈣5mg，碳酸氫鈉20mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上氨氧化鑒定培養基(2)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00 ;氨氧化鑒定培養基(2)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(2)分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(2) 0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌25min ；氨氧化鑒定管3中裝有氨氧化鑒定培養基(3)，每升氨氧化鑒定培養基(3)所含成分如下硫酸銨780mg,磷酸ニ氫鉀480mg,磷酸氫ニ鈉0. 7g,硫酸鎂IOOmg,碳酸I丐2g,碳酸氫鈉20mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上氨氧化鑒定培養基(3)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00 ;氨氧化鑒定培養基(3)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(3)分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(3)0. 8ml,分裝完畢后115°C滅菌25min ；c.將市政污水作為試劑盒效果對比樣品市政污水COD為152 mg/L,氨氮為25. 3 mg/L,分裝至2ml凍存管中，分裝量0. 8ml/g管，115°C滅菌25min ;將步驟a富集的菌液接種至市政污水中，接種量為20ul，將凍存管平放入搖床，在30°C、170rpm條件下震蕩培養48h ；d.接種完畢后，向步驟a囷株g集管中剩余的囷液加入0. 8ml囷株保減液，震湯混勻，放入_20°C冰箱保存；e.氨氧化鑒定管及污水對照分別向經步驟b和c培養48h后的氨氧化鑒定管I、2、3和市政污水管中滴加顯色劑A 2-3滴，充分震蕩，再分別加入顯色劑B 2-3滴，充分震蕩，靜置20min后觀察顏色變化；顏色變成粉紅色或紫紅色為氨氧化陽性，用“ + ”表示，顔色無變化為氨氧化陰性，用“一”表示；f.結果分析經過顯色反應，237株單菌落中共有38株產生陽性反應，陽性結果見表2 :表2 :海河醫院自養氨氧化細菌陽性結果表~氨氧化鑒污 ~氨氧化鑒污 —定_管—水—定_管—水
I"I 2「3 I I I 2 T 3 I
權利要求
1. 一種氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒，其特征在于它是由菌株富集管、氨氧化鑒定管1-3、菌株保藏液、顯色劑A和顯色劑B組成；其中 菌株富集管 菌株富集管中裝有富集培養基，每升富集培養基所含成分如下硫酸銨250-780mg，葡萄糖O. 8-2. Ig,磷酸ニ氫鉀480-890mg，磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，硫酸鎂100_200mg，氯化鈣5-50mg，碳酸氫鈉20-120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ； 富集培養基配制完成并調完PH后，將富集培養基分裝到I. 8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入富集培養基O. 8ml，分裝完畢后，115°C滅菌20_30min ； 氨氧化鑒定管I : 氨氧化鑒定管I中裝有氨氧化鑒定培養基(I )，每升氨氧化鑒定培養基(I)所含成分如下硫酸銨250-780mg，葡萄糖O. 1-1. 2g，磷酸ニ氫鉀480_890mg，磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg，氯化鈣5-50mg，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液BIml,以上培養基用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(I)配制完成并調完PH后，將氨氧化鑒定培養基(I)分裝到1.8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(I) O. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌20_30min ； 氨氧化鑒定管2 氨氧化鑒定管2中裝有氨氧化鑒定培養基(2)，每升氨氧化鑒定培養基(2)所含成分如下硫酸銨250-780mg，醋酸鈉O. 4-1. 2g，磷酸ニ氫鉀480_890mg，磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg，氯化鈣5-50mg，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液BIml,以上氨氧化鑒定培養基(2)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至7. 00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(2)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(2)分裝到1.8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(2) O. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌20_30min ； 氨氧化鑒定管3 氨氧化鑒定管3中裝有氨氧化鑒定培養基(3)，每升氨氧化鑒定培養基(3)所含成分如下硫酸銨250-780mg,葡萄糖0-50 mg,醋酸鈉0-50 mg,磷酸ニ氫鉀480_890mg,磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，硫酸鎂100-200mg，碳酸鈣l_5g，碳酸氫鈉20_120mg，微量元素母液Alml，微量元素母液B Iml,以上氨氧化鑒定培養基(3)用濃度5%的碳酸鈉和HCl調pH至,7.00-8. 50 ;氨氧化鑒定培養基(3)配制完成并調完pH后，將氨氧化鑒定培養基(3)分裝到I.8ml螺ロ凍存管中，每支凍存管加入氨氧化鑒定培養基(3)0. 8ml，分裝完畢后115°C滅菌,20_30min ； 菌株保藏液 菌株保藏液成分如下甘油30-50ml,去離子水50-70ml ； 顯色劑A 顯色劑A成分如下對氨基苯磺酸O. 5-0. 8g, 15%醋酸溶液IOOml ； 顯色劑B 顯色劑B成分如下:α -萘胺O. 1-0. 3g，15%醋酸溶液IOOml ； 其中 每升微量元素母液A所含成分如下硫酸亞鐵5g，EDTA ニ鈉5g ；其中 每升微量元素母液B所含成分如下=EDTA ニ鈉I. 5g，ZnSO4. 7H20 430mg, CoCl2. 6H20240mg，MnCl2 629mg，CuSO4. 5H20 250mg，Na2MoO4. 2H20 220mg，NiCl2. 6H20 190 mg, H3BO314mg。
2.ー種采用權利要求I所述的氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒進行氨氧化細菌篩選鑒定方法，其特征在于按如下的步驟進行 步驟I :待測菌樣的準備 待測菌樣是 Ca)經過分離的污水、污泥中的菌株； (b)未分離純化的污水、污泥中的菌群； 步驟2 將步驟I準備的待測菌樣用接種環或移液器接種至菌株富集管中，菌株富集管中裝有富集培養基，將菌株富集管蓋擰緊，培養條件選擇30-35°C溫度下靜止12-16小時培養，或將菌株富集管平放入搖床30-35°C、150-200rpm震蕩12-16小時培養； 步驟3 將步驟2富集的菌株分別接種至氨氧化鑒定管I、氨氧化鑒定管2、氨氧化鑒定管3中，接種量為10-60ul ;將氨氧化鑒定管平放入搖床，在30-35°C、150-200rpm條件下震蕩培養24-48h ； 步驟4 : 接種完畢后向菌株富集管殘留的菌液中加入O. 8ml菌株保藏液，震蕩混勻，放入_20°C冰箱保存； 步驟5 步驟3的氨氧化鑒定管經培養24-48h后，分別向氨氧化鑒定管I、氨氧化鑒定管2、氨氧化鑒定管3中滴加顯色劑A 2-3滴，充分震蕩，再分別加入顯色劑B，2-3滴，充分震蕩，靜置20min后觀察顏色變化；顏色變成粉紅色或紫紅色為氨氧化陽性，用“ + ”表示，顔色無變化為氨氧化陰性，用“一”表示； 步驟6 :將步驟5的結果進行記錄，顯色結果按表I進行比對，得出菌株性能結果。
表I :氨氧化鑒定結果分析表
3.ー種采用權利要求2所述氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒進行氨氧化細菌篩選鑒定方法，其特征在于所說的待測菌樣的分離方法按如下的步驟進行 步驟I : 氨氧化細菌菌樣采集培養包括自養氨氧化細菌菌樣采集培養和異養氨氧化細菌菌樣采集培養； (1)、自養氨氧化細菌菌樣采集培養將未分離純化的污水、污泥中的菌群樣品與等體積自養氨氧化細菌菌樣培養液混合，放入搖床震蕩培養，溫度20-30°C，轉速150-200rpm，震蕩培養5-7天； (2)、異養氨氧化細菌菌樣采集培養將未分離純化的污水、污泥中的菌群樣品與等體積異養氨氧化細菌菌樣培養液混合，放入搖床震蕩培養，溫度20-30°C，轉速150-200rpm，震蕩培養1-3天； 步驟2 培養菌液稀釋涂布分離 將經步驟I (I)自養氨氧化細菌菌樣采集培養的菌液進行梯度稀釋至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接種到自養氨氧化細菌固體分離培養基上進行平板涂布分離，20-30°C培養5-10天； 將經步驟I (2)異養氨氧化細菌菌樣采集培養的菌液進行梯度稀釋至10_4、10_5、10_6、10_7倍，各取SOul接種到異養氨氧化細菌固體分離培養基上進行平板涂布分離，20-30°C培養2-3天。
4.如權利要求3所述的菌樣分離方法，其特征在于所說的自養氨氧化細菌菌樣培養液是 每升自養氨氧化細菌菌樣培養液所含成分為硫酸銨400-1200mg，磷酸ニ氫鉀480-890mg,磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，碳酸鈣l_10g，碳酸氫鈉50_200mg，硫酸鎂100_200mg，微量元素母液A Iml,微量元素母液B lml, pH 7.00-8.50。
5.如權利要求3所述的菌樣分離方法，其特征在于所說的異養氨氧化細菌菌樣培養液是 每升異養氨氧化細菌菌樣培養液所含成分為硫酸銨400-1200mg，葡萄糖O. 5-3. 0g，磷酸ニ氫鉀480-890mg，磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，氯化鈣40_120mg，碳酸氫鈉50_200mg，硫酸鎂100-200mg，微量元素母液A lml，微量元素母液B lml, pH 7. 00-8. 50
6.如權利要求3所述的菌樣分離方法，其特征在于所說的自養氨氧化細菌固體分離培養基是 每升自養氨氧化細菌固體分離培養基所含成分為硫酸銨400-1200mg，磷酸ニ氫鉀480-890mg，磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g，氯化鈣40_120mg，碳酸氫鈉50_200mg，硫酸鎂200mg，微量元素母液 A 1ml，微量元素母液 B 1πι1，·—1·2%-2·0%，ρΗ 7. 00-8. 50
7.如權利要求3所述的菌樣分離方法，其特征在于所說的異養氨氧化細菌固體分離培養基是 每升異養氨氧化細菌固體分離培養基所含成分為硫酸銨400-1200mg，葡萄糖O.5-3. Og,磷酸ニ氫鉀480-890mg,磷酸氫ニ鈉O. 7-1. 5g,氯化·丐40_120mg,碳酸氫鈉50-200mg,硫酸鎂200mg，微量元素母液A 1ml，微量元素母液B 1ml，瓊脂L 2%-2. 0%，pH.7.00-8.50。
全文摘要
一種氨氧化細菌篩選鑒定試劑盒、篩選鑒定及菌樣分離方法，試劑盒包括菌株富集管；氨氧化鑒定管1、2、3；菌株保藏液；顯色劑A、B；篩選鑒定方法是將待檢測菌種經菌株富集管富集后接種到氨氧化鑒定管1、2、3培養，同時用菌株保藏液將富集菌液保存；氨氧化鑒定管經培養后加入顯色劑A、B，根據顯色狀態判斷菌株氨氧化能力，菌樣分離方法是將培養菌樣稀釋涂布分離。本發明的優點是實現氨氧化細菌快速、高通量篩選鑒定的效果，實現菌種培養、鑒定、保藏一站式操作。
文檔編號C12Q1/04GK102864075SQ20121038136
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月10日 優先權日2012年10月10日
發明者李博智, 武震, 宋文軍, 魏紀平, 朱高雄 申請人:天津市興源環境技術工程有限公司, 天津清鑒生物科技有限公司